一種肝素鈉的提純方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種肝素鈉的提純方法，該制備方法包括酶解、過濾、酶解蛋白、去除蛋白、沉淀脫水、干燥，獲得肝素鈉精品，本方法具有周期較短、生產(chǎn)成本較低、收率較高、毒害物質(zhì)產(chǎn)生較少。
【專利說明】
一種肝素鈉的提純方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種肝素及其衍生物的提純方法，特別地涉及一種肝素鈉的提純方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素鈉是粘多糖硫酸脂類抗凝血藥、栓塞性疾病的首用藥物，能夠防治深層靜脈血栓形成。隨著研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)肝素鈉不僅有抗凝、抗血栓形成、調(diào)整血脂的作用，還有抗炎、抗過敏、抗病毒等多種生物學(xué)功能。
[0003]肝素是由糠醛酸和氨基葡萄糖以1-4糖苷鍵連起來的重復(fù)二糖單元組成的線性粘多糖，其廣泛分布于哺乳動(dòng)物的組織中，由結(jié)締組織性肥大細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生。肝素在動(dòng)物體內(nèi)大部分以肝素鈉-蛋白復(fù)合物的形式存在。由于肝素鈉解離不完全，肝素提取方法會(huì)殘留以共價(jià)鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)和以靜電結(jié)合的帶正電蛋白質(zhì)。
[0004]目前，肝素鈉的提純方法一般是，對動(dòng)物小腸刮取，得到粘液；酶解該粘液，過濾，用樹脂吸附，洗脫，用乙醇沉淀，脫水，烘干，得到肝素鈉產(chǎn)品。上述現(xiàn)有工藝具有收率低、損失大、污染嚴(yán)重等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述現(xiàn)有工藝的缺陷，本發(fā)明提供了一種肝素鈉的提純方法，其具備工藝簡單、收率較高、廢液排放量較低、適于工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)。
[0006]為了達(dá)到上述優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明具體采用了如下技術(shù)方案。
[0007]一種肝素鈉的提純方法，其步驟包括:
[0008]I)將固液比約為2: 9的豬的小腸粘膜液抽入反應(yīng)罐，用工業(yè)堿調(diào)pH至9.0?10.0,加入3%?5% (重量比)的氯化鈉，加入重量相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶,混勻，升溫至56?60°C，恒溫下攪拌I?3小時(shí)，升溫至70?80°C，保溫20?25分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0009]2)將上述步驟I的冷卻液用抽濾機(jī)過濾2次，用2 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，用
0.22 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，除去雜質(zhì),取濾液；
[0010]3)調(diào)節(jié)濾液的pH至6.5?7.4，升溫至60°C，加入相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，60°C下攪拌4?7小時(shí)，升溫至96°C，保溫16分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0011]4)將上述步驟3的冷卻液用微濾膜過濾，濃縮，得到濃縮液；
[0012]5)加入與上述濃縮液相同體積的85%?90%乙醇到上述濃縮液中，攪拌，沉淀10?12小時(shí)，除去上清液，收集沉淀，加入與上述濃縮液相同體積的無水乙醇，干燥，得到肝素鈉產(chǎn)品。
[0013]本發(fā)明具備如下優(yōu)點(diǎn):
[0014]I)取消樹脂吸附步驟，降低了操作的難度，簡化了工藝；
[0015]2)加入用微孔濾膜過濾，能降低肝素鈉中雜質(zhì)，提高產(chǎn)品收率。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0017]實(shí)施例1
[0018]I)將固液比約為2: 9的豬的小腸粘膜液抽入反應(yīng)罐，用工業(yè)堿調(diào)pH至9.0,加入3% (重量比)的氯化鈉，加入重量相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，混勻，升溫至56°C，恒溫下攪拌I小時(shí)，升溫至70°C，保溫20分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0019]2)將上述步驟I的冷卻液用抽濾機(jī)過濾2次，用2 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，用
0.22 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，除去雜質(zhì),取濾液；
[0020]3)調(diào)節(jié)濾液的pH至6.5，升溫至60°C，加入相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，60°C下攪拌4小時(shí)，升溫至96°C，保溫16分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0021]4)將上述步驟3的冷卻液用微濾膜過濾，濃縮，得到濃縮液；
[0022]5)加入與上述濃縮液相同體積的85%乙醇到上述濃縮液中，攪拌，沉淀10小時(shí)，除去上清液，收集沉淀，加入與上述濃縮液相同體積的無水乙醇，干燥，得到肝素鈉產(chǎn)品。
[0023]實(shí)施例2
[0024]I)將固液比約為2: 9的豬的小腸粘膜液抽入反應(yīng)罐，用工業(yè)堿調(diào)pH至10.0，加入5% (重量比)的氯化鈉，加入重量相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，混勻，升溫至60°C，恒溫下攪拌3小時(shí)，升溫至80°C，保溫25分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0025]2)將上述步驟I的冷卻液用抽濾機(jī)過濾2次，用2 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，用
0.22 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，除去雜質(zhì),取濾液；
[0026]3)調(diào)節(jié)濾液的pH至7.4，升溫至60°C，加入相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，60°C下攪拌7小時(shí)，升溫至96°C，保溫16分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0027]4)將上述步驟3的冷卻液用微濾膜過濾，濃縮，得到濃縮液；
[0028]5)加入與上述濃縮液相同體積的90%乙醇到上述濃縮液中，攪拌，沉淀12小時(shí)，除去上清液，收集沉淀，加入與上述濃縮液相同體積的無水乙醇，干燥，得到肝素鈉產(chǎn)品。
[0029]實(shí)施例3
[0030]I)將固液比約為2: 9的豬的小腸粘膜液抽入反應(yīng)罐，用工業(yè)堿調(diào)pH至9.2，加入3.5% (重量比)的氯化鈉，加入重量相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，混勻，升溫至57°C，恒溫下攪拌1.5小時(shí)，升溫至75°C，保溫20分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0031]2)將上述步驟I的冷卻液用抽濾機(jī)過濾2次，用2 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，用
0.22 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，除去雜質(zhì),取濾液；
[0032]3)調(diào)節(jié)濾液的pH至6.7，升溫至60°C，加入相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，60°C下攪拌4.2小時(shí)，升溫至96°C，保溫16分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0033]4)將上述步驟3的冷卻液用微濾膜過濾，濃縮，得到濃縮液；
[0034]5)加入與上述濃縮液相同體積的87%乙醇到上述濃縮液中，攪拌，沉淀10.5小時(shí)，除去上清液，收集沉淀，加入與上述濃縮液相同體積的無水乙醇，干燥，得到肝素鈉產(chǎn)品。
[0035]實(shí)施例4
[0036]I)將固液比約為2: 9的豬的小腸粘膜液抽入反應(yīng)罐，用工業(yè)堿調(diào)pH至9.8，加入4% (重量比)的氯化鈉，加入重量相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，混勻，升溫至58°C，恒溫下攪拌2.5小時(shí)，升溫至75°C，保溫23分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0037]2)將上述步驟I的冷卻液用抽濾機(jī)過濾2次，用2 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，用
0.22 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，除去雜質(zhì),取濾液；
[0038]3)調(diào)節(jié)濾液的pH至6.9，升溫至60°C，加入相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，60°C下攪拌5小時(shí)，升溫至96°C，保溫16分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0039]4)將上述步驟3的冷卻液用微濾膜過濾，濃縮，得到濃縮液；
[0040]5)加入與上述濃縮液相同體積的88%乙醇到上述濃縮液中，攪拌，沉淀12小時(shí)，除去上清液，收集沉淀，加入與上述濃縮液相同體積的無水乙醇，干燥，得到肝素鈉產(chǎn)品。
[0041]實(shí)施例5
[0042]I)將固液比約為2: 9的豬的小腸粘膜液抽入反應(yīng)罐，用工業(yè)堿調(diào)pH至9.9，加入4.5% (重量比)的氯化鈉，加入重量相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，混勻，升溫至57°C，恒溫下攪拌2.6小時(shí)，升溫至79°C，保溫24分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0043]2)將上述步驟I的冷卻液用抽濾機(jī)過濾2次，用2 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，用
0.22 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，除去雜質(zhì),取濾液；
[0044]3)調(diào)節(jié)濾液的pH至6.6，升溫至60°C，加入相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，60°C下攪拌5小時(shí)，升溫至96°C，保溫16分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0045]4)將上述步驟3的冷卻液用微濾膜過濾，濃縮，得到濃縮液；
[0046]5)加入與上述濃縮液相同體積的90%乙醇到上述濃縮液中，攪拌，沉淀10?12小時(shí)，除去上清液，收集沉淀，加入與上述濃縮液相同體積的無水乙醇，干燥，得到肝素鈉產(chǎn)品。
[0047]實(shí)施例6
[0048]I)將固液比約為2: 9的豬的小腸粘膜液抽入反應(yīng)罐，用工業(yè)堿調(diào)pH至9.6，加入4.9% (重量比)的氯化鈉，加入重量相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，混勻，升溫至57°C，恒溫下攪拌2.7小時(shí)，升溫至73°C，保溫25分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0049]2)將上述步驟I的冷卻液用抽濾機(jī)過濾2次，用2 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，用
0.22 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，除去雜質(zhì),取濾液；
[0050]3)調(diào)節(jié)濾液的pH至7.2，升溫至60°C，加入相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，60°C下攪拌6.7小時(shí)，升溫至96°C，保溫16分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0051]4)將上述步驟3的冷卻液用微濾膜過濾，濃縮，得到濃縮液；
[0052]5)加入與上述濃縮液相同體積的88%乙醇到上述濃縮液中，攪拌，沉淀11.5小時(shí)，除去上清液，收集沉淀，加入與上述濃縮液相同體積的無水乙醇，干燥，得到肝素鈉產(chǎn)品。
[0053]實(shí)施例7
[0054]I)將固液比約為2: 9的豬的小腸粘膜液抽入反應(yīng)罐，用工業(yè)堿調(diào)pH至9.1，加入4.4% (重量比)的氯化鈉，加入重量相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，混勻，升溫至59°C，恒溫下攪拌I?3小時(shí)，升溫至79°C，保溫23分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0055]2)將上述步驟I的冷卻液用抽濾機(jī)過濾2次，用2 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，用
0.22 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，除去雜質(zhì),取濾液；
[0056]3)調(diào)節(jié)濾液的pH至6.7，升溫至61°C，加入相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，60°C下攪拌4?7小時(shí)，升溫至97°C，保溫16分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0057]4)將上述步驟3的冷卻液用微濾膜過濾，濃縮，得到濃縮液；
[0058]5)加入與上述濃縮液相同體積的88%乙醇到上述濃縮液中，攪拌，沉淀10.8小時(shí)，除去上清液，收集沉淀，加入與上述濃縮液相同體積的無水乙醇，干燥，得到肝素鈉產(chǎn)品。
[0059]實(shí)施例8
[0060]I)將固液比約為2: 9的豬的小腸粘膜液抽入反應(yīng)罐，用工業(yè)堿調(diào)pH至9.9，加入4.8% (重量比)的氯化鈉，加入重量相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，混勻，升溫至57°C，恒溫下攪拌1.5小時(shí)，升溫至77°C，保溫25分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0061]2)將上述步驟I的冷卻液用抽濾機(jī)過濾2次，用2 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，用
0.22 um微孔濾膜過濾，取濾液，除去雜質(zhì),取濾液；
[0062]3)調(diào)節(jié)濾液的pH至7.1，升溫至60°C，加入相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，60°C下攪拌5.2小時(shí)，升溫至96°C，保溫17分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0063]4)將上述步驟3的冷卻液用微濾膜過濾，濃縮，得到濃縮液；
[0064]5)加入與上述濃縮液相同體積的90%乙醇到上述濃縮液中，攪拌，沉淀10.8小時(shí)，除去上清液，收集沉淀，加入與上述濃縮液相同體積的無水乙醇，干燥，得到肝素鈉產(chǎn)品。
[0065]實(shí)施例9
[0066]I)將固液比約為2: 9的豬的小腸粘膜液抽入反應(yīng)罐，用工業(yè)堿調(diào)pH至9.8，加入3.7% (重量比)的氯化鈉，加入重量相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，混勻，升溫至57°C，恒溫下攪拌3小時(shí)，升溫至74°C，保溫20?25分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0067]2)將上述步驟I的冷卻液用抽濾機(jī)過濾2次，用2 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，用
0.22 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，除去雜質(zhì),取濾液；
[0068]3)調(diào)節(jié)濾液的pH至7.3，升溫至60°C，加入相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，60°C下攪拌6.5小時(shí)，升溫至96°C，保溫16分鐘，冷卻，得到冷卻液；
[0069]4)將上述步驟3的冷卻液用微濾膜過濾，濃縮，得到濃縮液；
[0070]5)加入與上述濃縮液相同體積的89%乙醇到上述濃縮液中，攪拌，沉淀11.9小時(shí)，除去上清液，收集沉淀，加入與上述濃縮液相同體積的無水乙醇，干燥，得到肝素鈉產(chǎn)品。
[0071]顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明實(shí)施方式的限定。對于所述領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引申出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種肝素鈉的提純方法，其特征在于，其步驟包括: 1)將固液比約為2: 9的豬的小腸粘膜液抽入反應(yīng)罐，用工業(yè)堿調(diào)pH至9.0?10.0，加入3%?5% (重量比)的氯化鈉，加入重量相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，混勻，升溫至56?60°C，恒溫下攪拌1?3小時(shí)，升溫至70?80°C，保溫20?25分鐘，冷卻，得到冷卻液； 2)將上述步驟I的冷卻液用抽濾機(jī)過濾2次，用2μπι微孔濾膜過濾，取濾液，用0.22 um微孔濾膜過濾，取濾液，除去雜質(zhì),取濾液； 3)調(diào)節(jié)濾液的pH至6.5?7.4，升溫至60°C，加入相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，60°C下攪拌4?7小時(shí)，升溫至96°C，保溫16分鐘，冷卻，得到冷卻液； 4)將上述步驟3的冷卻液用微濾膜過濾，濃縮，得到濃縮液； 5)加入與上述濃縮液相同體積的85%?90%乙醇到上述濃縮液中，攪拌，沉淀10?12小時(shí)，除去上清液，收集沉淀，加入與上述濃縮液相同體積的無水乙醇，干燥，得到肝素鈉產(chǎn)品。2.如權(quán)利要求1所述肝素鈉的提純方法，其特征在于，其步驟包括: 1)將固液比約為2: 9的豬的小腸粘膜液抽入反應(yīng)罐，用工業(yè)堿調(diào)pH至9.0，加入3%(重量比)的氯化鈉，加入重量相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，混勻，升溫至56°C，恒溫下攪拌I小時(shí)，升溫至70°C，保溫20分鐘，冷卻，得到冷卻液； 2)將上述步驟I的冷卻液用抽濾機(jī)過濾2次，用2μπι微孔濾膜過濾，取濾液，用0.22 um微孔濾膜過濾，取濾液，除去雜質(zhì),取濾液； 3)調(diào)節(jié)濾液的pH至6.5，升溫至60°C，加入相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，60°C下攪拌4小時(shí)，升溫至96°C，保溫16分鐘，冷卻，得到冷卻液； 4)將上述步驟3的冷卻液用微濾膜過濾，濃縮，得到濃縮液； 5)加入與上述濃縮液相同體積的85%乙醇到上述濃縮液中，攪拌，沉淀10小時(shí)，除去上清液，收集沉淀，加入與上述濃縮液相同體積的無水乙醇，干燥，得到肝素鈉產(chǎn)品。3.如權(quán)利要求1所述肝素鈉的提純方法，其特征在于，其步驟包括: 1)將固液比約為2: 9的豬的小腸粘膜液抽入反應(yīng)罐，用工業(yè)堿調(diào)pH至9.0?10.0，加入5% (重量比)的氯化鈉，加入重量相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，混勻，升溫至60°C，恒溫下攪拌3小時(shí)，升溫至80°C，保溫25分鐘，冷卻，得到冷卻液； 2)將上述步驟I的冷卻液用抽濾機(jī)過濾2次，用2μπι微孔濾膜過濾，取濾液，用.0.22 um微孔濾膜過濾，取濾液，除去雜質(zhì),取濾液； 3)調(diào)節(jié)濾液的pH至7.4，升溫至60°C，加入相當(dāng)于0.5%原料重量的活性酶，60°C下攪拌7小時(shí)，升溫至96°C，保溫16分鐘，冷卻，得到冷卻液； 4)將上述步驟3的冷卻液用微濾膜過濾，濃縮，得到濃縮液； 5)加入與上述濃縮液相同體積的90%乙醇到上述濃縮液中，攪拌，沉淀12小時(shí)，除去上清液，收集沉淀，加入與上述濃縮液相同體積的無水乙醇，干燥，得到肝素鈉產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】C08B37/10GK105884935SQ201410550143
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年10月17日
【發(fā)明人】楊軍
【申請人】北京海吉星醫(yī)療科技有限公司