一種Bt Cry毒素廣譜檢測(cè)用蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種Bt Cry毒素廣譜檢測(cè)用蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，該蛋白DNA序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本發(fā)明提供的蛋白與5種Bt Cry (Cry1Ab、Cry1Ab、Cry1B、Cry1B、Cry1F)毒素均具有較好結(jié)合活性，可用于小麥樣品Bt毒素廣譜性檢測(cè)；本發(fā)明不經(jīng)動(dòng)物免疫而獲得的Bt Cry毒素廣譜檢測(cè)用單域抗體蛋白，制備周期短，氨基酸序列小，適合體外大規(guī)模生產(chǎn)，對(duì)開發(fā)快速檢測(cè)試劑盒具有重要的科學(xué)及現(xiàn)實(shí)意義。
【專利說明】
一種Bt Cry毒素廣譜檢測(cè)用蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及基因工程抗體和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種人源化重鏈抗體基 因改造的Bt Cry毒素廣譜檢測(cè)用蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Bt Cry毒素是蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)芽孢形成過程 中產(chǎn)生的一類伴胞晶體蛋白（Insecticidal crystal protein，ICP)，對(duì)鞘翅目、雙翅目、鱗 翅目等常見的農(nóng)、林害蟲具有特異性毒殺作用。目前已被發(fā)現(xiàn)并鑒定的Bt Cry毒素種類已 經(jīng)超過50種，包括 CrylAa、CrylAb、CrylAc、CrylC、CrylD、CrylE、CrylF、Cry2Aa、Cry2Ab、 〇734、&^34和〇734/〇735在內(nèi)，多達(dá)十幾種131:〇7毒素已成功實(shí)現(xiàn)商業(yè)化開發(fā)并推廣應(yīng) 用，其轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物涵蓋水稻、玉米、小麥、大豆、土豆、棉花、煙草等世界大宗農(nóng)產(chǎn)品，產(chǎn)生 了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。中國(guó)是世界農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，轉(zhuǎn)Bt Cry農(nóng)作物或Bt Cry農(nóng)作物 產(chǎn)品在我國(guó)消費(fèi)市場(chǎng)占有相當(dāng)比重。
[0003] 然而，隨著Bt Cry毒素制劑和轉(zhuǎn)Bt Cry基因作物及其產(chǎn)品在世界范圍內(nèi)的推廣應(yīng) 用，其暴露的生物安全問題和潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，也受到越來越多的質(zhì)疑。有研究表明， 轉(zhuǎn)基因在目標(biāo)生物體對(duì)藥物產(chǎn)生耐受性、基因跨物種逃逸、微生態(tài)生物多樣性結(jié)構(gòu)失衡以 及傷害非目標(biāo)生物的免疫系統(tǒng)等方面，可能存在安全隱患。"轉(zhuǎn)Bt基因玉米根際微生物和細(xì) 菌生理群多樣性"（王敏等，生態(tài)學(xué)雜志，2010年03期）和"轉(zhuǎn)Bt基因玉米對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量多 樣性的影響"（劉玲等，生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2011年03期）分別對(duì)室內(nèi)、室外種植轉(zhuǎn)Bt玉米 的土壤進(jìn)行了細(xì)菌數(shù)量和多樣性分析，結(jié)果都發(fā)現(xiàn)種植轉(zhuǎn)Bt玉米的與空白對(duì)照組相比出現(xiàn) 顯著差異。"CrylAc protoxin from Bacillus thuringiensis sp.kurstaki HD73 binds to surface proteins in the mouse small intestine"（Vazquez-Padr0n等，Biochem Biophys Res Commun，2000年01期)在動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠攝取的Bt內(nèi)、外毒素達(dá)到10mg/ kg和100mg/kg時(shí)，小鼠的T細(xì)胞ANAE陽性率、脾臟指數(shù)及巨噬細(xì)胞的吞噬功能均出現(xiàn)了明顯 的抑制反應(yīng)，隨著攝取劑量的增加，這種抑制作用越發(fā)明顯。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Bt毒素蛋白在 動(dòng)物體內(nèi)的蓄積系數(shù)大于6.24時(shí)，可以導(dǎo)致肝臟、腎臟及胃腸道等損傷，在肝臟和腎臟中可 以觀察到細(xì)胞腫脹和空泡樣變性異象，并且能看見腎小球血管上皮細(xì)胞的病變。長(zhǎng)期大劑 量使用Bt毒素蛋白，還會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物白細(xì)胞總數(shù)和血紅蛋白含量顯著性下降，這也說明Bt毒 素蛋白具有明顯的免疫抑制毒性。
[0004] 近年來，轉(zhuǎn)基因安全性問題，特別是轉(zhuǎn)基因食用農(nóng)產(chǎn)品的安全性問題，已經(jīng)成為社 會(huì)輿論的熱點(diǎn)話題，引起了部分消費(fèi)者的恐慌，國(guó)家有關(guān)部門也高度重視轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品安 全性問題，2015年農(nóng)業(yè)部重新修訂并頒布了新的《轉(zhuǎn)基因管理?xiàng)l例》;2016年，更是將加強(qiáng)農(nóng) 業(yè)轉(zhuǎn)基因監(jiān)管明確納入中央1號(hào)文件，引起社會(huì)高度關(guān)注。因此，建立一套簡(jiǎn)單、方便、行之 有效的轉(zhuǎn)Bt Cry基因及其產(chǎn)品檢測(cè)分析方法，是政府監(jiān)管部門及普通大眾需求的必然要 求。
[0005] 目前，應(yīng)用最廣的Bt Cry毒素檢測(cè)方法，是基于多克隆抗體、單克隆抗體的免疫學(xué) 檢測(cè)方法。但傳統(tǒng)多克隆抗體、單克隆抗體的制備需要免疫動(dòng)物獲得，不僅過程繁瑣，免疫 周期長(zhǎng)，而且抗體制備量有限，不易保藏，容易退化。近年來，新型基因工程抗體結(jié)合噬菌體 表面展示及成熟的配套篩選技術(shù)成為抗體領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)。噬菌體展示抗體因其表型與 基因型一致，在獲得抗原特異性展示抗體的同時(shí)也獲得了該抗體基因信息，因此為抗體大 量克隆表達(dá)以及后期定向改造提供了可能，更為定向獲得抗原特異性抗體提供了新路徑。 本課題組在前期研究中，先后成功從人源單鏈抗體噬菌體展示庫中分別篩選到具有CrylAc ("基于磁珠和雙抗夾心免疫分析的Bt CrylAc毒素單鏈抗體篩選與鑒定"張留娟等，中國(guó)農(nóng) 業(yè)科學(xué)，2014年09期）、CrylB( "Rapid Isolation of Single-Chain Antibodies from a Human Synthetic Phage Display Library for Detection of Bacillus thuringiensis (Bt)CrylB Toxin"張霄等，Ecotoxicology and Environmental Safety,2012年81期）、 CrylF("抗CrylF毒素單鏈抗體的篩選及初步應(yīng)用"徐重新等，江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015年31期） 等毒素的特異性單鏈抗體，并在實(shí)際樣品中檢測(cè)應(yīng)用。Human domain antibody library是 由人源重鏈基因構(gòu)成的大容量（3 X109)噬菌體抗體庫，抗體基因和分子量比單鏈抗體還 小，更適合抗體克隆表達(dá)和分子定向改造。目前針對(duì)Bt Cry毒素的廣譜檢測(cè)用單域抗體(短 肽)及相應(yīng)技術(shù)還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0000]針對(duì)目前轉(zhuǎn)Bt Cry毒素作物及其毒素制劑監(jiān)管需求，篩選具有Bt Cry毒素廣譜檢 測(cè)用生物蛋白及其在實(shí)際樣品中的檢測(cè)應(yīng)用，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 一種Bt Cry毒素廣譜檢測(cè)用蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008] 一段編碼如SEQ ID NO.2所述蛋白的基因序列。
[0009] 一段編碼如SEQ ID N0.2所述蛋白的基因序列，其DNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010]氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白在糧食作物Bt Cry毒素廣譜檢測(cè)中的應(yīng) 用。
[0011]含有核苷酸序列為SEQ ID NO. 1的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組工程菌。 [0012]擴(kuò)增核苷酸序列為SEQ ID NO. 1基因序列的引物對(duì)。
[0013]如本發(fā)明所述蛋白（氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示)在糧食作物Bt Cry毒素廣譜 檢測(cè)中的應(yīng)用，其具體步驟為：
[0014] (1)將糧食作物樣品干燥后磨成粉，過100目篩，加入終濃度為0.10m〇l/L碳酸鹽緩 沖液和終濃度為0.05 %的Tween-20，pH=9.6;室溫振蕩4h，以10000g離心10min，取上清液；
[0015] ⑵取50μl上清液，加入50μl濃度為100 μg/ml氨基酸序列如SEQIDN0.2所示的蛋 白溶液，37°C孵育過夜，備用；
[0016] (3)分別將濃度均為2.5μg/ml的〇71六13、(>714(3、(：巧18、(：巧1(：、(：巧1?包被到96孔 板中，1〇〇μ1/孔，4 °C包被過夜;次日取96孔板，每孔用250μ1 PBST溶液洗板3次，每孔加200μ 1 5 %的脫脂奶粉，37 °C水浴鍋中封閉反應(yīng)1.5h;取出96孔板，每孔用250μ1 PBST溶液洗板3 次;取步驟(3)獲得的溶液分別加入到96孔板中，37°C水浴鍋中孵育1.5h;取出96孔板，每孔 250μ1 PBST溶液洗板3次;每孔加 100μ1經(jīng)1:5 000稀釋的Anti-His-[HRP]Antibody二抗，于 37°C水浴鍋孵育1.5h;取出96孔板，每孔用250μ1 PBST溶液洗板3次;每孔加100μ1 TMB顯色 液顯色，置于室溫20min，每孔加50μ1 211濃硫酸終止顯色反應(yīng)；
[0017] (4)取出96孔板在酶標(biāo)儀上測(cè)0D450?值，將檢測(cè)結(jié)果分別代入以下曲線：
[0018] CrylAb：y = -9.0744x2+61.012x+6.588；R2 = 0.9619；
[0019] CrylAc ：y = -9.6051x2+64.641x+8.1001 ； R2 = 0.9571 ；
[0020] Cry IB ： y = -8.3961x2+57.02x+5.8822 ； R2 = 0.9713 ；
[0021 ] CrylC：y = -9.0712x2+61.544x+7.3365 ；R2 = 0.9614；
[0022] CrylF :y = -9.2767x2+62.491x+7.2897; R2 = 0.9591;
[0023] 根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的公式，即通過設(shè)計(jì)的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，得出y值，即可算出對(duì)應(yīng)的x 值。
[0024]本發(fā)明從公開的人類抗體重鏈基因庫中，篩選獲得一種具有同時(shí)識(shí)別5種Bt Cry (Cry lAb、Cry lAb、Cry IB、Cry IB、Cry IF)毒素的廣譜檢測(cè)用單域抗體，該抗體蛋白經(jīng)原核系 統(tǒng)表達(dá)，純化后蛋白具有5種Bt Cry (Cry lAb、Cry lAb、Cry IB、Cry IB、CrylF)毒素的結(jié)合活 性，可用于Bt Cry毒素廣譜性檢測(cè)。本發(fā)明不經(jīng)動(dòng)物免疫而獲得的Bt Cry毒素廣譜檢測(cè)用 單域抗體蛋白，制備周期短，氨基酸序列小，適合體外大規(guī)模生產(chǎn)；同時(shí)，本發(fā)明作為新型的 基因工程改造抗體，對(duì)探索拓展具有廣譜識(shí)別Bt Cry毒素生物活性的新型抗體基因資源， 以及開發(fā)快速檢測(cè)試劑盒等具有重要的科學(xué)及現(xiàn)實(shí)意義。
【附圖說明】
[0025]圖1為Bt Cry毒素廣譜特異性噬菌體富集效果示意圖。
[0026]圖2為F5單域抗體噬菌體廣譜結(jié)合Bt Cry毒素 ELISA檢測(cè)示意圖。
[0027]圖3為F5單域抗體表達(dá)純化后蛋白SDS-PAGE電泳效果示意圖。
[0028]圖4為F5單域抗體表達(dá)純化后蛋白IC-ELISA法活性測(cè)定示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 實(shí)施例中所涉及的試劑和培養(yǎng)基配方：
[0030] (1) 2 X TY液體培養(yǎng)基：
[0031 ]在900ml蒸餾水中加入16g胰蛋白胨，10g酵母提取物和5g NaCl，攪拌混勾，用蒸餾 水定容到1L，置于高壓滅菌鍋中，121°C，20min滅菌，冷卻后，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032] (2)2XTY_AG 液體培養(yǎng)基：
[0033]在2XTY的培養(yǎng)基中加入終濃度為100μg/ml氨芐青霉素和質(zhì)量比為1%葡萄糖。
[0034] (5)TYE固體培養(yǎng)基：
[0035]在900ml蒸餾水中加入15g瓊脂糖，8g NaCl，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，用蒸餾 水定容到1L，置于高壓滅菌鍋中，121°C，20min滅菌，冷卻后，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] (6)TYE_AG 固體培養(yǎng)基：
[0037]在TYE固體培養(yǎng)基中加入終濃度為100μg/ml氨芐青霉素和質(zhì)量比為1%葡萄糖。
[0038] (7)PBS 溶液
[0039]稱取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HP〇4 · 12H20 2.9g，KH2P〇4 0.2g，分別加入到蒸餾水 中，充分溶解后，定容到1L。
[0040] (8)PBST 溶液
[0041 ] 在PBS溶液中加入體積比為0.05 %的吐溫-20。
[0042] (9)PEG/NaCl 溶液：
[0043] 稱取20g PEG 8 000,14.61g NaCl，加80ml去離子水，定容到100ml，置于高壓滅菌 鍋中，121°C，20min滅菌，冷卻后，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0044] (10)檸檬酸鹽緩沖液(CPBS，底物緩沖液，pH5.5):
[0045] 取C6H7〇8(檸檬酸)21g，Na2HP〇4· 12H20 71.6g，分別加入到蒸餾水中充分溶解后定 容到1L。
[0046] (11)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液：
[0047] 稱取10mg四甲基聯(lián)苯胺溶于lml二甲基亞砜中，避光，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0048] (12)底物顯色溶液：
[0049] 1〇1111配方成分：9.8751111 0?85、10(^11'冊(cè)溶液、25以1體積比為20%!12〇2。
[0050] (13)LB液體培養(yǎng)基
[0051 ] 1L體系:取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，lOgNaCl，以蒸餾水定容至1L，置于高壓滅 菌鍋中，121°C，20min滅菌，冷卻后，置于4°C保存?zhèn)溆?。?) LB固體培養(yǎng)基 [0052] (14)LB固體培養(yǎng)基
[0053] 1L體系：取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，lOgNaCl，15g瓊脂粉，以蒸餾水定容至1L 置于高壓滅菌鍋中，121°C，20min滅菌，冷卻后，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0054] (15)IPTG 溶液
[0055] lml體系：稱取0.238g(lmM)IPTG溶于lml蒸餾水中，配置成濃度為ImM/ml的母液， 于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0056]實(shí)施例中所涉及材料來源：
[0057] Human domain antibody library、E.coli TG1細(xì)菌和輔助·菌體KM13購(gòu)于英國(guó) Source BioScience公司；
[0058] pET26b 載體，Ε· co li BL21，Ant i_Ml 3-[HRP] Ant ibody，Anti-Hi s_[HRP] Antibody， His-Trap HP親和純化柱購(gòu)于美國(guó)GE Healthcare公司；
[0059] 〇5^]^13、〇7]^(3、〇7113、〇7113、〇7]^購(gòu)于上海佑隆生物科技有限公司。
[0060] 實(shí)施例中涉及的核苷酸序列：
[0061] SEQ ID N0.1：

[0082]實(shí)施例1篩選Bt Cry毒素廣譜檢測(cè)用單域抗體
[0083] (1)取Human domain antibody library菌液500μ1 加入到200ml 2XTY-AG液體培 養(yǎng)基中，37°C恒溫培養(yǎng)到0D6(x)為0.4。取50ml菌液，加入50μ1滴度為~10 12pfu/ml輔助噬菌體 KM13進(jìn)行超感染，于37°C孵育30min后，以3300g離心10min，棄上清液，用100ml 2XTY-AKG 液體培養(yǎng)基重懸沉淀，30 °C培養(yǎng)過夜。次日3300g離心30min，收集上清液并加入25ml PEG/ NaCl溶液，冰浴lh，以3300g離心30min，用5ml PBS重懸沉淀。重懸液以11600g離心10min，上 清液即為擴(kuò)增的噬菌體抗體庫。
[0084] (2)取步驟1獲得的擴(kuò)增的噬菌體抗體庫進(jìn)行5輪淘篩：第1輪篩選，將4ml濃度為 100μg/ml的CrylAb毒素包被在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，4°C過夜;次日，用lml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶 3次，然后加入混勻的lml步驟（1)獲得擴(kuò)增的噬菌體抗體庫與4ml 3%的MPBS溶液，在室溫 下緩慢搖動(dòng)lh，再靜置lh，傾去培養(yǎng)瓶中液體；用lml PBST溶液洗瓶20次，加入lml濃度為 l〇mg/ml的胰蛋白酶(Trypsin)洗脫特異性結(jié)合的噬菌體抗體，洗脫液即為第1輪淘篩的噬 菌體抗體;第2、3、4、5輪篩選的包被抗原分別為等量的濃度為100μg/ml的CrylAc、CrylB、 CrylC、CrylF毒素，所使用的噬菌體抗體為前一輪篩選獲得的噬菌體抗體，篩選方法與第1 輪相同，各輪富集效果如圖1所示；
[0085] 取第5輪篩選的噬菌體抗體20μ1侵染lml處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli TG1細(xì)菌，37°C 孵育lh后，涂布于TYE-AG固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜;次日，隨機(jī)挑取單菌落，接種到含 100μ1/孔2 X TY-AG液體培養(yǎng)基的96孔板中，37°C培養(yǎng)過夜;次日從板孔中吸出2.5μ1菌液轉(zhuǎn) 接到新的含1〇〇μ1/孔2XTY-AG液體培養(yǎng)基的96孔板中，37°C孵育1.5h;每孔加入25μ1滴度 為~10 12pfu/ml 的ΚΜ13輔助噬菌體，30 °C孵育 1 · 5h，1800g離心 10min，用 150μ1 2 X ΤΥ-ΑΚ液 體培養(yǎng)基重懸沉淀后30°C培養(yǎng)過夜；次日以1800g離心30min，分別取上清液用于ELISA分 析。
[0086] (3)取總濃度為2.5以8/1]11的〇71413、〇714(3、〇7113、〇7113、〇7]^毒素混合物(按質(zhì) 量比1:1:1:1:1混勻）加入到96孔板中，100μΙ/孔，4°C包被過夜;次日，每孔分別加入100μΙ 步驟(2)獲得的上清液，陰性對(duì)照加 100μΙ 2 X ΤΥ-ΑΚ液體培養(yǎng)基，37 °C水浴1.2h;每孔用250 μL PBST洗板后，每孔加入100μΙ 1:5000稀釋的Anti-M13-[HRP]Antibody，37°C孵育 1.5h; 每孔加入1〇〇μ1底物顯色溶液，室溫下反應(yīng)10~20min至出現(xiàn)藍(lán)色，最后每孔加入50μ1濃度 為2Μ的H 2S〇4快速終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定0D45Q值。
[0087] 其中溶液0D45Q值/陰性對(duì)照0D45Q值大于2.1的，判斷為陽性，與該溶液對(duì)應(yīng)的步驟 (2)中的上清液即為篩選到的含有廣譜結(jié)合Bt Cry毒素的噬菌體單域抗體的上清液。
[0088] (4)取濃度均為2.5以8/1111的〇7]^13、〇7]^(3、〇7113、〇7113、〇71?毒素分別加入到 96孔板中，100μΙ/孔，4°C過夜;次日，每孔分別加入100μΙ經(jīng)步驟(3)鑒定為陽性克隆菌的上 清液，陰性對(duì)照加1〇〇μ1 2 X ΤΥ-ΑΚ液體培養(yǎng)基，37°C水浴1.2h，每孔用250μ1 TOST洗板后， 每孔加入 1〇〇μ1 1:5000稀釋的 Anti-M13-[HRP]Antibody，37°C 孵育 1.5h。每孔加入 100μΙ 底 物顯色溶液，室溫下反應(yīng)15~20min至出現(xiàn)藍(lán)色，最后每孔加入50μ1濃度為2Μ的H2S〇4快速終 止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定〇D 45Q值。以此評(píng)價(jià)步驟(3)中篩選到的陽性克隆噬菌體單域抗體分別 對(duì)Cry 1 Ab、Cry 1 Ac、Cry 1B、Cry 1C、Cry 1F毒素的結(jié)合活性，即溶液0D45Q值/陰性對(duì)照0D45Q值大 于2.1的，判斷為陽性，而與該溶液對(duì)應(yīng)的步驟(2)中的上清液即為篩選到的含有廣譜結(jié)合 Bt Cry毒素的噬菌體單域抗體的上清液。
[0089] 通過上述篩選，
【申請(qǐng)人】篩選到一種對(duì)5種Bt Cry(CrylAb、CrylAb、CrylB、CrylB、 CrylF)毒素均具有結(jié)合活性的單域抗體，將其自命名為F5，其所對(duì)應(yīng)步驟(2)的上清液對(duì)5 種Bt Cry毒素結(jié)合的ELISA檢測(cè)效果如附圖2所示。
[0090] 以Sanger測(cè)序法，分別設(shè)計(jì)上游引物SEQ ID N0.3和下游引物SEQ ID N0.4,測(cè)定 單域抗體F5核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，該核苷酸翻譯后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
[0091 ]實(shí)施例2單域抗體F5表達(dá)及活性測(cè)定 [0092] (1)基因克隆
[0093]以實(shí)施例1中篩選到的F5單克隆噬菌體菌液(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600值為0.4)為模板， 分別設(shè)計(jì)上游引物SEQ ID N0.5和下游引物SEQ ID N0.6(下劃線為酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基）， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增：
[0094] PCR反應(yīng)體系（20yl):2XTrq Μ?χ，10μ1;10μΜ的上游引物 1μ1、10μΜ的下游引物 1μ 1、菌液模板(108cfu/ml)lyl ;ddH2〇補(bǔ)足至20μ1;
[0095]反應(yīng)條件：95°(：1〇11^11，（94°(：111^11，56°(：111^11，72°(：111^11)\35個(gè)循環(huán)，72°(：1〇11^11。 將反應(yīng)獲得的單域抗體基因經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化(步驟參見Sigma公司PCR產(chǎn)物純化 試劑盒說明書），獲得擴(kuò)增純化的F5單域抗體基因，于-20°C中保存?zhèn)溆?；另取含有pET26b質(zhì) 粒的E.coli BL21菌種，在LB液體培養(yǎng)基(含終濃度為50μg/ml卡那霉素）中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期，然后提取質(zhì)粒(步驟參照Sigma公司質(zhì)粒提取試劑盒說明書)于-20°C中保存?zhèn)溆?。分別 將上述擴(kuò)增純化的F5單域抗體基因和提取的pET26b質(zhì)粒以Notl和Nco頂每進(jìn)行雙酶切過夜 (20μ1 體系：10XNEB Buffer 2yl，100XBSA 0·2μ1，擴(kuò)增的基因/質(zhì)粒載體 10yl，NotI和 Ncol各?μL，最后以蒸餾水補(bǔ)齊至20μ1;置于37°C水浴鍋中酶切過夜），次日，將該體系置于 80°C熱失活25min(NotI和Ncol酶80°C20min即可熱失活），然后進(jìn)行酶連反應(yīng)(20μ1體系，酶 切載體4μ1、酶切基因10μ1、10 X TdigBuffer 2μ1、Tdigase ΙμL，最后以蒸餾水補(bǔ)齊至20μ 1 )，置體系于16°C冰箱中酶連過夜。然后將酶連體系化轉(zhuǎn)到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，菌液涂布在 LB固體培養(yǎng)基上(含終濃度為50μg/ml卡那霉素），培養(yǎng)過夜后，挑單菌落做PCR和測(cè)序鑒定 (引物均為上游SEQ ID NO. 7、下游SEQ ID NO. 8)，具體化轉(zhuǎn)步驟參照徐重新碩士畢業(yè)論文 "人源化蘇云金芽孢桿菌Bt(CrylB)毒素蛋白單鏈抗體的篩選、表達(dá)及生物學(xué)活性測(cè)定"第3 章35頁操作，利用PCR擴(kuò)增和序列比對(duì)分析雙重鑒定，含F(xiàn)5基因條帶大小基因片段和相同核 酸序列，即為陽性克隆。
[0096] (2)抗體可溶性表達(dá)及純化
[0097]取步驟(1)中鑒定為陽性的單菌落（即含有實(shí)施例1中F5完整的基因片段），在LB液 體培養(yǎng)基(含終濃度為50μg/ml卡那霉素）中25 °C 250rpm震蕩培養(yǎng)至0D6QQnm為0.6，然后加入 IPTG(終濃度為0.8mM)誘導(dǎo)表達(dá)12h;次日，取菌液，以3300g離心20min，收集沉淀細(xì)胞，用細(xì) 胞破碎儀破碎細(xì)胞，然后5000g離心20min取上清液，過His-Trap HP affinity chromatography純化收集抗體蛋白（純化方法參照論文"人源化抗Cry 1B毒蛋白單鏈抗體的 原核表達(dá)及生物學(xué)活性測(cè)定"徐重新等，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013年3期）。以SDS-PAGE鑒定 蛋白純度(約20kDa)，以超微量分光光度計(jì)測(cè)得收集純化蛋白濃度為351.6ug/ml。
[0098] 對(duì)上述蛋白進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，圖3中，Μ:蛋白marker; 1:表達(dá)上清液； 2:破碎后細(xì)胞上清液;3:純化后蛋白。
[0099] (3)間接競(jìng)爭(zhēng)酶連免疫分析法(IC-ELISA)測(cè)定抗體活性
[0100]測(cè)定IC-ELISA法測(cè)定純化后單域抗體(F5)對(duì)5種Bt Cry毒素的結(jié)合活性，具體方 法如下所示：
[0101] 將步驟(2)中純化的抗體蛋白定容至100μg/ml，取50μ1蛋白溶液與50μ1不同濃度 的Bt Cry毒素標(biāo)準(zhǔn)品（母液為lmg/ml，用CBS緩沖液依次配置濃度為:0.02，0.05，0.1，0.2， 0.5，1.0，2.0和5.0μg/ml)混勻后，置于水浴鍋中，37°C孵育過夜;與此同時(shí)，將5種Bt Cry毒 素標(biāo)準(zhǔn)品母液分別用CBS緩沖液稀釋到2.5μg/ml，然后每孔100μ1包被到96孔板中，于4°C包 被過夜。次日取出96孔板，每孔用250μ1 PBST溶液洗板3次，每孔加200μ1 5 %的脫脂奶粉， 置于37 °C水浴鍋中，封閉反應(yīng)1.5h;取出96孔板，每孔用250μ1 PBST溶液洗板3次;取抗體蛋 白與各濃度的Bt Cry毒素標(biāo)準(zhǔn)品混合液分別加入到96孔板中，在37°C水浴鍋中孵育1.5h; 取出96孔板，再次以每孔250μ1 PBST溶液洗板3次；每孔加100μ1經(jīng)1:5 000稀釋的Anti-His-[HRP]Antibody二抗，于37°C水浴鍋孵育1.5h。取出96孔板，每孔用250μ1 TOST溶液洗 板3次；每孔加100μ1 TMB顯色液顯色，置于室溫20min，每孔加50μ1 2M濃硫酸終止顯色反 應(yīng)。
[0102] 取出96孔板在酶標(biāo)儀上測(cè)OD45〇nm值，以純化的抗體蛋白（CrylB濃度為0% )反應(yīng)孔 為陽性值，以抗體蛋白（含Bt Cry毒素各濃度梯度)反應(yīng)孔為反應(yīng)值，計(jì)算抑制率(抑制率 1% =(陽性值-反應(yīng)值)/陽性值X 100% )。繪制抗體蛋白與5種Bt Cry毒素間接競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 抑制曲線(如圖4所示），計(jì)算各自抑制中濃度(IC50)、最低檢測(cè)限（IC10)值以及線性檢測(cè)范 圍等評(píng)價(jià)抗體活性的關(guān)鍵數(shù)據(jù)如表1所示：
[0103] 表1 IC-ELISA法測(cè)定F5單域抗體對(duì)5種Bt(Cry)毒素的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)
[0104]
[0105] 從附圖4結(jié)合表1中對(duì)應(yīng)評(píng)價(jià)參數(shù)可以看出，制備的F5單域抗體對(duì)5種Bt Cry毒素 的檢測(cè)靈敏度均達(dá)到ng級(jí)(29-74ng/ml)，幾乎接近已報(bào)道的傳統(tǒng)抗Bt Cry毒素多克隆抗體 和單克隆抗體，且方法R2>95 %，說明相關(guān)性性較好。
[0106] 實(shí)施例3 Bt Cry毒素在小麥樣品中的添加回收試驗(yàn)
[0107] 實(shí)施例中小麥樣品（寧麥13)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技 術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。
[0108] 將供試小麥干燥后磨成粉，過100目篩，按lg/管分裝，4°C保存?zhèn)溆?。?管小麥樣 品，加入〇7]^13毒素，使其終濃度分別為30〇1^/^、60〇1^/^、100〇1^/^，充分混勾后，室溫靜 置2h，獲得樣品混合液;再取試管，每管加入lml樣品提取液(即樣品混合液中加入終濃度為 0.10mol/L碳酸鹽緩沖液和終濃度為0.05 %的Tween-20，pH值為9.6)，室溫振蕩4h，以 10000g離心10min，取上清液作為CrylAb毒素樣品梯度濃度提取液保存待用；以相同方法分 別制備Cry 1 Ac、Cry IB、Cry 1C和Cry 1F毒素樣品梯度濃度提取液備用。
[0109] 分別取各毒素樣品梯度濃度提取液，按實(shí)施例2中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法對(duì)應(yīng)測(cè)定5 種Bt Cry毒素，同一天每個(gè)樣品測(cè)3次，連續(xù)測(cè)3天，所得結(jié)果如表2所示：
[0110] 表2.IC-TRFIA法測(cè)定5種Bt Cry毒素在小麥中的添加回收使用結(jié)果
[0111]
[0112]由表2可見，以標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和變異系數(shù)(CV)評(píng)價(jià)精密度，以回收率評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度 (回收率=檢測(cè)值/理論值X 1〇〇% )，結(jié)果批內(nèi)、批間的回收率為81.2%~100.8%，穩(wěn)定性 為2.5 %~9.4 % (添加回收試驗(yàn)?zāi)J(rèn)值一般為回收率在80 %~110 %，穩(wěn)定性在〈12 %說明 方法效果較好），說明篩選制備的針對(duì)Bt Cry毒素廣譜檢測(cè)的F5單域抗體實(shí)用性和適用性 均較好，具有廣闊的應(yīng)用潛力。
[0113] 實(shí)施例4 Bt Cry毒素在稻米樣品中的添加回收試驗(yàn)
[0114] 實(shí)施例中稻米樣品（南粳46)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技 術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。
[0115] 將供試稻米干燥后磨成粉，過100目篩，按lg/管分裝，4°C保存?zhèn)溆?。?管小麥樣 品，加入〇7]^13毒素，使其終濃度分別為30〇1^/^、60〇1^/^、100〇1^/^，充分混勾后，室溫靜 置2h;每管加入lml樣品提取液(含終濃度為0.10m 〇l/L碳酸鹽緩沖液和終濃度為0.05%的 Tween-20的混合液，pH值為9.6)，室溫振蕩4h，以10000g離心10min，取上清液作為Cry lAb毒 素樣品梯度濃度提取液保存待用；以相同方法分別制備Cry 1 Ac、Cry 1B、Cry 1C和Cry IF毒素 樣品梯度濃度提取液備用。
[0116] 分別取各毒素樣品梯度濃度提取液，按實(shí)施例2中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法對(duì)應(yīng)測(cè)定5 種Bt Cry毒素，同一天每個(gè)樣品測(cè)3次，連續(xù)測(cè)3天，所得結(jié)果如表2所示：
[0117] 表3.IC-TRFIA法測(cè)定5種Bt Cry毒素在稻米中的添加回收使用結(jié)果
[0118]
[0119]由表2可見，以標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和變異系數(shù)(CV)評(píng)價(jià)精密度，以回收率評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度 (回收率=檢測(cè)值/理論值X 100 % )，結(jié)果批內(nèi)、批間的回收率為82.2 %~97.1 %，穩(wěn)定性為 4.0%~10.5%(添加回收試驗(yàn)?zāi)J(rèn)值一般為回收率在80%~110%，穩(wěn)定性在〈12%說明方 法效果較好），說明篩選制備的針對(duì)Bt Cry毒素廣譜檢測(cè)的F5單域抗體實(shí)用性和適用性均 較好，具有廣闊的應(yīng)用潛力。
[0120] 實(shí)施例5盲樣(空白樣品)檢測(cè)試驗(yàn)
[0121] 實(shí)施例中小麥樣品（寧麥13)和稻米樣品（南粳46)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部農(nóng) 產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。
[0122] 將供試小麥干燥后磨成粉，過100目篩，按lg/管分裝，4°C保存?zhèn)溆?加入含終濃度 為0.10m〇l/L碳酸鹽緩沖液和終濃度為0.05%的Tween-20的混合液，pH值為9.6，制備獲得 樣品提取液;每管加入lml樣品提取液，室溫振蕩4h，以10000g離心10min，取上清液作為提 取液保存待用；以相同方法分別制備稻米樣品梯度濃度提取液備用。
[0123] 分別取各樣品提取液，按實(shí)施例2中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法對(duì)應(yīng)測(cè)定5種Bt Cry毒 素，同一天每個(gè)樣品測(cè)3次，連續(xù)測(cè)3天，所得結(jié)果均未顯示檢出對(duì)應(yīng)Bt Cry毒素成分，這與 "寧麥13"小麥樣品和"南粳46"稻米樣品不含Bt毒素成分相符。
[0124] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種Bt Cry毒素毒素廣譜檢測(cè)用蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. 如權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因的DNA序列如SEQ ID NO. 1所示。4. 如權(quán)利要求1所述蛋白在糧食作物Bt Cry毒素廣譜檢測(cè)中的應(yīng)用。5. 含有如權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組工程菌。6. 擴(kuò)增如權(quán)利要求2或3所述編碼基因的引物對(duì)。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所示的應(yīng)用，其特征在于，具體檢測(cè)步驟如下： (1) 將糧食作物樣品干燥后磨成粉，過100目篩，加入終濃度為0.10 mol /L碳酸鹽緩沖 液和終濃度為0.05 %的Tween_20，pH=9.6;室溫振蕩4 h，以10000 g離心10 min，取上清 液； (2) 取50μl上清液，加入50μl濃度為100μg/ml氨基酸序列如SEQIDN0.2所示的蛋白溶 液，37 °C孵育過夜，備用； (3) 分別將濃度均為2.5μg/ml的CrylAb、CrylAc、CrylB、CrylC、CrylF包被到96 孔板 中，100μΙ/孔，4°C包被過夜;次日取96孔板，每孔用250μ1 I3BST溶液洗板3次，每孔加200μ1 5 %的脫脂奶粉，37°C水浴鍋中封閉反應(yīng)1.5 h;取出96孔板，每孔用250μ1 PBST溶液洗板3 次;取步驟(3)獲得的溶液分別加入到96孔板中，37°C水浴鍋中孵育1.5 h;取出96孔板，每 孔250μ1 PBST溶液洗板3次；每孔加 100μ1經(jīng)1:5 000稀釋的Anti-His-[HRP] Antibody二 抗，于37 °C水浴鍋孵育1.5 h;取出96孔板，每孔用250μ1 I3BST溶液洗板3次;每孔加100μ1 TMB顯色液顯色，置于室溫20 min，每孔加50μ1 211濃硫酸終止顯色反應(yīng)； (4) 取出96孔板在酶標(biāo)儀上測(cè)0D450 _值，將檢測(cè)結(jié)果分別代入以下曲線： CrylAb：y = -9.0744 x2 + 61.012 x + 6.588 ; R2 = 0.9619； CrylAc：y = -9.6051 x2 + 64.641 x + 8.1001; R2 = 0.9571； CrylB：y = -8.3961 x2 + 57.02 x + 5.8822 ; R2 = 0.9713； CrylC：y = -9.0712 x2 + 61.544 x + 7.3365; R2 = 0.9614； CrylF：y = -9.2767 x2 + 62.491 x + 7.2897; R2 = 0.9591； 計(jì)算所得到的x值，即為樣品中對(duì)應(yīng)毒素的濃度。
【文檔編號(hào)】C07K16/12GK105884892SQ201610485539
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】徐重新, 劉賢金, 張霄, 劉媛, 胡曉丹, 仲建鋒, 張存政
【申請(qǐng)人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院