南瓜皮多糖及其制備方法、應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物藥南瓜皮，具體涉及南瓜皮多糖及其制備方法、應用；南瓜皮多糖，其特征在于其多糖含量在90%以上，數(shù)均分子量2000~3000KDa；單糖組成包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖。本發(fā)明在制備南瓜皮多糖過程中，分別采用氯仿?正丁醇溶液法和離子交換樹脂進行純化的方法，去除蛋白更完全，然后再經(jīng)分子篩凝膠柱進一步精制，所得的南瓜皮多糖，雜質(zhì)少，純度高；并對南瓜皮多糖和南瓜皮提取物的降血糖活性，為南瓜皮多糖的應用提供新的思路。南瓜皮作為廢棄物，可以變廢為寶，擁有廣闊的應用前景，具有良好的社會效益和經(jīng)濟效益。
【專利說明】
南瓜皮多糖及其制備方法、應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及植物藥南瓜皮，確切地說是南瓜皮多糖及其南瓜皮提取物治療糖尿病 藥物中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是一種非常普遍的內(nèi)分泌代謝紊亂疾病，是胰島素分泌和利用障礙引起的 以高血糖為特征的慢性疾病。糖尿病發(fā)病率逐年增長，已成為全世界的突出問題。I型糖尿 病，原名胰島素依賴型糖尿病，多發(fā)生在兒童和青少年，也可發(fā)生于各種年齡。起病比較急 劇，體內(nèi)胰島素絕對不足，容易發(fā)生酮癥酸中毒，必須用胰島素治療才能獲得滿意療效，否 則將危及生命。
[0003]南瓜（Cucurbita moschata(Duch · ex Lam. )Duch · ex Poiret)萌蘆科南瓜屬的一 個種，一年生蔓生草本植物。原產(chǎn)墨西哥到中美洲一帶，世界各地普遍栽培。明代傳入中國， 現(xiàn)南北各地廣泛種植。南瓜的果實可作肴饌，亦可代糧食。全株各部又供藥用，且作用廣泛， 中國民間還流傳著"吃南瓜降血糖"的說法。有研究表明南瓜肉中南瓜多糖可治療I型糖尿 病，但南瓜皮作為廢棄物不被人利用。本發(fā)明采用以STZ誘導方法的I型糖尿病小鼠模型為 研究對象，從南瓜皮中提取南瓜多糖并考察其對I型糖尿病小鼠的降糖功效，為南瓜皮應用 提出新的思路，從而變廢為寶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的提供一種南瓜皮多糖和南瓜皮提取物在制備治療糖尿病藥物中的應 用。
[0005] 技術(shù)方案
[0006] 南瓜皮多糖，其特征在于其多糖含量在90 %以上，數(shù)均分子量2000~3000KDa;單 糖組成包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖;糖苷鍵鍵型有α或β鍵；
[0007] 所述的南瓜皮多糖的制備方法，其特征是由下列步驟組成：
[0008] Α、獲得粗提液:將取來的南瓜皮烘干，粉碎，加入1-10倍體積蒸餾水，45攝氏度水 浴3-5小時，過濾，濃縮；
[0009] Β、去除蛋白：所述的濃縮液與氯仿-正丁醇按體積比4:1混合，經(jīng)離心機離心lmin， 轉(zhuǎn)速為5000rpm/min，去除蛋白，保留下層溶液，其中所述的氯仿-正丁醇溶液為氯仿與正丁 醇按體積比為4:1混合形成的溶液;重復上述過程三次，濃縮，凍干，獲得的南瓜皮提取物； [0010] C、獲得南瓜皮多糖粗品：取南瓜皮提取物溶于20-50倍重量的水，加入D301-G大孔 樹脂，室溫下間歇攪拌1-3小時，濃縮后4000r. p .m離心去沉淀，向上清液中加入1-6倍體積 的無水乙醇，4°C放置24小時，離心除去上清液，用無水乙醇洗滌沉淀三次，干燥后得南瓜皮 多糖粗品；
[0011] D、獲得南瓜皮多糖:所述的南瓜皮多糖粗品，溶解于水，上DEAE-52陰離子交換柱， 去離子水洗脫后用lmol/L NaCl溶液洗脫，以硫酸苯酚法檢測，收集NaCl溶液洗脫峰，減壓 濃縮，流水透析24小時，濃縮后經(jīng)4倍乙醇沉淀，4°C放置，離心去上清，以無水乙醇洗滌三 次，真空干燥;將真空干燥后的樣品溶于去離子水，上已平衡好的Sephacryl S-400分子篩 凝膠柱，用去離子水洗脫，分部收集，以硫酸苯酚法檢測，收集洗脫峰，濃縮后經(jīng)凍干，獲得 南瓜皮多糖。
[0012] 所述的南瓜皮多糖在制備治療糖尿病藥物中的用途。
[0013] -種南瓜皮提取物在制備治療糖尿病藥物中的用途，其特征在于所述的南瓜皮提 取物為權(quán)利要求1中步驟B制備獲得。
[0014] 有益效果
[0015] 本發(fā)明在制備南瓜皮多糖過程中，分別采用氯仿-正丁醇溶液法和離子交換樹脂 進行純化的方法，去除蛋白更完全，然后再經(jīng)分子篩凝膠柱進一步精制，所得的南瓜皮多 糖，雜質(zhì)少，純度高;通過對南瓜皮多糖的分子量、純度、單糖組成、糖苷鍵鏈接方式等進行 結(jié)構(gòu)表征，獲得了南瓜皮多糖的詳細結(jié)構(gòu)信息；并對南瓜皮多糖和南瓜皮提取物的降血糖 活性，為南瓜皮多糖的應用提供新的思路。南瓜皮作為廢棄物，可以變廢為寶，擁有廣闊的 應用前景，具有良好的社會效益和經(jīng)濟效益。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1:
[0017] 本發(fā)明所述南瓜皮多糖的具體制備方法如下：
[0018] 1、將取來的南瓜皮烘干，稱得烘干后其重量為117.6克，然后將其搗碎，加入蒸餾 水，45攝氏度水浴3小時。用紗布過濾得濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對其蒸發(fā)濃縮。
[0019] 2、對濃縮液進行severge法去蛋白；具體過程為:粗多糖溶液與氯仿一正丁醇（預 先配制成體積比為4:1混合液)按體積比4:1的比例，置于具塞試管中，充分振搖30min后，經(jīng) 離心機離心lmin，轉(zhuǎn)速為5000r/min，然后將水相與氯仿相分開。將水相再加入相當于其體 積1/4的氯仿一正丁醇溶液，重復上述過程，共計重復三次，濃縮，凍干，獲得的南瓜皮提??；
[0020] 3、取南瓜皮水提物2g于容器中，充分溶解于100mL去離子水，加入D301-G大孔樹脂 脫色和除蛋白質(zhì)，間或攪拌3小時，溶液過濾后濃縮至10mL，加入60mL無水乙醇沉淀，4°C放 置24小時。離心除去上清。以無水乙醇洗滌3次，真空干燥得到南瓜皮多糖脫色產(chǎn)物；
[0021] 4、取南瓜皮多糖脫色產(chǎn)物200mg，充分溶解于去離子水，用平衡好的DEAE-52離子 交換柱分離，規(guī)格為（2.6 X 30cm)，平衡液為去離子水，上樣體積為10mL，先以300mL去離子 水洗脫，再以lmol/L的NaCl溶液洗脫，分部收集，硫酸苯酚法跟蹤檢測，合并相同組分。 [0022] (4)離子交換柱分離所得NaCl溶液洗脫組分進行Sephacryl S-400分子篩柱層析， 以去離子水洗脫。柱規(guī)格為（l.ox 100cm)，分部收集，硫酸苯酚法跟蹤檢測，合并相同組分。 冷凍干燥，得到南瓜皮多糖。
[0023] 南瓜皮多糖的純度和分子量通過高效分子排阻色譜法測S:WSh〇deXSUGARKS-805(8mmIDX 300mm)為高效液相色譜柱，采用示差折光檢測器;色譜條件為:H20為流動相， 流速lmL/min，樣品濃度為lmg/mL，每次進樣20yL，檢測時間20min。得到南瓜皮多糖的平均 分子量為2880KDa。
[0024] 南瓜皮多糖的紅外光譜，波數(shù)3442CHT1的強吸收峰是0-H的伸縮振動，2933CHT1吸 收峰是糖環(huán)C-H伸縮振動，lOOO-UOOcnf 1間的一系列吸收峰是由糖環(huán)上C-0的伸縮振動， 1743cnf1,1425(31^1和1257CHT1的吸收峰分別是醛酸基團的C = 0伸縮振動，C-0伸縮振動和0-H伸縮振動，855CHT1和895CHT1的吸收峰表明既有α構(gòu)型又有β構(gòu)型的糖單位。
[0025]南瓜皮多糖精品的單糖組成通過柱前衍生高效液相色譜法測定：以2mol/L三氟乙 酸水解，甲醇洗滌后蒸干，以去離子水溶解，水解液經(jīng)PMP衍生化后進行高效液相檢測;色譜 條件：色譜柱為waters synmetry C18(150mmX4.6mm)，流動相為乙酸銨(ρΗ5·5)/乙腈(70/ 30)，檢測波長為250nm。結(jié)果所示，根據(jù)保留時間和峰面積進行計算，并與單糖標準品進行 對照，可知南瓜皮多糖含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖。
[0026] 實施例2
[0027] 1、動物：由南京青龍山動物養(yǎng)殖場提供實驗用昆明小鼠，適應性喂養(yǎng)兩周，分組編 號。
[0028] STZ試劑（美國Sigma公司）（因 STZ易升華，整個配制過程應在冰盒上操作，通?，F(xiàn) 用現(xiàn)配，配好后30min內(nèi)用完）。血糖試紙(美國強生公司穩(wěn)豪倍易型試紙）（因 STZ易升華，整 個配制過程應在冰盒上操作，通?，F(xiàn)用現(xiàn)配，配好后30min內(nèi)用完）。
[0029] 血糖儀(美國強生公司穩(wěn)豪倍益型血糖儀）
[0030] 2、方法：
[0031] (1)隨機抽取5只小鼠為正常對照組（只注射等體積的生理鹽水），其余小鼠禁食不 禁水12小時后采用STZ方法誘導I型糖尿病模型，用150mg/kg劑量給小鼠腹腔注射，然后恢 復進食，三天后測其空腹血糖，血糖值大于11.6mmol/L則造模成功。后隨機取出5只為陰性 對照組（只注射等體積生理鹽水），再將剩余小鼠每組5只，分組；分別為南瓜皮提取物 300mg/kg、600mg/kg、900mg/kg、南瓜皮多糖 50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg 以及陽性對照組 (0 · 5U/ml胰島素，以0 · 054ml/10g劑量給藥），結(jié)果如下：
[0032]表1南瓜皮中南瓜多糖和胰島素藥物對糖尿病小鼠血糖的影響
[0034] 注：與糖尿病模型比較P<0.05，"#"與糖尿病模型比較P<0.01
[0035]說明：本發(fā)明南瓜皮多糖或南瓜皮提取物與陰性對照組（即模型組)相比，具有劑 量依賴關(guān)系，同時通過數(shù)據(jù)可知，高劑量與陽性對照組(胰島素相當）。從上述數(shù)據(jù)看出，南 瓜皮多糖為南瓜皮提取物的主要活性成分。同時，作為口服來說，其劑量很小，適合于開發(fā) 保健品或藥品。
【主權(quán)項】
1. 南瓜皮多糖，其特征在于其多糖含量在90%以上，數(shù)均分子量2000~3000KDa;單糖組 成包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的南瓜皮多糖的制備方法，其特征是由下列步驟組成： A、 獲得粗提液:將取來的南瓜皮烘干，粉碎，加入1-10倍體積蒸餾水，45攝氏度水浴3-5 小時，過濾，濃縮； B、 去除蛋白：所述的濃縮液與氯仿-正丁醇按體積比4:1混合，經(jīng)離心機離心Imin，轉(zhuǎn)速 為5000rpm/min，去除蛋白，保留下層溶液，其中所述的氯仿-正丁醇溶液為氯仿與正丁醇按 體積比為4:1混合形成的溶液;重復上述過程三次，濃縮，凍干，獲得的南瓜皮提取物； C、 獲得南瓜皮多糖粗品：取南瓜皮提取物溶于20-50倍重量的水，加入D301-G大孔樹 月旨，室溫下間歇攪拌1 -3小時，濃縮后4000r. p. m離心去沉淀，向上清液中加入1 -6倍體積的 無水乙醇，4°C放置24小時，離心除去上清液，用無水乙醇洗滌沉淀三次，干燥后得南瓜皮多 糖粗品； D、 獲得南瓜皮多糖:所述的南瓜皮多糖粗品，溶解于水，上DEAE-52陰離子交換柱，去離 子水洗脫后用lmol/L NaCl溶液洗脫，以硫酸苯酚法檢測，收集NaCl溶液洗脫峰，減壓濃縮， 流水透析24小時，濃縮后經(jīng)4倍乙醇沉淀，4°C放置，離心去上清，以無水乙醇洗滌三次，真空 干燥;將真空干燥后的樣品溶于去離子水，上已平衡好的Sephacryl S-400分子篩凝膠柱， 用去離子水洗脫，分部收集，以硫酸苯酚法檢測，收集洗脫峰，濃縮后經(jīng)凍干，獲得南瓜皮多 糖。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的南瓜皮多糖在制備治療糖尿病藥物中的用途。4. 一種南瓜皮提取物在制備治療糖尿病藥物中的用途，其特征在于所述的南瓜皮提取 物為權(quán)利要求1中步驟B制備獲得。
【文檔編號】C08B37/00GK105884925SQ201610259947
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月25日
【發(fā)明人】李偉光, 馮昇, 錢景怡, 王詩豪, 田欣, 魏怡超, 王森怡
【申請人】中國藥科大學