一種漆酶-tempo法制備絲膠蛋白膜的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種漆酶?TEMPO法制備絲膠蛋白膜的方法，以漆酶催化氧化絲膠中酪氨酸殘基生成醌類活性基，引發(fā)絲膠分子間交聯(lián)，再加入2,2,6,6?四甲基哌啶?氮?氧化物(TEMPO)和聚賴氨酸，通過氧化絲膠中絲氨酸殘基生成醛基，促進(jìn)絲膠蛋白與聚賴氨酸交聯(lián)，提高絲膠蛋白膜的成型效果和抗菌性能。具體步驟如下：(1)漆酶催化氧化絲膠分子交聯(lián)；(2)漆酶?TEMPO催化絲膠接枝聚賴氨酸；(3)絲膠蛋白膜成型；(4)絲膠蛋白膜醇化后處理。與傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)法制備絲膠蛋白膜相比，本發(fā)明中漆酶和TEMPO催化聚賴氨酸接枝的效率高，生物酶處理?xiàng)l件緩和，絲膠蛋白膜成型效果較好，斷裂強(qiáng)度和抗菌性能明顯增加。
【專利說明】
一種漆酶-TEMPO法制備絲膠蛋白膜的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種漆酶-TEMPO法制備絲膠蛋白膜的方法，特別是一種先以漆酶催化氧化絲膠中酪氨酸殘基，引發(fā)絲膠分子間交聯(lián)，再加入2，2，6，6_四甲基哌啶-氮-氧化物(TEMPO)和聚賴氨酸，通過氧化絲膠中絲氨酸殘基，促進(jìn)絲膠蛋白與聚賴氨酸交聯(lián)，提高絲膠蛋白膜的成型效果和抗菌性能，屬于紡織生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蠶絲由絲素和覆蓋在絲素表面的絲膠兩部分組成。其中，絲素蛋白呈線性結(jié)構(gòu)，含較多非極性氨基酸;絲膠為球形蛋白，含較多親水性氨基酸，以無規(guī)卷曲為主，幾乎無α螺旋結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)較松散。在蠶絲脫膠過程中，絲膠溶解于熱水，多作為廢棄物直接排放到工業(yè)廢水中，造成了極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境壓力。絲膠中極性氨基酸殘基較多，包括含醇羥基的絲氨酸和蘇氨酸、含羧基的谷氨酸和天門冬氨酸、含酚羥基的酪氨酸和含氨基的賴氨酸等。研究表明，絲膠有多種生物活性，可清除活性氧物質(zhì)、能抗紫外線和抑制黑色素生成，在日化領(lǐng)域有潛在應(yīng)用。但另一方面，由于絲膠水溶性高，其成型難度較大，不同程度上制約了絲膠再生生物材料的制備及在更廣領(lǐng)域的應(yīng)用。為改善絲膠蛋白材料的成型效果，研究人員采用與其他高分子共混、物理包埋或化學(xué)交聯(lián)(如戊二醛、京尼平等)等方法，制備絲膠基生物材料。其中，化學(xué)交聯(lián)法效率較高，能有效提高絲膠成型性，但也存在一定的不足，如部分交聯(lián)劑殘留會使絲膠材料的生物相容性下降。與之相比，生物酶法具有安全、高效、專一和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，符合生態(tài)加工的要求。因此，若借助生物酶進(jìn)行絲膠改性，通過催化絲膠分子交聯(lián)降低其水溶性，提高絲膠材料的成型效果，同時(shí)催化絲膠接枝外源功能性氨基化合物，還可進(jìn)一步提升絲膠蛋白材料的應(yīng)用性能。
[0003]對絲膠有作用功效的生物酶品種較多，其中漆酶作為一種多酚氧化酶，不僅能單獨(dú)催化氧化絲膠中的酪氨酸殘基，還可與特殊介體2，2，6，6-四甲基哌啶-氮-氧化物(TEMPO)組成氧化體系，催化絲膠中絲氨酸殘基生成反應(yīng)性醛基。根據(jù)漆酶的這一特性，在絲膠蛋白膜制備中，采用如下分步法進(jìn)行:
[0004]第一步，先以漆酶處理絲膠，通過催化氧化絲膠中酪氨酸的酚羥基產(chǎn)生醌類活性基，并與絲膠中氨基反應(yīng)，引發(fā)絲膠分子間交聯(lián)，增加絲膠蛋白的分子量；
[0005]第二步，再在體系中加入TEMPO和聚賴氨酸，通過漆酶-TEMPO體系氧化絲膠中絲氨酸的醇羥基，產(chǎn)生反應(yīng)性醛基，并與聚賴氨酸的氨基或絲膠分子上的游離氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng)，在提高絲膠分子量和蛋白膜成型效果的同時(shí)，還能通過接枝聚賴氨酸，賦予絲膠蛋白膜抗菌性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種漆酶-TEMPO法制備絲膠蛋白膜的方法，旨在改善絲膠材料的成型效果，提高其抗菌性能，拓展絲膠材料的應(yīng)用。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明先以漆酶催化氧化絲膠中酪氨酸殘基，生成醌類活性基，引發(fā)絲膠分子間交聯(lián)，再加入TEMPO和聚賴氨酸，通過氧化絲膠中絲氨酸殘基生成醛基，促進(jìn)絲膠蛋白與聚賴氨酸交聯(lián)，提高絲膠蛋白膜的成型效果和抗菌性能，具體工藝和步驟如下:
[0008](I)漆酶催化氧化絲膠分子交聯(lián):在絲膠溶液中添加漆酶，其中絲膠5?50g/L，漆酶5?50U/mL，處理溫度30?60°C，pH 4.0?7.0，時(shí)間0.5?10小時(shí)；
[0009](2)漆酶-TEMPO催化絲膠接枝聚賴氨酸:在步驟(I)體系中加入TEMPO至2?50g/L，聚賴氨酸2?20g/L，在30?60°C，pH 4.0?7.0條件下處理2?24小時(shí)；
[0010](3)絲膠蛋白膜成型:取步驟(2)反應(yīng)后溶液，通過延流使其在聚四氟乙烯模具內(nèi)平整鋪展，在20?50 °C條件下風(fēng)干成膜，或在-50 °C?-20 °C條件下真空冷凍干燥成膜；
[0011](4)絲膠蛋白膜醇化后處理:將步驟(3)處理后絲膠蛋白膜浸漬在50?80% (v/v)的乙醇溶液中，在20?25°C處理0.5?2小時(shí)，然后在20?50°C條件下烘干。
[0012]一種漆酶-TEMPO法制備絲膠蛋白膜的方法，所述絲膠包括來源于桑蠶絲或柞蠶絲，并借助純堿法、皂堿法、蛋白酶法或100?125°C高溫法獲取的絲膠;所述漆酶來源于動(dòng)物、植物或微生物;所述聚賴氨酸包括不同分子量的ε_聚賴氨酸或α-聚賴氨酸。
[0013]本發(fā)明借助于漆酶、TEMPO和聚賴氨酸，通過漆酶催化氧化絲膠，引發(fā)絲膠分子間交聯(lián)，結(jié)合TEMPO體系氧化絲膠中絲氨酸殘基接枝聚賴氨酸，制備具有抗菌效果的絲膠蛋白膜。與傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)法制備絲膠蛋白膜相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0014](I)漆酶和TEMPO催化效率高，漆酶不僅可單獨(dú)催化氧化絲膠中酪氨酸殘基，引發(fā)絲膠自交聯(lián)，而且可通過漆酶-TEMPO體系氧化絲膠中的絲氨酸產(chǎn)生醛基，促進(jìn)含氨基的聚賴氨酸在絲膠蛋白分子表面接枝，提高了絲膠蛋白膜的成型效果；
[0015](2)生物酶處理?xiàng)l件緩和，在低溫和近中性條件下進(jìn)行絲膠蛋白漆酶催化改性加工，具有能耗低、處理工藝安全的優(yōu)點(diǎn)，避免了化學(xué)交聯(lián)法反應(yīng)易造成環(huán)境污染、絲膠易產(chǎn)生蛋白變性等諸多方面的缺陷；
[0016](3)絲膠蛋白經(jīng)漆酶處理、漆酶-TEMPO催化接枝聚賴氨酸后，其絲膠蛋白膜的水溶性顯著下降，成型效果改善，結(jié)合催化接枝聚賴氨酸后，絲膠膜機(jī)械強(qiáng)力增加，抗菌性能也得到提高。
【具體實(shí)施方式】
[0017]采用漆酶、TEMPO和聚賴氨酸制備絲膠蛋白膜，具體實(shí)施例如下:
[0018]實(shí)施例1
[0019]采用桑蠶絲經(jīng)純堿法脫膠后得到的絲膠，以本發(fā)明述及的方法制備絲膠蛋白膜，具體工藝步驟如下:
[0020](I)漆酶催化氧化絲膠分子交聯(lián):在絲膠溶液中添加漆酶，其中絲膠20g/L，漆酶5U/mL，處理溫度45°C，pH 5，時(shí)間2小時(shí)；
[0021](2)漆酶-TEMPO催化絲膠接枝聚賴氨酸:在步驟(I)體系中加入TEMPO至10g/L，e_聚賴氨酸(分子量3000)5g/L，在45°C，pH 5條件下處理12小時(shí)；
[0022](3)絲膠蛋白膜成型:取步驟(2)反應(yīng)后溶液，通過延流使其在聚四氟乙烯模具內(nèi)平整鋪展，在30°C條件下風(fēng)干成膜；
[0023](4)絲膠蛋白膜醇化后處理:將步驟(3)處理后絲膠蛋白膜浸漬在60% (v/v)的乙醇溶液中，在25°C處理0.5小時(shí)，然后在30°C條件下烘干。
[0024]試樣1:絲膠未經(jīng)漆酶、TEMPO和ε-聚賴氨酸處理，僅經(jīng)絲膠蛋白膜成型和醇化后處理；
[0025]試樣2:絲膠僅以漆酶處理，然后經(jīng)絲膠蛋白膜成型和醇化后處理；
[0026]試樣3:經(jīng)步驟(1)、(2)、(3)和(4);
[0027]經(jīng)上述工藝處理后，分別測定絲膠蛋白膜試樣I?3的熱水溶失率(30°C水中浸漬I小時(shí))、試樣斷裂強(qiáng)度、對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率;結(jié)果表明，試樣I的熱水溶失率為39.0%,斷裂強(qiáng)度為4.1MPa，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別為10 %和8% ；試樣2的熱水溶失率為12.1 %，斷裂強(qiáng)度為4.9MPa，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別為8 %和9 % ;試樣3的熱水溶失率為7.5%,斷裂強(qiáng)度為7.8MPa，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別為95%和96%。
[0028]實(shí)施例2
[0029]采用桑蠶絲經(jīng)120°C條件下脫膠后得到的絲膠，以本發(fā)明述及的方法制備絲膠蛋白膜，具體工藝步驟如下:
[0030](I)漆酶催化氧化絲膠分子交聯(lián):在絲膠溶液中添加漆酶，其中絲膠25g/L，漆酶
15U/mL，處理溫度50°C，pH 5.5，時(shí)間2小時(shí)；
[0031 ] (2)漆酶-TEMPO催化絲膠接枝聚賴氨酸:在步驟(I)體系中加入TEMPO至12.5g/L，ε -聚賴氨酸(分子量3600) 7.5g/L，在50 °C，pH 5.5條件下處理1小時(shí)；
[0032](3)絲膠蛋白膜成型:取步驟(2)反應(yīng)后溶液，通過延流使其在聚四氟乙烯模具內(nèi)平整鋪展，在_50°C條件下真空冷凍干燥成膜；
[0033](4)絲膠膜醇化后處理:將步驟(3)處理后的絲膠蛋白膜浸漬在65% (v/v)的乙醇溶液中，在25 °C醇化處理I小時(shí)，然后在30 °C條件下烘干。
[0034]試樣4:未經(jīng)漆酶、TEMPO和ε-聚賴氨酸處理，僅經(jīng)絲膠蛋白膜成型；
[0035]試樣5:未經(jīng)漆酶、TEMPO和ε-聚賴氨酸處理，僅經(jīng)絲膠蛋白膜成型和醇化后處理；
[0036]試樣6:絲膠僅以漆酶處理，然后經(jīng)絲膠蛋白膜成型和醇化后處理；；
[0037]試樣7:經(jīng)步驟(1)、(2)、(3)和(4);
[0038]經(jīng)上述工藝處理后，分別測定絲膠蛋白膜試樣4?7的熱水溶失率(30°C水中浸漬I小時(shí))、斷裂強(qiáng)度、對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率。結(jié)果表明，試樣4的熱水溶失率為80.3%，斷裂強(qiáng)度為1.9MPa，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別為2 %和5 % ;試樣5的熱水溶失率為42.6%,斷裂強(qiáng)度為4.1MPa，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別為5%和4% ;試樣6的熱水溶失率為10.5%,斷裂強(qiáng)度為5.2MPa，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別為7%和6% ;試樣7的熱水溶失率為6.8%，斷裂強(qiáng)度為7.1MPa，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別為94%和97%。
[0039]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種漆酶-TEMPO法制備絲膠蛋白膜的方法，特別是一種先以漆酶催化氧化絲膠中酪氨酸殘基，生成醌類活性基，引發(fā)絲膠分子間交聯(lián)，再加入2，2，6，6-四甲基哌啶-氮-氧化物(TEMPO)和聚賴氨酸，通過氧化絲膠中絲氨酸殘基生成醛基，促進(jìn)絲膠蛋白與聚賴氨酸交聯(lián)，提高絲膠蛋白膜的成型效果和抗菌性能，具體工藝與步驟如下: (1)漆酶催化氧化絲膠分子交聯(lián):在絲膠溶液中添加漆酶，其中絲膠5?50g/L，漆酶5?50U/mL，處理溫度30?60 °C，pH 4.0?7.0，時(shí)間0.5?1小時(shí)； (2)漆酶-TEMPO催化絲膠接枝聚賴氨酸:在步驟(I)體系中加入TEMPO至2?50g/L，聚賴氨酸2?20g/L，在30?60°C，pH 4.0?7.0條件下處理2?24小時(shí)； (3)絲膠蛋白膜成型:取步驟(2)反應(yīng)后溶液，通過延流使其在聚四氟乙烯模具內(nèi)平整鋪展，在20?50 °C條件下風(fēng)干成膜，或在-50 °C?-20 °C條件下真空冷凍干燥成膜； (4)絲膠蛋白膜醇化后處理:將步驟(3)處理后絲膠蛋白膜浸漬在50?80%(v/v)的乙醇溶液中，在20?25°C處理0.5?2小時(shí)，然后在20?50°C條件下烘干。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述絲膠來源于桑蠶絲或柞蠶絲，并借助純堿法、皂堿法、蛋白酶法或100?125°C高溫法獲取的絲膠;所述漆酶來源于動(dòng)物、植物或微生物;所述聚賴氨酸包括不同分子量的ε_聚賴氨酸或α-聚賴氨酸。
【文檔編號】C08J5/18GK105885073SQ201610316456
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】王平, 張謙, 季吉, 王強(qiáng), 范雪榮
【申請人】江南大學(xué)