一種高密度培養(yǎng)乳酸菌的自動反饋補料方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高密度培養(yǎng)乳酸菌的自動反饋補料方法，屬于微生物發(fā)酵工程領域。本發(fā)明在乳酸菌的培養(yǎng)過程中，根據(jù)pH值自動添加堿液維持培養(yǎng)體系的中性環(huán)境，并將補料泵與補堿泵進行關聯(lián)，使補料培養(yǎng)基與堿液按照一定比例自動地添加到培養(yǎng)體系中，確保了培養(yǎng)體系中底物濃度的穩(wěn)定性。本發(fā)明不僅保證了菌體對底物的需求，又使底物根據(jù)菌體的消耗自動的添加而不過量。本發(fā)明方法適用于干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌等所有的同型發(fā)酵乳桿菌，以及兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌等所有的雙歧桿菌。
【專利說明】
一種高密度培養(yǎng)乳酸菌的自動反饋補料方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種高密度培養(yǎng)乳酸菌的自動反饋補料方法，屬于微生物發(fā)酵工程領 域。
【背景技術】
[0002] 乳酸菌通過自身的代謝不僅可以提高發(fā)酵食品的品質，改善其風味，還可以改善 人類身體健康。乳酸菌被廣泛地應用到發(fā)酵乳制品、發(fā)酵香腸、發(fā)酵果蔬、直投式泡菜等發(fā) 酵食品。近幾十年來，乳酸菌的功能性研究也得到廣泛的關注，改善腸胃，治療便秘，拮抗腸 炎，提高免疫等的功能性益生菌劑深受廣大消費者的喜愛。提高乳酸菌的生產效率，高密度 培養(yǎng)乳酸菌對乳酸菌產品的推廣非常重要。
[0003] 多種高密度培養(yǎng)乳酸菌的方法被研究開發(fā)，包括優(yōu)化培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件、中 和培養(yǎng)、透析培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、膜過濾培養(yǎng)等。其中應用最為廣泛的是通過補 加堿液控制培養(yǎng)過程pH值，解除酸抑制的中和培養(yǎng)。在此基礎上為了提高菌體濃度，多種流 加補料方式被提出：間歇流加，恒速流加和指數(shù)流加。間歇流加需要不定時地取樣測定培養(yǎng) 基中葡萄糖的含量，當檢測不到糖時，向培養(yǎng)基中補加一定濃度的補料培養(yǎng)基。此流加方式 不僅需要消耗人力，并且不能準確把握底物的消耗情況。在對數(shù)生長期，菌體對葡萄糖的消 耗速度很快，在兩次對底物的取樣測定間期會出現(xiàn)底物不足的情況，影響菌體的生長速率。 當補料時，一次性補入的底物濃度較高，會引起培養(yǎng)體系滲透壓驟高，同樣會影響菌體的生 長。恒速流加是固定補料培養(yǎng)基的流加速度，以恒定速度不斷地向培養(yǎng)基中添加補料培養(yǎng) 基。此方法雖然避免了人力消耗，但是乳酸菌對菌體的消耗并不是一個恒定速率。較低的流 加速度會造成底物不足，過高的流加速度會使底物過量不斷積累，兩者均會抑制菌體的生 長。指數(shù)流加是根據(jù)乳酸菌在對數(shù)生長期成指數(shù)增殖，對底物的消耗也是以指數(shù)方式消減。 但是，為了獲得較高濃度的乳酸菌菌體濃度，在分批培養(yǎng)的對數(shù)期后期依然需要進行補料 補堿培養(yǎng)，此時菌體濃度會繼續(xù)增加，但不是以指數(shù)方式增長，指數(shù)流加的方式亦不適用。 目前，在乳酸菌的高密度培養(yǎng)方面，還未有有效的分批培養(yǎng)流加方式。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種高密度培養(yǎng)乳酸菌的自動反饋補料方法， 是將補料系統(tǒng)與補堿系統(tǒng)進行關聯(lián)，根據(jù)補堿量自動補加補料培養(yǎng)基，實現(xiàn)由pH值自動反 饋補料，確保了乳酸菌對營養(yǎng)物質和需求和底物濃度的穩(wěn)定性，顯著提高乳酸菌的生產效 率。
[0005] 所述乳酸菌包括：干酪乳桿菌（Lactobacillus casei)、植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus)、保加利亞乳桿 菌（Lactobacillus bulgaricus)等所有的同型發(fā)酵乳桿菌，以及兩歧雙歧桿菌 (Bifidobacterium bifidum)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、動物雙歧 桿菌（Bifidobacterium animal)、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)、短雙歧桿菌 (Bifidobacterium breve)等所有的雙歧桿菌。
[0006] 所述補料系統(tǒng)與補堿系統(tǒng)的關聯(lián)比例為k:l，即補加 lmL堿液，自動補加 k mL補料 培養(yǎng)基。
[0007] 所述同型發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)時堿液瓶中氫氧化鈉濃度(C?，g/L)和補料瓶中補料培 養(yǎng)基的葡萄糖濃度(C料，g/L)根據(jù)以下公式(1)配制：
[0009]式(1)中
[00?0] 40,表不氫氧化鈉的摩爾分子量，g/mol;
[0011 ] 2，表示1分子的葡萄糖產生2分子的乳酸；
[0012] 90%~100%，表示90%~100%的葡萄糖被同型發(fā)酵乳桿菌轉化成乳酸；
[0013] 180,表示葡萄糖的摩爾分子量，g/mol。
[0014] 所述雙歧桿菌培養(yǎng)時堿液瓶中氫氧化鈉濃度(C?，g/L)和補料瓶中補料培養(yǎng)基的 葡萄糖濃度(Q4，g/L)根據(jù)以下公式(2)配制：
[0016] (2)式中
[0017] 40,表不氫氧化鈉的摩爾分子量，g/mol;
[0018] 2和5,表不2分子的葡萄糖產生5分子的酸(3分子乙酸和2分子乳酸）；
[0019] 90%~100%，表示90%~100%的葡萄糖被雙歧桿菌轉化成酸，優(yōu)選90% ;
[0020] 180,表示葡萄糖的摩爾分子量，g/mol。
[0021] 所述同型發(fā)酵乳桿菌的補料培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質質量比為，葡萄糖：牛肉膏：蛋白 胨:酵母粉=(8~10) :(0.5~2) :(0.5~2) :(0.5~1)。雙歧桿菌的補料培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質 質量比為葡萄糖:酵母粉:牛肉膏:蛋白胨=(8~10): (1~4): (0.5~2): (0.5~2)。
[0022] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述分批高密度培養(yǎng)乳酸菌的自動反饋補料方法采 用以下步驟：
[0023] (1)種子培養(yǎng)；
[0024] (2)補料分批發(fā)酵:將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行補料分批發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵條 件為:發(fā)酵溫度為各菌株的最適生長溫度，攪拌轉速150-200r/min，pH值由發(fā)酵罐控制單元 控制。補堿栗與補料栗進行1 :k的轉速關聯(lián)，實現(xiàn)補堿lmL自動補加 k mL補料培養(yǎng)基的控制。 在發(fā)酵過程中，向培養(yǎng)體系中自動補加堿液和補料培養(yǎng)基，滿足菌體生長和底物濃度的穩(wěn) 定性，待菌體濃度停止增長時終止發(fā)酵。
[0025] 在本發(fā)明的一種實施方式中，同型發(fā)酵乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為碳源和氮源濃度減 半的MRS培養(yǎng)基;雙歧桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為碳源和氮源濃度減半的含lg/L L-半胱氨酸鹽酸 鹽的MRS培養(yǎng)基。
[0026] 在本發(fā)明的一種實施方式中，當發(fā)酵液的pH值小于6.9時，系統(tǒng)自動補加堿液使培 養(yǎng)體系pH值維持中性。
[0027] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述的堿液為氫氧化鈉溶液。
[0028] 在本發(fā)明的一種實施方式中，在發(fā)酵整個階段，通過補堿系統(tǒng)的自動控制實現(xiàn)補 料培養(yǎng)基適時適量地加入培養(yǎng)體系，使培養(yǎng)體系中葡萄糖濃度維持在8~10g/L。
[0029]
【申請人】發(fā)現(xiàn)同型發(fā)酵乳桿菌和雙歧桿菌在培養(yǎng)過程中，可將超過90%的葡萄糖轉 化成酸。一分子的酸(乳酸或乙酸）需要一分子的氫氧化鈉來中和，通過補堿量即可得知葡 萄糖的消耗量。將補料系統(tǒng)與控堿系統(tǒng)關聯(lián)，使葡萄糖的添加根據(jù)補堿的量自動添加，可實 現(xiàn)補料培養(yǎng)基根據(jù)底物的消耗自動地流加。本發(fā)明方法（1)自動化程度高，整個發(fā)酵過程不 需要消耗人力去測定底物濃度；（2)既可以減除代謝酸對乳酸菌的抑制，又可以消除底物抑 制；（3)高密度培養(yǎng)時間短，生產效率高，整個培養(yǎng)過程實現(xiàn)了底物根據(jù)消耗量進行補加，確 保了底物濃度的穩(wěn)定性，避免了補料不足或補料過量的現(xiàn)象。
【附圖說明】
[0030] 圖1是自動反饋補料高密度培養(yǎng)干酪乳桿菌。
[0031] 圖2是自動反饋補料高密度培養(yǎng)植物乳桿菌。
[0032] 圖3是自動反饋補料高密度培養(yǎng)青春雙歧桿菌。
[0033] 圖4是自動反饋補料高密度培養(yǎng)長雙歧桿菌。
【具體實施方式】
[0034] MRS培養(yǎng)基組成如下：1000mL蒸餾水、10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g乙酸鈉、 20g葡萄糖、0.58g MgS〇4.7H20、0.25g MnS〇4.H20、2g檸檬酸二銨、2g K2HP〇4 與lg吐溫80， pH 6·2~6·4〇
[0035]實施例1自動反饋補料高密度培養(yǎng)干酪乳桿菌 [0036] (1)種子液制備
[0037]從甘油保藏管中吸取200yL干酪乳桿菌接入10mL MRS液體培養(yǎng)基中，42°C恒溫培 養(yǎng)18h進行活化，然后以5 % (v/v)的接種量轉入100mL MRS液體培養(yǎng)基中進行二次活化，42 °(：恒溫培養(yǎng)12h即得種子液。
[0038] (2)接種前準備及接種過程
[0039]配制碳源和氮源濃度減半的MRS液體培養(yǎng)基600mL倒入1L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐罐體 121°C高溫滅菌后水浴冷卻至42°C，并保持溫度恒定。開始接種時，在酒精火焰圈上方，將種 子液以5 % (v/v)的接種量倒入發(fā)酵罐中，以150-200r/min速度攪拌，42 °C恒溫培養(yǎng)。
[0040] (3)補料系統(tǒng)與補堿系統(tǒng)的關聯(lián)設置
[0041] 將補料系統(tǒng)與補堿系統(tǒng)進行關聯(lián)，設置補堿量與補料量的補加比例為1:2.5,即流 加 lmL堿液時，補料栗自動補加2.5mL補料培養(yǎng)基。k的值不是計算的，是設備參數(shù)，由k和葡 萄糖濃度，計算堿濃度或由k和堿濃度計算葡萄糖濃度。
[0042] (4)堿液和補料培養(yǎng)基的準備
[0043]準備配制400g/L的氫氧化鈉溶液，并在121°C高溫下滅菌。根據(jù)
【發(fā)明內容】
中的方 法，選擇90%計算葡萄糖濃度，分別配制葡萄糖溶液和酵母粉、牛肉膏、蛋白胨溶液，高溫滅 菌后混合，使葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉的終濃度分別為400g/L、50g/L、50g/L、25g/L。 [00 44] (5)自動反饋補料控制
[0045]培養(yǎng)過程中當pH值低于6.9時，補堿系統(tǒng)自動補加堿液使培養(yǎng)體系pH值保持在7.0 左右。因補料系統(tǒng)與補堿系統(tǒng)的關聯(lián)，實現(xiàn)了補料培養(yǎng)基的自動補加。確保了底物濃度既滿 足菌體生長的需求，又不會過量補加。
[0046] (6)最終活菌濃度
[0047]培養(yǎng)時間20h后，干酪乳桿菌的0D62Q停止增長，菌體濃度達到最高值，此時菌體 0D62Q 達到 21 · 5，菌濃達到 1 · 4 ± 0 · 1 X 1010cfu/mL。
[0048]實施例2自動反饋補料高密度培養(yǎng)青春雙歧桿菌 [0049] (1)種子液制備
[0050]從甘油保藏管中吸取200yL青春雙歧桿菌接入10mL MRS液體培養(yǎng)基（添加 lg/L的 半胱氨酸鹽酸鹽），放入?yún)捬豕ぷ髡?7°C恒溫培養(yǎng)24h，然后以5%(v/v)的接種量轉入100mL 液體培養(yǎng)基中進行二次活化，37°C恒溫厭氧培養(yǎng)15h即得種子液。
[0051] (2)接種前準備及接種過程
[0052] 配制碳源和氮源濃度減半的MRS液體培養(yǎng)基(添加 lg/L的半胱氨酸鹽酸鹽)600mL 倒入1L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐罐體121°C高溫滅菌后水浴冷卻至37°C，并保持溫度恒定。開始接 種時，在酒精火焰圈上方，將種子液以5% (v/v)的接種量倒入發(fā)酵罐中，以150~200r/min 速度攪拌，以〇. 8mL/min流量持續(xù)通入無菌氮氣保持培養(yǎng)體系的厭氧環(huán)境，37 °C恒溫培養(yǎng)。 [0053] (3)補料系統(tǒng)與補堿系統(tǒng)的關聯(lián)設置
[0054] 將補料系統(tǒng)與補堿系統(tǒng)進行關聯(lián)，設置補堿量與補料量的補加比例為1:2.5,即流 加 lmL堿液時，補料栗自動補加2.5mL補料培養(yǎng)基。
[0055] (4)堿液和補料培養(yǎng)基的準備
[0056]準備配制400g/L的氫氧化鈉溶液，并在121°C高溫下滅菌。根據(jù)
【發(fā)明內容】
中的方 法，選擇90%計算葡萄糖濃度，分別配制葡萄糖溶液和酵母粉、牛肉膏、蛋白胨溶液，高溫滅 菌后混合，使葡萄糖、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨的終濃度分別為320g/L、160g/L、80g/L、80g/ L〇
[0057] (5)自動反饋補料控制
[0058]培養(yǎng)過程中當pH值低于6.9時，補堿系統(tǒng)自動補加堿液使培養(yǎng)體系pH值保持在7.0 左右。因補料系統(tǒng)與補堿系統(tǒng)的關聯(lián)，實現(xiàn)了補料培養(yǎng)基的自動補加。確保了底物濃度既滿 足菌體生長的需求，又不會過量補加。發(fā)酵過程菌體濃度及葡萄糖濃度變化情況如圖3所 不。
[0059] (6)最終活菌濃度
[0060]培養(yǎng)時間20h后，青春雙歧桿菌的0D62Q停止增長，菌體濃度達到最高值，此時菌體 0D62Q 達到 12 · 1，菌濃達到 3 · 5 ± 0 · 1 X 109cfu/mL。
[0061 ]實施例3自動反饋補料高密度培養(yǎng)植物桿菌
[0062]植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌等其他同 型發(fā)酵乳桿菌的自動反饋補料培養(yǎng)同實施例1，培養(yǎng)溫度為各菌株的最適生長溫度。如圖2 所示，植物乳桿菌培養(yǎng)16h后達到最終活菌濃度1.3±0.1 X 101()Cfu/mL。
[0063] 實施例4自動反饋補料高密度培養(yǎng)長雙歧桿菌
[0064] 兩歧雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌等其他雙歧桿菌的自動反 饋補料培養(yǎng)同實施例2,培養(yǎng)溫度為各菌株的最適生長溫度。如圖4所示，長雙歧的最終活菌 濃度可達到4· 1 ±0 · 2 X 109cfu/mL。
[0065]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種高密度培養(yǎng)乳酸菌的方法，其特征在于，是將補料系統(tǒng)與補堿系統(tǒng)進行關聯(lián)，根 據(jù)補堿量自動補加補料培養(yǎng)基，實現(xiàn)由pH值自動反饋補料。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌包括同型發(fā)酵乳桿菌以及雙歧 桿菌；所述同型發(fā)酵乳桿菌包括：干酪乳桿菌（Lactobaci I Ius casei )、植物乳桿菌 (Lactobaci Ilus pIantarum)、鼠李糖乳桿菌（Lactobaci Ilus rhamnosus)、嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus)、保加利亞乳桿 菌（Lacto bacillus bu lgari cus);所述雙歧桿菌包括歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis)、動物雙歧桿菌 (Bifidobacterium animal)、長雙歧桿菌（Bifidobacterium Iongum)、短雙歧桿菌 (Bifidobacterium breve)〇3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述同型發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)時堿液瓶中氫氧 化鈉濃度(C?，g/L)和補料瓶中補料培養(yǎng)基的葡萄糖濃度(C料，g/L)根據(jù)以下公式(1)配制： 式(1)中：40表不氫氧化鈉的摩爾分子量，g/mol; 2表示1分子的葡萄糖產生2分子的乳酸； 90 %~100 %表示90 %~100 %的葡萄糖被同型發(fā)酵乳桿菌轉化成乳酸； 180表示葡萄糖的摩爾分子量，g/mol。4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述同型發(fā)酵乳桿菌的補料培養(yǎng)基中營養(yǎng) 物質質量比為葡萄糖:牛肉膏:蛋白胨:酵母粉=(8~10): (0.5~2): (0.5~2): (0.5~1)。5. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述雙歧桿菌培養(yǎng)時堿液瓶中氫氧化鈉濃 度(C?，g/L)和補料瓶中補料培養(yǎng)基的葡萄糖濃度(g/L)根據(jù)以下公式(2)配制： (2)式中：40表不氫氧化鈉的摩爾分子量，g/mol; 2和5表不2分子的葡萄糖產生5分子的酸； 90 %~100 %表示90 %~100 %的葡萄糖被雙歧桿菌轉化成酸，優(yōu)選90 % ; 180表示葡萄糖的摩爾分子量，g/mol。6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，雙歧桿菌的補料培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質質量比 為葡萄糖:酵母粉:牛肉膏:蛋白胨=(8~10): (1~4): (0.5~2): (0.5~2)。7. 根據(jù)權利要求1~6任一所述的方法，其特征在于，補料系統(tǒng)與補堿系統(tǒng)的關聯(lián)比例 為k:l，即補加 ImL堿液，自動補加 k mL補料培養(yǎng)基。8. 根據(jù)權利要求1~6任一所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 種子培養(yǎng)； (2) 補料分批發(fā)酵：將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行補料分批發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵條件 為:發(fā)酵溫度為各菌株的最適生長溫度，攪拌轉速150-200r/min，pH值由發(fā)酵罐控制單元控 制;補堿栗與補料栗進行I :k的轉速關聯(lián)，實現(xiàn)補堿ImL自動補加 k mL補料培養(yǎng)基的控制;在 發(fā)酵過程中，向培養(yǎng)體系中自動補加堿液和補料培養(yǎng)基，滿足菌體生長和底物濃度的穩(wěn)定 性，待菌體濃度停止增長時終止發(fā)酵。9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，同型發(fā)酵乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為碳源和氮 源濃度減半的MRS培養(yǎng)基;雙歧桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為碳源和氮源濃度減半的含lg/L L-半胱 氨酸鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基。10. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，當發(fā)酵液的pH值小于6.9時，系統(tǒng)自動補 加堿液使培養(yǎng)體系PH值維持中性;在整個發(fā)酵階段，通過補堿系統(tǒng)的自動控制實現(xiàn)補料培 養(yǎng)基適時適量地加入培養(yǎng)體系，使培養(yǎng)體系中葡萄糖濃度維持在8~10g/L。
【文檔編號】C12R1/23GK105886439SQ201610309779
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】張灝, 崔樹茂, 趙建新, 田豐偉, 王剛, 陳衛(wèi)
【申請人】江南大學