一種幾丁質(zhì)脫乙?；竿蛔凅w的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的突變體，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將專性海洋放線菌Salinispora arenicola幾丁質(zhì)脫乙?；傅?2位纈氨酸V突變?yōu)楦拾彼酖，第66位的脯氨酸P點突變?yōu)榻z氨酸S。相比突變前，突變體酶的比活力是野生型酶的3.92倍。本發(fā)明提供的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶更加適合工業(yè)化生產(chǎn)需求，滿足社會生產(chǎn)的要求。
【專利說明】
一種幾丁質(zhì)脫乙?；竿蛔凅w
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明公開了一種幾丁質(zhì)脫乙?；傅耐蛔凅w，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 幾丁質(zhì)（chitin)又稱甲殼素、甲殼質(zhì)等，是由N-乙酰-D葡萄糖胺(GlcNAc)單體通 過β_1，4糖苷鍵鏈接而成的直鏈高分子化合物，是自然界中次于纖維素的天然高分子。幾丁 質(zhì)具有幾乎不溶于水和一般有機溶劑，限制了幾丁質(zhì)的應(yīng)用（。幾丁質(zhì)脫乙酰后形成殼聚 糖，化學名稱為聚葡萄糖胺（1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。殼聚糖溶于酸性及中性水溶液，具有 良好的生物相容性和生物可降解性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、化妝品、水處理、金屬提 取及回收、生化和生物醫(yī)學工程等諸多領(lǐng)域(Pradip Kumar Dutta.Chitin and Chitosan for Regenerative Medicine[M].Springer India,2016)。
[0003] 目前，殼聚糖的工業(yè)生產(chǎn)是以幾丁質(zhì)為原料采用濃堿熱化學法生產(chǎn)，此法不僅污 染嚴重，而且程度不易控制，導致出現(xiàn)各種分子量范圍的產(chǎn)品。采用酶法脫乙酰反應(yīng)溫和、 環(huán)境友好，可以制備出高質(zhì)量的殼聚糖。幾丁質(zhì)脫乙?；?E.C.3.2.1.41)能將幾丁質(zhì)的 乙?；苯用摮蓺ぞ厶?，但是對幾丁質(zhì)分子的主鏈不發(fā)生降解，與特定酶結(jié)合使用還 可以制備具有特定乙?；恢玫漠a(chǎn)物（Yong Zhao，Ro_Dong Park and Riccardo A.A.Muzzarelli.Chitin deacetylases:properties and applications[J].Mar.Drugs 2010,8:24-46)。
[0004] 近十幾年來，隨著分子生物學與工業(yè)微生物研究的快速發(fā)展，研究者開始采用基 因工程手段構(gòu)建重組菌，以期實現(xiàn)幾丁質(zhì)脫乙?；父咝a(chǎn)。目前，已相繼出現(xiàn)了利用 Escherichia coli、Bacillus subtilis和Pichia pastoris等作為宿主表達不同來源幾丁 質(zhì)脫乙酰基酶基因的報道。盡管表達量較高，但是酶的催化效率等酶學特性還有待進一步 改進。我國對幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的研究主要集中在菌種選育、酶的純化、表達和酶學性質(zhì)、 發(fā)酵工藝的改良方面，尚缺催化效率較高的幾丁質(zhì)脫乙?；?。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明要解決的技術(shù)問題：
[0006] 本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種催化活性提高的幾丁質(zhì)脫乙?；?突變體。
[0007] 所述突變體是以氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶(野生型）為 基礎(chǔ)，將第52位纈氨酸V突變?yōu)楦拾彼酖，第66位的脯氨酸P點突變?yōu)榻z氨酸S。
[0008] 本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供構(gòu)確定突變氨基酸的方法，是通過模擬 Salinispora arenicola CAD三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)第52位繳氨酸和第66位的脯氨酸都位于鏈接 催化活性中心的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)中，突變后有望改變催化結(jié)構(gòu)域，并改變底物結(jié)合能力。
[0009] 本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供構(gòu)建所述幾丁質(zhì)脫乙?；竿蛔凅w的方 法，是通過設(shè)計引物對編碼幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的基因進行定點突變后表達。
[0010]所述構(gòu)建方法，以含有幾丁質(zhì)脫乙?；纲|(zhì)粒pEtac-HiS6-cad為模板，設(shè)計引物 進行突變并將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入E.coli DH5a進行擴增，然后以E.coli BL21(DE3)表 達含突變基因的重組質(zhì)粒，得到活性提高的突變體。
[0011]所述用于定點突變的引物是：
[0012] cadV52G primerlATGGTGGCCACACCTGGCGGGTGTGG
[0013] cadV52G primer2CCACACCCGCCAGGTGTGGCCACCAT
[0014] cadP66S primer1ATCGCGTTGACCTTCGACGACGGACCCAA
[0015] cadP66S primer2TTGGGTCCGTCGTCGAAGGTCAACGCGAT
[0016] 本發(fā)明要解決的第四個技術(shù)問題是提供應(yīng)用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)所述幾丁質(zhì)脫 乙?；竿蛔凅w的方法，是將含有編碼突變幾丁質(zhì)脫乙?；傅幕虻闹亟M菌E.coli BL21 (DE3) (pEtaC-HiS6-cad)活化培養(yǎng)后接種到含有100yg mL-1氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基 中，裝液量為30mL/250mL，于37 °C，200r min-1培養(yǎng)；菌體生長到0D600 = 0.6，加入終濃度 0.5mM IPTG，30°C，誘導發(fā)酵24h。所用培養(yǎng)基組成:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0。
[0017] 本發(fā)明提供的一種催化活性提高的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶突變體，是將氨基酸序列如 SEQ ID N0.2所示的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的第52位纈氨酸V突變?yōu)楦拾彼酖，第66位的脯氨酸P 點突變?yōu)榻z氨酸S。
[0018] 上述突變體的基因的編碼也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0019]攜帶上述突變體的基因的載體或細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種獲得上述幾丁質(zhì)脫乙?；竿蛔凅w的方法， 是通過設(shè)計引物對編碼幾丁質(zhì)脫乙?；傅幕蜻M行定點突變后表達。是以質(zhì)粒pEtac-His 6-cad為模板設(shè)計引物進行突變并將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入E.coli DH5a進行擴增，然 后以E.coli BL21(DE3)表達含突變基因的重組質(zhì)粒，得到活性性增強的幾丁質(zhì)脫乙?；?突變體。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了應(yīng)用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)上述幾丁質(zhì)脫乙酰基酶 突變體的方法，是將含有編碼突變幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的基因的重組菌E.coli BL21(DE3) (pEtac-His6-cadm)活化培養(yǎng)后接種到含有100yg mL-1氨節(jié)青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，所用 培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7 · 0。裝液量為30mL/250mL， 于37°C，200r min-1培養(yǎng);菌體生長到0D600 = 0 · 6，加入終濃度0 · 5mM IPTG，30°C，誘導發(fā)酵 24h。取發(fā)酵液，8000r/min離心10min收集菌體，再適量蒸餾水懸浮細胞，于冰水中超聲破碎 4min，12000r/min離心15min去除細胞碎片，上清液即為粗酶液。
[0022]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明通過定點突變改造幾丁質(zhì)脫乙?；富?，使所編 碼的CAD催化活性增加;突變酶酶的比活力是野生型酶的5.33倍。酶的其它催化特性基本不 變，本發(fā)明提供的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶更加適合工業(yè)化生產(chǎn)需求，滿足社會生產(chǎn)的要求。
【具體實施方式】
[0023] 重組幾丁質(zhì)脫乙?；讣兓喊凑誑i-NTA Pur i f i cat ion System(美國 Invitrogen公司nvitrogen?K95001)說明書操作。細胞膜可溶性物直接上Ni-NTA柱，依次用 含不同濃度咪唑（50mmo 1 /1、1 OOmmo 1 /1、150mmo 1 /1、200mmo 1 /1)的洗脫液洗脫，收集洗脫 峰，同步收集樣品并進行酶活力與蛋白含量的測定。
[0024] 重組蛋白質(zhì)含量測定：改良型Lowry法蛋白濃度測定試劑盒(上海生工，C504041- 1000)〇
[0025] 幾丁質(zhì)脫乙?；富盍z測：比色管中加入35°C預保溫的濃度為0.05m〇VL的pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液3mL、濃度為200mg//L的4-硝基乙酰苯胺溶液lmL、幾丁質(zhì)脫乙酰酶 液lmL，在35°C下水浴反應(yīng)15min后沸水浴終止酶促反應(yīng)，用蒸餾水定容至10mL，混勻， 3000r/min離心10min，測定上清液在400nm處的吸光值(A400)。無活性的酶液為空白對照。 [0026]幾丁質(zhì)脫乙?；该富顔挝欢x：每小時幾丁質(zhì)脫乙酰酶催化底物產(chǎn)生lyg對硝 基苯胺所需要的酶液的體積定義為一個酶活力單位。
[0027]以下通過實例進一步說明本發(fā)明
[0028] 實施實例1、突變表達質(zhì)粒的構(gòu)建及重組大腸桿菌的獲得
[0029] 根據(jù)野生型酶基因設(shè)計引物，并引入酶切位點，所用引物如下41:5'-CGGAATTCATGGCGCGTGGTGTCCGCAT-S]弓| 入 EcoR I 酶切位點）42:5^ CCAAGCTTCTATGCCGTGGCTTCACCGGA-3'（引入HindllI酶切位點）。以Sa 1 inispora arenico 1 a 基因組DNA為模板進行PCR，PCR反應(yīng)體系為：ddH20 (17 · 5yL)，buf f er (2 · 5yL)，Mg2+(2 · 5yL)， (1抑^(0.541^，？1(0.541^，？2(0.541^，模板（141^，了39酶（0.241^。？0?程序：94°(：預變性 5min，然后 941€3〇8,541€4〇8,721€7〇8，循環(huán)35次；72°(：延伸51^11。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖 凝膠電泳進行檢測后測序。將上述PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳、純化，與pMD18-T 連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，從陽性菌落中提取重組質(zhì)粒pMD18-T-cacLpMD18-T-cad和表達載 體pEtac雙酶切后，1%的瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段，將酶切后的膠回收產(chǎn)物以一定比 例（基因片段的摩爾量是載體的三倍)混合后16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化DH5a，將重組菌株涂布于 含有50ug/mL的卡那霉素固體LB培養(yǎng)基內(nèi)，37 °C倒置培養(yǎng)過夜，隨機挑選若干個菌落于含有 50ug/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)，37 °C搖瓶培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒pEtac-hi s6-amy，測序 驗證后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)。
[0030] 通過模擬Salinispora arenicola CAD三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)第52位繳氨酸和第66位的 脯氨酸都位于鏈接催化活性中心的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)中，突變后有望改變催化結(jié)構(gòu)域，并改變 底物結(jié)合能力。以含有幾丁質(zhì)脫乙酰基酶質(zhì)粒pEtac-His6_cad為模板，設(shè)計引物進行突變 并將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入E.coli DH5a進行擴增，然后以E.coli BL21(DE3)表達含突變 基因的重組質(zhì)粒，得到活性提高的突變體。。并將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入E. co 1 i DH5a進行 擴增，然后以E. co 1 i BL21 (DE3)表達含突變基因的重組質(zhì)粒，得到活性提高的突變體。 [0031]所述用于定點突變的引物是：
[0032] cadV52G primerlATGGTGGCCACACCTGGCGGGTGTGG
[0033] cadV52G primer2CCACACCCGCCAGGTGTGGCCACCAT
[0034] cadP66S primerlATCGCGTTGACCTTCGACGACGGACCCAA
[0035] cadP66S primer2TTGGGTCCGTCGTCGAAGGTCAACGCGAT
[0036] PCR管中加入lOmmol/L MgC12 2.5yL，10XPCR buffer 5yL，2.5ymol/L dNTP 4μ L，Taq(5U/yl)0.25yL，上游引物和下游引物（10ymol/L)各lyL，模板DNAlyL，最后加雙蒸水 至50yL，混合后瞬間離心，置于PCR儀上95 °C變性5min，然后94°C變性40s，55 °C退火40s，72 °C延伸lmin,共35個循環(huán)，最后72°C延伸10min反應(yīng)結(jié)束。
[0037] 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后測序。將上述PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳、純化，并和表達載體pEtac雙酶切后，1 %的瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片 段，將酶切后的膠回收產(chǎn)物以一定比例(基因片段的摩爾量是載體的三倍)混合后16°C連接 過夜。轉(zhuǎn)化DH5a，將重組菌株涂布于含有50ug/mL的卡那霉素固體LB培養(yǎng)基內(nèi)，37°C倒置培 養(yǎng)過夜，隨機挑選若干個菌落于含有50ug/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)，37 °C搖瓶培養(yǎng)過 夜，提取質(zhì)粒pEtac-his6_amy，測序驗證后轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)。
[0038] 實施實例2、突變表達載體的轉(zhuǎn)化
[0039]所用培養(yǎng)基組成:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0。將含有編 碼突變幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的基因的重組菌E.coli BL21(DE3)(pEtac-HiS6-cad)活化培養(yǎng) 后接種到含有l(wèi)〇〇yg mL-Ι氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為30mL/250mL，于37°C，200r min-1培養(yǎng);菌體生長到0D600 = 0.6，加入終濃度0.5mM IPTG，30°C，誘導發(fā)酵24h。180r/min 誘導表達511。4°(：、1000(^/1^11冷凍離心51^11收集菌體。蒸餾水重懸菌體，以超聲波細胞粉碎 儀破碎菌體(200W，超3s，停7s，共超聲5min)，4°C，10000r/min離心20min，收集上清液作為 粗酶液。按照Ni-NTA Purification System(美國Invitrogen公司nvitrogen?K95001)說明 書一步純化重組酶。和野生型重組酶相比，突變后的比活力劑催化活性提高3.92倍。
[0040]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

【主權(quán)項】
1. 一種幾丁質(zhì)脫乙?；傅耐蛔凅w，其特征在于，是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示 的幾丁質(zhì)脫乙?；傅牡?2位纈氨酸V突變?yōu)楦拾彼酖，第66位的脯氨酸P點突變?yōu)榻z氨酸 S02. 編碼權(quán)利要求1所述突變體的基因。3. 攜帶權(quán)利要求2所述基因的載體或細胞。4. 一種獲得權(quán)利要求1所述幾丁質(zhì)脫乙?；竿蛔凅w的方法，是通過設(shè)計引物對編碼 幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的基因進行定點突變后表達。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，是以質(zhì)粒pEtac-His6_cad為模板設(shè)計引物 進行突變并將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入E.coli DH5a進行擴增，然后以E.coli BL21(DE3)表 達含突變基因的重組質(zhì)粒，得到活性性增強的幾丁質(zhì)脫乙?；竿蛔凅w。6. 應(yīng)用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)權(quán)利要求1所述幾丁質(zhì)脫乙酰基酶突變體的方法，是將含 有編碼突變幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的基因的重組菌E.coli BL21(DE3)(pEtaC-His6-Cadm)活化 培養(yǎng)后接種到含有l(wèi)〇〇yg mL-1氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，所用培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7 · 0。裝液量為30mL/250mL，于37°C，200r min-1 培 養(yǎng);菌體生長到0D600 = 0.6，加入終濃度0.5mM IPTG，30°C，誘導發(fā)酵24h。取發(fā)酵液，8000r/ min離心10min收集菌體，再適量蒸餾水懸浮細胞，于冰水中超聲破碎4min，12000r/min離心 15min去除細胞碎片，上清液即為粗酶液。
【文檔編號】C12N9/44GK105886487SQ201610438888
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月19日
【發(fā)明人】王松葉, 詹金明, 陳延靜, 陳進利, 趙艷凱
【申請人】江蘇澳新生物工程有限公司