用于檢測(cè)和測(cè)定松脂醇二葡萄糖苷的抗體、方法和試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供包括松脂醇二葡萄糖苷或其衍生物的半抗原，與賦予抗原性的載體物質(zhì)結(jié)合的前述半抗原的免疫原，與標(biāo)記試劑結(jié)合的前述半抗原的偶聯(lián)物(包被原)，以及抗前述免疫原的抗體，該抗體能與完整的松脂醇二葡萄糖苷中的至少一種結(jié)構(gòu)性抗原決定部位結(jié)合。本發(fā)明還提供用于檢測(cè)或定量樣品中松脂醇二葡萄糖苷的方法和試劑盒，以及前述偶聯(lián)物和前述抗體在檢測(cè)或定量松脂醇二葡萄糖苷中的用途。本發(fā)明對(duì)松脂醇二葡萄糖苷具有特異性，可用于樣品中檢測(cè)松脂醇二葡萄糖苷的存在和測(cè)定松脂醇二葡萄糖苷的含量。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
用于檢測(cè)和測(cè)定松脂醇二葡萄糖苷的抗體、方法和試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及小分子半抗原的抗體及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及松脂醇二葡萄 糖苷及其衍生物的抗體及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和定量松脂醇二葡萄糖苷的方法和試劑盒，以及其中使用的 半抗原、免疫原、偶聯(lián)物（conjugate)和抗體。
[0003] 其中"檢測(cè)"是指定性分析物質(zhì)是否存在。
[0004] 其中"測(cè)定"是指對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。
[0005] 松脂醇二葡萄糖苷，是存在于杜仲皮中的苷類(lèi)成分，杜仲降血壓的主要有效成分。
[0006] 分子式：C32H42016 分子量：682. 67
[0007] 松脂醇二葡萄糖苷屬于木質(zhì)素類(lèi)化合物，熔點(diǎn)221-223?，沸點(diǎn)：917.3°C，溶于 水、乙醇及甲醇，不溶于氯仿、乙醚及石油醚。
[0008] 研究表明，松脂醇二葡萄糖苷是杜仲中有效降血壓成分，能較強(qiáng)的抑制cAMP磷酸 二酯酶的活性。
[0009] 目前建立了多種松脂醇二葡萄糖苷的定性與定量檢測(cè)和測(cè)定分析方法，如薄層層 析法、HPLC法，HPLC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色譜法。但含松脂醇二葡萄 糖苷的生物樣品（包括血漿、尿、唾液等）含有大量的影響含量測(cè)定的蛋白質(zhì)及內(nèi)源性物 質(zhì)；同時(shí)松脂醇二葡萄糖苷可能呈結(jié)合狀態(tài)，必須經(jīng)過(guò)處理，排除內(nèi)源性雜質(zhì)和代謝物的干 擾，使結(jié)合狀態(tài)的松脂醇二葡萄糖苷游離后才能測(cè)定；同時(shí)還需要濃縮以滿(mǎn)足儀器檢測(cè)靈 敏度的要求，處理程序復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；另外由于松脂醇二葡萄糖苷進(jìn)入體內(nèi)后，組織中的 分布是極其微量的，即使經(jīng)過(guò)富集，進(jìn)行含量測(cè)定仍是極其困難的。最后，對(duì)于松脂醇二葡 萄糖苷在靶器官和組織中分布，以及細(xì)胞和亞細(xì)胞定位的研究，需要通過(guò)免疫組織化學(xué)和 westblot等方法，但由于缺乏松脂醇二葡萄糖苷的抗體，阻礙了此方面的研究。因此，有必 要開(kāi)發(fā)出一種用于檢側(cè)和測(cè)定生物樣品中松脂醇二葡萄糖苷的方法，對(duì)闡明相關(guān)藥材或復(fù) 方的作用機(jī)理，以及其體內(nèi)分布和代謝研究，將具有特別的價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的半抗原松脂醇二葡萄糖苷可提供確定的結(jié)構(gòu)性抗原決定部位，但是它本 身并不具備免疫原性，因此必須要偶聯(lián)到適宜的賦予抗原性的載體物質(zhì)上，這樣所形成的 免疫原才會(huì)在注射到宿主動(dòng)物體內(nèi)后誘發(fā)免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供一種如下結(jié)構(gòu)的免 疫原：
[0011]
[0012] 其中R是0至6個(gè)碳的烷基橋（連接半抗原與載體物質(zhì)的橋），優(yōu)選R = 0,即PI 直接與松脂醇二葡萄糖苷氧化后的醛基結(jié)合，或R是C1-C6取代或未取代的、直鏈或支鏈 的、飽和或不飽和的亞烷基，更優(yōu)選R是C1-C4未取代的、直鏈的、飽和的亞烷基。
[0013] P1是賦予抗原性的載體物質(zhì)。載體物質(zhì)選自蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片合成的多肽或半 合成的多肽。其中蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段選自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目鏡蛋白和脂蛋白， 優(yōu)選為牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙種球蛋白、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、鎖眼形血藍(lán)蛋白 (keyhole limpet haemocyanin，KLH)，更優(yōu)選自鎖眼形血藍(lán)蛋白或牛血清蛋白（BSA)。合 成多肽或半合成多肽是具有足夠數(shù)量的可利用氨基的合成聚氨基酸，優(yōu)選多聚賴(lài)氨酸。合 成或天然聚合物是帶有反應(yīng)官能基的聚合物材料，特別是能夠結(jié)合到半抗原產(chǎn)生免疫原的 碳水化合物、酵母或多糖。
[0014] 半抗原的制備本發(fā)明描述了半抗原松脂醇二葡萄糖苷的糖苷結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)鄰 羥基經(jīng)過(guò)過(guò)碘酸鈉氧化為醛基從而與載體物質(zhì)發(fā)生的偶聯(lián)作用，產(chǎn)生免疫原。偶聯(lián)物成功 制備并純化后分別經(jīng)質(zhì)譜（MS)和核磁共振氫譜和碳譜GH-NMR和 I3c-NMR)確證。
[0015] 免疫原的合成本發(fā)明的半抗原和蛋白質(zhì)載體的連接可使用本領(lǐng)域己知的任何 連接方式。例如過(guò)碘酸鹽氧化法等。采用過(guò)碘酸氧化法制備免疫原時(shí)，是將10毫克的半抗 原松脂醇二葡萄糖苷溶解在10mL熱水中，加入含有8毫克的過(guò)碘酸鈉溶液0. 5毫升，室溫 下反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，離心，取上清液加入到10_20mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，攪 拌反應(yīng)6小時(shí)，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0.0 lmol/L的PBS緩沖溶液透析3-5d，分裝保 存于-20°C的冰箱中。
[0016] 合成免疫原的分析方法為了確認(rèn)載體物質(zhì)上結(jié)合有適當(dāng)?shù)陌肟乖?，在免疫前?使用紫外分光度法或矩陣輔助紫外激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS)對(duì)每個(gè) 免疫原進(jìn)行評(píng)估。松脂醇二葡萄糖苷免疫原反應(yīng)物和產(chǎn)物的吸收峰相比（200nm-400nm)， 可判斷是否偶合，并根據(jù)反應(yīng)物和產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)計(jì)算偶聯(lián)物與半抗原的比例。
[0017] 使用voyager STR生物分光度測(cè)量方法研究站激光解析質(zhì)譜與延遲萃取結(jié)合進(jìn)行 MALDI-T0F質(zhì)譜。將每個(gè)要分析的等分試樣在0. 1%的三氟乙酸水溶液中稀釋制成lmg/mL 的試樣溶液。使用芥子酸基質(zhì)和牛血清白蛋白作為外標(biāo)分析等分試樣（1 μ L)。
[0018] 對(duì)于優(yōu)選的載體物質(zhì)，牛血清白蛋白或KLH而言，優(yōu)選半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合比 為 6-15 : 1。
[0019] 第二方面，免疫檢測(cè)時(shí)需要將松脂醇二葡萄糖苷與標(biāo)記試劑進(jìn)行偶合。因此，本發(fā) 明提供一種如下結(jié)構(gòu)的偶合物；
[0020]
[0021 ] 其中R是0至6個(gè)碳的烷基，P2是可檢測(cè)的標(biāo)記試劑，標(biāo)記試劑選自酶、發(fā)光物質(zhì)、 放射性物質(zhì)或它們的混合物，更優(yōu)選地標(biāo)記試劑是過(guò)氧化物酶。最優(yōu)選地標(biāo)記試劑是辣根 過(guò)氧化物酶（HRP)。發(fā)光物質(zhì)選自生物發(fā)光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光物質(zhì)。
[0022] 偶合物的合成本發(fā)明的半抗原和蛋白質(zhì)載體的連接可使用本領(lǐng)域己知的任何連 接方式。例如過(guò)碘酸鹽氧化法等。采用過(guò)碘酸氧化法制備免疫原時(shí)，是將10毫克的半抗原 松脂醇二葡萄糖苷溶解在10mL熱水中，加入含有8毫克的過(guò)碘酸鈉溶液0. 5毫升，室溫下 反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，離心，取上清液加入到10-20mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌 反應(yīng)6小時(shí)，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0.0 lmol/L的PBS緩沖溶液透析3-5d，分裝保存 于-20°C的冰箱中。
[0023] 另一方面，本發(fā)明涉及對(duì)于本發(fā)明第一方面的免疫原產(chǎn)生的抗體，這些抗體能夠 至少與一個(gè)松脂醇二葡萄糖苷結(jié)構(gòu)上的表位結(jié)合，優(yōu)選與完整的松脂醇二葡萄糖苷結(jié)構(gòu)表 位相結(jié)合，該抗體是多克隆的，或是單克隆的，優(yōu)選為單克隆抗體，且具有對(duì)松脂醇二葡萄 糖苷的特異性的抗體。
[0024] 免疫檢測(cè)時(shí)要將該抗體固定在支撐底物上。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括將所述血 清抗體固定到支撐底物上，優(yōu)選固體支持物，最優(yōu)選聚苯乙烯固體支持物。
[0025] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備抗體的方法，該方法包含通過(guò)重復(fù)給予根據(jù)本發(fā)明的 松脂醇二葡萄糖苷的免疫原免疫動(dòng)物，優(yōu)選脊稚動(dòng)物，最優(yōu)選哺乳動(dòng)物，并收集從免疫動(dòng)物 得到的血清的步驟。
[0026] 另一方面，本發(fā)明包括在試樣中檢測(cè)或測(cè)定松脂醇二葡萄糖苷的方法，該方法包 括用本發(fā)明的偶合物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合物接觸試樣；檢測(cè)或測(cè)定結(jié)合的 綴合物的數(shù)量；并且從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)推斷試樣中松脂醇二葡萄糖苷的的存在或數(shù)量。
[0027] 另一方面，本發(fā)明還描述了如何將針對(duì)這種免疫原產(chǎn)生的抗體用于開(kāi)發(fā)可用來(lái)檢 測(cè)和測(cè)定松脂醇二葡萄糖苷的存在的通用分析方法和相應(yīng)的試劑盒。該試劑盒包括用本發(fā) 明的偶合物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合物，同時(shí)該試劑盒可以任意地包括應(yīng)用所 述綴合物和所述抗體在試樣中檢測(cè)或測(cè)定松脂醇二葡萄糖苷的指導(dǎo)。優(yōu)選地，試樣是溶液， 如生物流體。更優(yōu)選地，試樣是血清或尿。在本發(fā)明的方法和試劑盒中，首選各自不同的交 聯(lián)劑（免疫原的和偶合物的）。
[0028] 另一方面，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的偶合物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合 物在試驗(yàn)試樣如生物流體中檢測(cè)或測(cè)定松脂醇二葡萄糖苷。
[0029] 為了產(chǎn)生多克隆抗血清，將免疫原與Freund佐劑混合，并且將混合物注射入宿主 動(dòng)物體內(nèi)，如兔、羊、鼠、天竺鼠或馬。進(jìn)一步注射（加強(qiáng)）并取血清試樣評(píng)價(jià)抗體滴度。達(dá) 到最佳滴度時(shí)，隨后將宿主動(dòng)物放血得到適當(dāng)體積的特異性的抗血清。要求的抗體純化水 平視計(jì)劃的應(yīng)用而定。對(duì)于許多目的，根本不需要純化，但是，在其它情況下，例如抗體固定 在固體載體上，純化步驟能夠除去不想要的物質(zhì)和除去非特異性的結(jié)合。本發(fā)明特異性抗 體作為試劑在免疫試驗(yàn)中用于測(cè)定或檢測(cè)生物流體中的松脂醇二葡萄糖苷的含量是需要 純化的。
[0030] 單克隆抗體的制備本發(fā)明所述單克隆抗體是指獲自基本上同源的抗體群的抗 體，即組成該群體的抗體個(gè)體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。
[0031] 本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員己知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，本 發(fā)明完全抗原，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)單克隆抗體的產(chǎn)生。對(duì)于單克隆抗體，可利用雜交 瘤技術(shù)來(lái)制備或可用重組DNA法制備。骨髓瘤細(xì)胞可選鼠類(lèi)的骨髓瘤細(xì)胞系，包括衍生自 M0PC-21和MPC-11小鼠腫瘤的骨髓瘤細(xì)胞系以及SP-2、ΝΖ0或X63-Ag8-653細(xì)胞，以及人 骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系。
[0032] 對(duì)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)于其中的培養(yǎng)基進(jìn)行分析以檢測(cè)具有所需特異性的單克隆抗 體的產(chǎn)生，如通過(guò)體外結(jié)合分析，例如酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA)或放射免疫分析（RIA)。 表達(dá)抗體的細(xì)胞的位置可用FACS進(jìn)行檢測(cè)。然后，可將雜交瘤克隆通過(guò)有限稀釋步驟形成 亞克隆，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法生長(zhǎng)。為了達(dá)到這一目的而使用的適合的培養(yǎng)基包括，例如，DMEM 或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物體內(nèi)作為腹水瘤生長(zhǎng)。
[0033] 由亞克隆分泌的單克隆抗體從培養(yǎng)基、腹水或血清中，通過(guò)常規(guī)的免疫球蛋白純 化工藝適當(dāng)?shù)氐玫椒蛛x，這些純化工藝為蛋白A-瓊脂糖法（proteinA-Sepharose)、羥基磷 灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析等等。
[0034] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方案中，松脂醇二葡萄糖苷單克隆抗體采用Balb/C小鼠腹 水生產(chǎn)單克隆抗體的方法制備。將約10 6-107雜交瘤細(xì)胞接種到致敏的小鼠腹腔內(nèi)，2-4周 內(nèi)可見(jiàn)腹部明顯脹大。抽取腹水，經(jīng)飽和硫酸按沉淀法粗提出IgG，再將粗提的抗體經(jīng)親和 層析柱（Protein G-Sephrose)純化。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 實(shí)施例1
[0036] 10毫克的半抗原松脂醇二葡萄糖苷溶解在10mL熱水中，加入含有8毫克的過(guò)碘酸 鈉溶液〇. 5毫升，室溫下反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，離心，取上清液加入到10-20mg/mL的牛血清蛋白碳 酸鹽緩沖溶液中，攪拌反應(yīng)6小時(shí)，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0. 01m〇l/L的PBS緩沖溶 液透析3-5d，分裝保存于-20°C的冰箱中。
[0037] 實(shí)施例2
[0038] 10毫克的半抗原松脂醇二葡萄糖苷溶解在10mL熱水中，加入含有8毫克的過(guò)碘酸 鈉溶液0. 5毫升，室溫下反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，離心，取上清液加入到10-20mg/mL的卵清蛋白碳酸 鹽緩沖溶液中，攪拌反應(yīng)6小時(shí)，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0.0 lmol/L的PBS緩沖溶液 透析3-5d，分裝保存于-20°C的冰箱中。
[0039] 實(shí)施例3
[0040] 制備方法同實(shí)施例1，只是將牛血清白蛋白（BSA)換成KLH，制得松脂醇二葡萄糖 苷-KLH完全抗原120mg。
[0041] 實(shí)施例4
[0042] 免疫原（PF-BSA、PF-KLH)按常規(guī)方法各免疫了三只兔子。從加強(qiáng)免疫第二次開(kāi) 始，在每次免疫后第8天于兔子耳緣靜脈采血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后用間接ELISA測(cè)定效價(jià)。 待第4次免疫時(shí)，兔子獲得了高效價(jià)的抗體，經(jīng)純化制成凍干粉后的效價(jià)分別為20000 : 1。
[0043] 實(shí)施例5
[0044] 先將松脂醇二葡萄糖苷抗原與弗氏佐劑乳化，用PBS將完全抗原松脂醇二葡萄糖 苷-KLH配制成lmg/mL的溶液，然后將完全抗原溶液與弗氏佐劑等體積混合，用高速震蕩器 震蕩形成均勻乳濁液，將此乳濁液用于動(dòng)物的免疫。選擇8周齡的小鼠進(jìn)行注射免疫。取 8周齡的健康Balb/C小鼠12只，在第0天，每只腹腔注射完全弗氏佐劑乳化抗原100 μ L。 第14天，再對(duì)每只小鼠腹腔注射不完全弗氏佐劑乳化抗原100 μ L。第21天，以摘小鼠眼 球法采血，用ELISA方法檢測(cè)血清中抗體效價(jià)（滴度）。第28天，再次腹腔注射不完全弗 氏佐劑乳化抗原100 μ L。在細(xì)胞融合反應(yīng)前一周，用100 μ g/100 μ L抗原生理鹽水再次加 強(qiáng)免疫。采血后經(jīng)測(cè)定，所得抗血清效價(jià)為1 : 20000。細(xì)胞融合操作3天后檢查細(xì)胞融 合情況，8天后加 ΗΤ'完全培養(yǎng)基，每孔加入lmL。在12天間，就可以觀察到雜交細(xì)胞的克 隆。當(dāng)克隆直徑長(zhǎng)到約1mm時(shí)，用人松脂醇二葡萄糖苷-BSA包被的酶聯(lián)板來(lái)篩選出抗松脂 醇二葡萄糖苷的雜交瘤細(xì)胞。篩選到的陽(yáng)性克隆用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，以TOG-BSA包 被的ELISA法酶標(biāo)板來(lái)篩選抗松脂醇二葡萄糖苷的特異性雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)五次克隆后，得 到一株能分泌專(zhuān)一性抗體的抗松脂醇二葡萄糖苷單克隆細(xì)胞。
[0045] 實(shí)施例6
[0046] 取實(shí)施例4中經(jīng)過(guò)4次免疫的小鼠，用松脂醇二葡萄糖苷-BSA包被的酶聯(lián)板測(cè)定 抗血清的滴度。將包被抗原以10 μ g/ml稀釋于pH 9. 6的0. 05M碳酸鹽緩沖液中，100 μ L/ 孔加入到96孔酶標(biāo)板于4°C過(guò)夜。棄去包被液后用1 %明膠/PBS在37°C下封閉2小時(shí)，然 后用PBS-Tween-20洗液洗板3遍，再加入稀釋后的松脂醇二葡萄糖苷抗血清，置于37°C孵 育1小時(shí)。用PBS-Tween-20洗液洗板3遍，加入1 : 2000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗 鼠 IgG多抗，37°C孵育1小時(shí)后用PBS-Tween-20洗液洗板3遍，加 ΤΜΒ/Η202底物進(jìn)行顯色 lOmin,并用終止液（0. 1M硫酸）終止顯色。
[0047] 在450nm光波長(zhǎng)下測(cè)定吸收值（0D)，與空白對(duì)照孔的0D均值比較，采用計(jì)量資料 的t檢驗(yàn)，取P < 0. 05的最低稀釋度作為此抗體的效價(jià)。經(jīng)比色測(cè)定，所得松脂醇二葡萄 糖苷抗血清的效價(jià)為1 : 20000。
[0048] 實(shí)施例7
[0049] 融合效率分析用CFSE綠色熒光預(yù)標(biāo)記的淋巴細(xì)胞顯綠色，用PE標(biāo)記的抗小鼠 B220單克隆抗體預(yù)標(biāo)記的SP2/0細(xì)胞顯紅色，兩種細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞帶有雙色熒 光。經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定分析雙熒光細(xì)胞比例，用于反映融合效率。實(shí)驗(yàn)中，PE標(biāo)記抗小鼠 B220單克隆抗體預(yù)標(biāo)記的SP2/0 (骨髓瘤）細(xì)胞，CFSE綠色熒光預(yù)標(biāo)記淋巴細(xì)胞，帶有雙色 熒光即為雜交瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)體系中脾細(xì)胞和SP2/0的最初融合效率約為45%，ELISA法 測(cè)定陽(yáng)性率為15%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種如下通式的免疫原：其中R是〇至6個(gè)碳的烷基橋（連接半抗原與載體物質(zhì)的橋），P1是賦予抗原性的載 體物質(zhì)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原，R = 0,即Pl直接與松脂醇二葡萄糖苷氧化后的醛基結(jié) 合。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原，R是C1-C6取代或未取代的、直鏈或支鏈的、飽和或不飽 和的亞烷基。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3的免疫原，R是C1-C4未取代的、直鏈的、飽和的亞烷基。5. 根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原，其中載體物質(zhì)為蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成或天然多肽或 半合成多肽、合成或天然聚合物。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5的免疫原，其中蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段選自白蛋白、血清蛋白、球蛋 白、和脂蛋白。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或5的免疫原，其中蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段選自牛血清白蛋白、卵清蛋 白、牛丙種球蛋白、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、鎖眼形血藍(lán)蛋白（keyhole limpet haemocyanin， KLH)等。8. 根據(jù)權(quán)利要求1或5的免疫原，其中合成或天然多肽或半合成多肽是具有足夠數(shù)量 的可利用氨基的合成聚氨基酸。9. 根據(jù)權(quán)利要求1或5的免疫原，其中合成或天然聚合物選自碳水化合物、酵母或多 糖。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9的免疫原的抗體，其中抗體能與完整的松脂醇二葡萄糖苷中的 至少一種結(jié)構(gòu)性抗原決定部位結(jié)合。11. 如權(quán)利要求10的抗體，其中當(dāng)抗原固定在支持底物上，特別是聚苯乙烯固體支持 物時(shí)，抗體可以與其特異性結(jié)合。12. 制備如權(quán)利要求10或11中的抗體的方法，該方法包括將如權(quán)利要求1至9的免疫 原重復(fù)給予動(dòng)物而使動(dòng)物免疫，以及從免疫動(dòng)物中收集所得到的血清抗體；以及利用免疫 學(xué)上可接受的細(xì)胞系與產(chǎn)生抗體的免疫動(dòng)物單克隆細(xì)胞系融合后產(chǎn)生的細(xì)胞系，所制備的 單克隆抗體。13. 如權(quán)利要求12的方法，其中該方法還包括將所述血清抗體固定在支持底物上。包 括如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的半抗原與可檢測(cè)到的標(biāo)記物共價(jià)結(jié)合的偶聯(lián)物。14. 一種如下結(jié)構(gòu)的偶合物：其中R是〇至6個(gè)碳的烷基，P2是可檢測(cè)的標(biāo)記試劑。15. 根據(jù)權(quán)利要求14的偶合物，標(biāo)記試劑選自酶、發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)或它們的混合 物。16. 根據(jù)權(quán)利要求14或16的偶合物，標(biāo)記試劑是過(guò)氧化物酶。17. 根據(jù)權(quán)利要求16的偶合物，標(biāo)記試劑是辣根過(guò)氧化物酶（HRP)。18. 根據(jù)權(quán)利要求14或15的偶合物，發(fā)光物質(zhì)是生物發(fā)光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光 物質(zhì)。19. 用于檢測(cè)和定量樣品中松脂醇二葡萄糖苷的方法，該方法包括將供試樣品和如權(quán) 利要求14至18中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物或其混合物，與如權(quán)利要求10或11的抗體或其混合物 接觸；檢測(cè)或定量結(jié)合的偶聯(lián)物；以及從校準(zhǔn)曲線(xiàn)中推出樣品中松脂醇二葡萄糖苷的存在 或含量。20. 用于檢測(cè)和定量松脂醇二葡萄糖苷的試劑盒，該試劑盒包括如權(quán)利要求14至18中 任一項(xiàng)的偶聯(lián)物或其混合物，以及如權(quán)利要求10或11的抗體或其混合物。
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK105884883SQ201410521568
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年9月30日
【發(fā)明人】趙琰, 屈會(huì)化, 王慶國(guó), 單文超, 成金俊, 賀娜娜, 馮盛嵐, 張?jiān)? 趙妍, 胡文婷, 馮會(huì)賓
【申請(qǐng)人】北京中醫(yī)藥大學(xué)