一種dna依賴蛋白激酶的催化亞單位的單克隆抗體及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種DNA依賴蛋白激酶的催化亞單位(catalytic sunbunit of the DNA?dependent protein kinase，DNA?PKcs)的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株以及所述的抗體的應(yīng)用。CGMCC No. 1204720160310
【專利說明】
一種DNA依賴蛋白激酶的催化亞單位的單克隆抗體及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種DNA依賴蛋白激酶的催化亞單位（catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase，DNA_PKcs)的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì) 胞株以及所述的抗體的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 電離輻射和其他因素會引起細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂，在多種形式的DNA損傷中，雙鏈 斷裂(double strand break，DSB)是生物學(xué)后果最嚴(yán)重、誘發(fā)細(xì)胞學(xué)反應(yīng)最為復(fù)雜、與癌癥 等問題聯(lián)系最為密切的DNA損傷類型。在哺乳動物細(xì)胞中，雙鏈斷裂修復(fù)的途徑主要有兩 條，包括非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ)和同源重組（homologous recombination，HR)。而DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)是非同源末端連接途徑中關(guān)鍵蛋白，是 絲氨酸/蘇氨酸激酶。DNA-PK復(fù)合物能識別和結(jié)合DNA雙鏈斷裂末端，通過自磷酸化和磷酸 化多種蛋白質(zhì)底物從而啟動后續(xù)的DNA損傷反應(yīng)(Reddy et al. ,2004)。
[0003] DNA_PKcs(DNA Dependent Protein Kinase Catalytic Subunit)是DNA-PK的催 化亞單位，與另外兩個亞單位Ku70和Ku80共同構(gòu)成DNA-PK復(fù)合物。催化亞基DNA-PKcs和調(diào) 節(jié)亞基ku70/ku80異源二聚體構(gòu)成復(fù)合物DNA-PK。而DNA-PKcs是直接效應(yīng)亞單位。在NHEJ的 修復(fù)過程，每個受損的DNA末端被一個KU70/80異源二聚體結(jié)合并且兩個異源二聚體必須同 時結(jié)合到匹配的DNA末端才能確保高保真性，隨后DNA-PKcs被招募到DNA-KU70/80復(fù)合物上 使得NHEJ繼續(xù)進(jìn)行。因此，DNA-PK復(fù)合物在DSBs(DNA double strand breaks)的修復(fù)過程 中起著非常重要的作用(Davis et al.，2014;Lieber et al. ,2003)。
[0004] DNA-PKcs與六了1?、4了1^1^、？1^?等都屬于磷脂酰肌醇-3-激酶相關(guān)蛋白激酶 (phosphatidyl inositol-3-kinase-like-kinase PI 3KK)超家族成員。在識別和結(jié)合 DNA 雙 鏈斷裂末端后，通過自磷酸化和磷酸化多種蛋白質(zhì)底物從而啟動后續(xù)的DNA損傷反應(yīng)。研究 表明，DNA-PKcs在DNA雙鏈斷裂修復(fù)、V(D)J重組、維持染色體端粒末端結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、細(xì)胞自 噬死亡、G2/M檢查點(diǎn)等生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(H 〇ekstra，1997)。
[0005] Hartley等克隆出人類DNA-PKcs的全長cDNA，其中氨基端與其它已確認(rèn)的蛋白無 多大同源性，而羧基端約500個氨基酸屬于PI3KK超家族成員。現(xiàn)已知人DNA-PKcs分子量大 約465kDa，其激酶活性區(qū)域位于羧基端(Hartley et al.，1995)。0嫩-?1(〇8定位于細(xì)胞核， 在一些正常細(xì)胞，如神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、精原細(xì)胞中高表達(dá)，但在很多類型的腫瘤 細(xì)胞中異常高表達(dá)。DNA-PKcs通過自磷酸化和磷酸化其它底物蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能;DNA-PKcs有兩個主要的自磷酸化簇，分別位于2023-2056和2609-2647區(qū)域。將這些區(qū)域的絲氨 酸和蘇氨酸突變成丙氨酸或天門冬氨酸后，細(xì)胞輻射敏感性強(qiáng)于DNA-PKcs缺失細(xì)胞，表現(xiàn) 出DSB修復(fù)缺陷，這一結(jié)論說明該區(qū)域磷酸化對DNA-PKcs完成DSB修復(fù)是必須的；也表明該 區(qū)域?qū)?xì)胞輻射敏感性有一定的影響作用。
[0006] 綜上所述，DNA-PKcs是參與DNA損傷修復(fù)的重要蛋白分子，通過參與NHEJ過程以修 復(fù)受損的DNA^NA-PKcs在癌癥細(xì)胞中異常高表達(dá)，尤其在具有高轉(zhuǎn)移特性和放化療抗性的 癌細(xì)胞中表達(dá)活性顯著提高，很可能是通過Akt/GSK3i3/c-Myc信號調(diào)節(jié)通路參與細(xì)胞惡性 化過程。多個研究已證實(shí)，特異性抑制癌細(xì)胞中的DNA-PKcs活性可顯著增強(qiáng)癌細(xì)胞對放射 治療的敏感性（Nguyen et al.，2003;Tonotsuka et al. ,2006)。另外，DNA-PKcs還具有作 為放射增敏抗癌分子靶標(biāo)的價(jià)值?，F(xiàn)階段，絕大部分腫瘤患者都要接受放化療，放化療是宮 頸癌和乳腺癌的主要治療手段之一，但療效有限。放射線主要通過導(dǎo)致細(xì)胞DNA雙鏈斷裂 (DNA double-strand break，DSB)起到殺死腫瘤細(xì)胞的作用，但細(xì)胞都有不同程度的DSB修 復(fù)能力來抵抗這些損傷，所以尋找低毒有效的藥物和新的放化療增敏靶點(diǎn)是當(dāng)務(wù)之急。由 于DNA-PKcs在DNA或DNA代謝過程中，能夠修復(fù)受損DNA等一系列生物學(xué)反應(yīng)，而修復(fù)的結(jié)果 就是提高細(xì)胞的存活，這也是腫瘤細(xì)胞對放化療抵抗的機(jī)制之一(Mahaney et al.，2009)。 因而，DNA-PKcs具有作為放射增敏和抗癌分子靶標(biāo)的重要價(jià)值。雖然已有多種抑制劑用以 抑制DNA-PKcs功能，但是這些抑制劑副作用大，使其實(shí)際應(yīng)用受限。
[0007]單克隆抗體技術(shù)在疾病診斷、藥物開發(fā)中的應(yīng)用是目前醫(yī)藥領(lǐng)域的一個研究熱 點(diǎn)，也為多種疾病的治療提供了新的途徑，單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展為研究DNA-PKcs特異性 抑制劑提供了有效手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種DNA依賴蛋白激酶的催化亞單位(catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase，DNA_PKcs)的單克隆抗體(Anti-DNA-PKcs)、分泌 該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0009] 本發(fā)明一個方面涉及一種雜交瘤細(xì)胞系，其特征在于，所述雜交瘤細(xì)胞系的保藏 號為CGMCC No.12047。
[0010] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種前述雜交瘤細(xì)胞系分泌的DNA依賴蛋白激酶的催化 亞單位(DNA-PKcs)的單克隆抗體，其特征在于，其能夠特異的結(jié)合DNA-PKcs蛋白。
[0011] 本發(fā)明的再一個方面涉及前述雜交瘤細(xì)胞及前述單克隆抗體在檢測靶蛋白DNA-PKcs中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明再一個方面涉及一種包含前述單克隆抗體的試劑盒。
[0013] 本發(fā)明再一個方面涉及前述雜交瘤細(xì)胞及前述單克隆抗體在檢測癌細(xì)胞的試劑 盒中的應(yīng)用，所述癌細(xì)胞優(yōu)選為具有高轉(zhuǎn)移特性和放化療抗性的癌細(xì)胞，更優(yōu)選為乳腺癌 細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞。
[0014] 本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體和雜交瘤的制備方法，
[0015] 1.抗原制備
[0016] (1)獲得目的基因
[0017] Trizol Reagent試劑提取HeLa細(xì)胞總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以cDNA為模板 PCR擴(kuò)增DNA-PKcs基因片段。
[0018] (2)構(gòu)建重組表達(dá)載體
[0019]將步驟（1)獲得的PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入表達(dá)載體 pET41a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET41a-DNA-PKcs。載體經(jīng)過酶切和測序鑒定后用于轉(zhuǎn)化表達(dá)細(xì)菌。 [0020] (3)獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
[0021]將步驟(2)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用含有硫酸 卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選，挑取單克隆用于抗原表達(dá)。
[0022] (4)誘導(dǎo)表達(dá)和純化
[0023]將含有表達(dá)質(zhì)粒的Rosetta(DE3)細(xì)菌單克隆接種于10ml含有硫酸卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37度，220rpm培養(yǎng)10hr。將菌液按1:100稀釋倍數(shù)接種于200ml新鮮的LB培養(yǎng) 基，培養(yǎng)至0D值為0.6，加入0.1 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，20度5hr，收集菌液超聲破碎，從上清中純 化重組抗原DNA-PKcs。
[0024] 2.單克隆抗體的制備和純化
[0025] (1)、免疫動物
[0026] 一般使用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方法進(jìn)行三次免疫注射。
[0027] 第一次免疫用2ML注射器每只小鼠腹股溝皮下注射0.2ml乳化液（100ul純化的重 組蛋白DNA-PKcs(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏完全佐劑，含100ug抗原）。
[0028] 第二次免疫間隔兩周，用2ML注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液（100ul純化的 重組蛋白DNA-PKcs(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏不完全佐劑，含100ug抗原）。
[0029]第三次免疫間隔兩周，用2ML注射器每只小鼠腹股溝皮下注射注射0.2ml乳化液 (100ul純化的重組蛋白DNA-PKcs(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏不完全佐劑，含100ug抗原）。
[0030] 測效價(jià)根據(jù)融合時間安排，第三次免疫7-10天后取血檢測，用常規(guī)的western法 檢測效價(jià)，選擇效價(jià)達(dá)到1:1000的小鼠用于融合。
[0031] 加強(qiáng)免疫融合前3天，向待取脾小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，小鼠腹腔注射200ul液體（含 60ug抗原，溶劑為1 X PBS，pH7 · 4)。
[0032] ⑵、細(xì)胞融合
[0033] 采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，放入帶200目不銹鋼網(wǎng)的平皿 中研磨，制備細(xì)胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合 (1:5-1:10)，并加入促融合劑聚乙二醇（50% )。采用HAT選擇培養(yǎng)基，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的選 擇性培養(yǎng)和篩選。
[0034]用ELISA方法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清:將抗原用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸鹽緩 沖液)稀釋為8ug/ml加入96孔酶標(biāo)板中，50ul/孔，放入4 °C冰柜中包被過夜。棄去包被液，用 PBST (磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板三次，加入封閉液3 % BSA-roST (加入3 %牛血清白蛋白的 磷酸鹽緩沖液），l〇〇ul/孔，37°C孵育1小時。棄去封閉液，PBST(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板 一次，甩干板子。將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清加入酶標(biāo)板lOOul/well，同時加入PBST(磷酸鹽緩 沖液)作為陰性對照。37°C孵育1小時。棄上清，用洗板機(jī)PBST洗板三次，加入稀釋好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37°C孵育1小時。棄上清，用洗板機(jī)PBST洗板三次，加底物 TMB100ul/well，RT，避光37°C，10_15min后加入50ul終止液（2mol/L硫酸）。使用酶標(biāo)儀測 定，酶標(biāo)儀設(shè)置為:450nm比色。和陰性對照相比，如果是0D值2.5倍之上就是陽性。最后篩選 得到一株效價(jià)最好的抗DNA-PKcs的雜交瘤細(xì)胞株，命名為8D3,亞型鑒定為IgG2b。
[0035]將篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞株8D3進(jìn)行單克隆篩選(有限稀釋法），獲得能產(chǎn)生高 效價(jià)(WB稀釋比>1:1000)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆。將雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存 保種。所述的陽性雜交瘤細(xì)胞為抗人DNA-PKcs雜交瘤細(xì)胞系8D3,該細(xì)胞系已保存于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC No. 12047)。
[0036] (3)單克隆抗體的制備與純化
[0037] 將步驟(2)獲得的細(xì)胞株8D3接種至BALB/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中純 化抗體(所獲抗體命名為anti-DNA-PKcs)。
[0038] 抗DNA-PKcs單克隆抗體的純化:使用Protein G親和純化法。將用PB溶液平衡好的 Protein G填料裝入純化柱中，加入經(jīng)PB溶液稀釋的單克隆抗體anti-DNA-PKcs的腹水過 柱。上樣結(jié)束后，用PB溶液洗柱子至流穿液0D值〈0.01。然后用0.1M pH3.0的甘氨酸-鹽酸溶 液洗脫，收集整個洗脫峰的溶液。洗脫液經(jīng)過透析濃縮并更換為roS溶液。SDS-PAGE結(jié)果顯 示，純化后抗體純度在95 %以上(參見圖1) 本發(fā)明的小鼠雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號為CGMCC No. 12047，保藏單位為中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中 國科學(xué)院微生物研究所;保藏日期為2016年3月10日。
【附圖說明】
[0039]圖1:十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE)檢測純化的DNA-PKcs抗 體。
[0040] 圖2:免疫印跡檢測不同裂解液(HCT116、A549、Mo 11-4、K562)中DNA-PKcS蛋白的表 達(dá)(抗體稀釋倍數(shù)1:1000)。
[0041 ]圖3:DNA-PKCS抗體的免疫熒光測試(所用細(xì)胞系:HeLa，抗體稀釋倍數(shù)1:200)。 [0042]圖4:DNA-PKcs抗體的免疫組化檢測(乳腺癌病理切片，抗體稀釋倍數(shù)1:200)。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 以下通過實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，本發(fā)明包括但不僅限于以下實(shí)例。
[0044] 試劑、酶、載體及細(xì)胞株：
[0045] (l)、細(xì)胞株:HeLa(ATCC?CCL-2TM)、大腸桿菌Rosetta(DE3)(Novagen)、骨髓瘤 細(xì)胞 SP2/0(ATCC?CRL-1581tm)、A549(ATCC?CCL-185tm)、HCT116(ATCG?CCL-247?)、 Molt-4(ATCC?CRL-1582?)和 K562(ATGC?CCL-243?);
[0046] (2)、實(shí)驗(yàn)動物:雌性BALB/c小鼠（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司）；
[0047] (3)、載體：pET41a(Novagen);
[0048] (4)、酶及抗體試劑:構(gòu)建載體過程和PCR過程的各種酶購自Fermentas，ELISA實(shí)驗(yàn) 所用抗體anti-mouse IgG/HRP(Jackson ImmunoResearch)，ELISA底物TMB(Sigma)、逆轉(zhuǎn)錄 試劑盒(Fermentas)，BSA購自（北京元亨金馬生物科技有限公司）
[0049] (5)、其他試劑如無特別說明為國產(chǎn)分析純。
[0050] 實(shí)施例1:雜交瘤細(xì)胞株8D3及其產(chǎn)生的單克隆抗體的獲得。
[0051] 丨.抗原制備
[0052] (1)獲得目的基因
[0053] Trizol Reagent試劑提取HeLa細(xì)胞總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以cDNA為模板 PCR擴(kuò)增DNA-PKcs基因片段。
[0054] (2)構(gòu)建重組表達(dá)載體
[0055]將步驟（1)獲得的PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入表達(dá)載體 pET41a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET41a-DNA-PKcs。載體經(jīng)過酶切和測序鑒定后用于轉(zhuǎn)化表達(dá)細(xì)菌。
[0056] (3)獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
[0057]將步驟(2)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用含有硫酸 卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選，挑取單克隆用于抗原表達(dá)。
[0058] (4)誘導(dǎo)表達(dá)和純化
[0059]將含有表達(dá)質(zhì)粒的Rosetta(DE3)細(xì)菌單克隆接種于10ml含有硫酸卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37度，220rpm培養(yǎng)10hr。將菌液按1:100稀釋倍數(shù)接種于200ml新鮮的LB培養(yǎng) 基，培養(yǎng)至0D值為0.6，加入0.1 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，20度5hr，收集菌液超聲破碎，從上清中純 化重組抗原DNA-PKcs。
[0060] 2.單克隆抗體的制備和純化
[0061] (1)、免疫動物
[0062] 一般使用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方法進(jìn)行三次免疫注射。
[0063] 第一次免疫用2ML注射器每只小鼠腹股溝皮下注射0.2ml乳化液（100ul純化的重 組蛋白DNA-PKcs(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏完全佐劑，含100ug抗原）。
[0064] 第二次免疫間隔兩周，用2ML注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液（100ul純化 的重組蛋白DNA-PKcs(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏不完全佐劑，含100ug抗原）。
[0065]第三次免疫間隔兩周，用2ML注射器每只小鼠腹股溝皮下注射注射0.2ml乳化液 (100ul純化的重組蛋白DNA-PKcs(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏不完全佐劑，含100ug抗原）。 [0066]測效價(jià)根據(jù)融合時間安排，第三次免疫7-10天后取血檢測，用常規(guī)的western法檢 測效價(jià)，選擇效價(jià)達(dá)到1:1000的小鼠用于融合。
[0067] 加強(qiáng)免疫融合前3天，向待取脾小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，小鼠腹腔注射200ul液體（含 60ug抗原，溶劑為1 X PBS，pH7 · 4)。
[0068] ⑵、細(xì)胞融合
[0069] 采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，放入帶200目不銹鋼網(wǎng)的平皿 中研磨，制備細(xì)胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合 (1:5-1:10)，并加入促融合劑聚乙二醇（50% )。采用HAT選擇培養(yǎng)基，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的選 擇性培養(yǎng)和篩選。
[0070] 用ELISA方法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清:將抗原用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸鹽緩 沖液)稀釋為8ug/ml加入96孔酶標(biāo)板中，50ul/孔，放入4 °C冰柜中包被過夜。棄去包被液，用 PBST (磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板三次，加入封閉液3 % BSA-roST (加入3 %牛血清白蛋白的 磷酸鹽緩沖液），l〇〇ul/孔，37°C孵育1小時。棄去封閉液，PBST(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板 一次，甩干板子。將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清加入酶標(biāo)板lOOul/well，同時加入PBST(磷酸鹽緩 沖液)作為陰性對照。37°C孵育1小時。棄上清，用洗板機(jī)PBST洗板三次，加入稀釋好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37°C孵育1小時。棄上清，用洗板機(jī)PBST洗板三次，加底物 TMB100ul/well，RT，避光37°C，10_15min后加入50ul終止液（2mol/L硫酸）。使用酶標(biāo)儀測 定，酶標(biāo)儀設(shè)置為:450nm比色。和陰性對照相比，如果是0D值2.5倍之上就是陽性。最后篩 選得到一株效價(jià)最好的抗DNA-PKcs的雜交瘤細(xì)胞株，命名為8D3,亞型鑒定為IgG2b。
[0071] 將篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞株8D3進(jìn)行單克隆篩選(有限稀釋法），獲得能產(chǎn)生高 效價(jià)(WB稀釋比>1:1000)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆。將雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存 保種。所述的陽性雜交瘤細(xì)胞為抗人DNA-PKcs雜交瘤細(xì)胞系8D3,該細(xì)胞系已保存于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC No. 12047)。
[0072] (3)單克隆抗體的制備與純化
[0073]將步驟(2)獲得的細(xì)胞株8D3接種至BALB/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中純 化抗體(所獲抗體命名為anti-DNA-PKcs)。
[0074] 抗DNA-PKcs單克隆抗體的純化:使用Protein G親和純化法。將用PB溶液平衡好的 Protein G填料裝入純化柱中，加入經(jīng)PB溶液稀釋的單克隆抗體anti-DNA-PKcs的腹水過 柱。上樣結(jié)束后，用PB溶液洗柱子至流穿液0D值〈0.01。然后用0.1M pH3.0的甘氨酸-鹽酸溶 液洗脫，收集整個洗脫峰的溶液。洗脫液經(jīng)過透析濃縮并更換為roS溶液。SDS-PAGE結(jié)果顯 示，純化后抗體純度在95 %以上(參見圖1)。
[0075]實(shí)施例2:單克隆抗體鑒定及應(yīng)用
[0076] 1.小鼠抗DNA-PKcs單克隆抗體(anti-DNA-PKcs)的免疫印跡檢測鑒定
[0077]提取各種腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞裂解液，總蛋白濃度調(diào)整到2mg/ml，上樣至6%的SDS-PAGE膠孔中，20ug/孔，電泳后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，用實(shí) 施例1制備得到的ant i -DNA-PKc s抗體進(jìn)行免疫染色：加入實(shí)施例1步驟(3)制備并純化的 ant i -DNA-PKcs，工作濃度為1:1000，37度孵育1小時，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠抗體，工 作濃度1: 20000，于37度反應(yīng)lhr，經(jīng)過顯影后可以看到每種裂解液均出現(xiàn)450KD的條帶（參 見圖2)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符，證明此抗體為抗DNA-PKcs的特異性抗體;抗體稀釋梯度達(dá)到1: 1000(抗體工作濃度能達(dá)到0.2-lug/ml)有清晰條帶，能夠檢測DNA-PKcs在HCT116(Lane l)、A549(Lane 2)、Molt-4(Lane 3)和K562(Lane 4)細(xì)胞中的表達(dá)。
[0078] 2.免疫熒光細(xì)胞染色鑒定
[0079] HeLa細(xì)胞用PBS洗兩次，4%多聚甲醛室溫固定30min，PBS沖洗，用0 · 5%Triton X-100PBS室溫透化20min。然后加入5%BSA PBS以封閉非特異性反應(yīng)。加入實(shí)施例1步驟(3)制 備并純化的anti-DNA-PKcs單克隆抗體1:200，37度孵育30min。沖洗，加入FITC標(biāo)記的山羊 抗鼠 IgG，室溫避光孵育lhr。去除游離的二抗，PBS沖洗，熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀 察，用藍(lán)色光激發(fā)觀察綠色熒光信號。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3)清楚觀察到細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯綠色熒 光，定位和文獻(xiàn)報(bào)道一致。說明此抗DNA-PKcs的特異抗體可以用于免疫熒光檢測觀察DNA-PKcs的表達(dá)和定位。
[0080] 3.免疫組化檢測
[0081] 乳腺癌組織的石蠟切片經(jīng)過脫蠟水化后，加入3%H202室溫孵育5~10分鐘，以消 除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。采用高壓抗原修復(fù)方法進(jìn)行抗原修復(fù)，溶液使用枸櫞酸鹽緩 沖液(PH6.0)。經(jīng)5%正常山羊血清(PBS稀釋）封閉后，加入anti-DNA-PKcs單克隆抗體1: 200，37度孵育30min JBS沖洗3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG，室溫孵育lhr JBS沖洗5次， 添加顯色劑顯色(DAB)。自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4)清楚觀察到細(xì)胞核中 呈現(xiàn)明顯染色，說明此抗DNA-PKcs的特異抗體可以用于免疫組化檢測觀察DNA-PKcs在組織 中的表達(dá)和定位。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分泌D N A依賴蛋白激酶的催化亞單位的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其特征在 于，所述雜交瘤細(xì)胞系的保藏號為CGMCC No. 12047。2. -種由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞系分泌的DNA依賴蛋白激酶的催化亞單位(DNA-PKcs)的單克隆抗體，其特征在于，其能夠特異的結(jié)合DNA-PKcs蛋白；優(yōu)選地，所述單克隆抗 體的亞型為IgG2b。3. 權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞及權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在檢測靶蛋白DNA-PKcs中的應(yīng)用。4. 一種包含權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞和/或權(quán)利要求2所述的單克隆抗體的試劑 盒。5. 權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞及權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在檢測癌細(xì)胞的試劑 盒中的應(yīng)用，所述癌細(xì)胞優(yōu)選為具有高轉(zhuǎn)移特性和放化療抗性的癌細(xì)胞，更優(yōu)選為乳腺癌 細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞。
【文檔編號】G01N33/68GK105886475SQ201610257424
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】聶子梅, 邱俊康, 張?zhí)┐? 蔣洪嬌
【申請人】成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司