間接elisa檢測(cè)牛腸道病毒2型抗體的檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種采用人工克隆、表達(dá)的重組牛腸道病毒2型VP1+蛋白，在原核系統(tǒng)中高效表達(dá)、純化，以此為抗原建立了檢測(cè)牛腸道病毒2型特異性抗體的間接ELISA方法，并研制出試劑盒，適用于對(duì)牛血清中的牛腸道病毒2型抗體進(jìn)行檢測(cè)，屬于動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：1)簡(jiǎn)便快速：可快速的對(duì)活牛體內(nèi)的牛腸道病毒2型抗體作出評(píng)價(jià)。2)特異：與常見的牛病毒性疾病IBRV、BVDV、BLV的陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。3)穩(wěn)定：重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好。4)安全：不接觸病毒，不具有生物安全問題。
【專利說明】
間接EL ISA檢測(cè)牛腸道病毒2型抗體的檢測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及采用ELISA方法檢測(cè)牛腸道病毒2型（BEV-2)特異性抗體的檢測(cè)試劑 盒，尤指一種間接ELISA檢測(cè)試劑盒，適用于感染后牛血清中BEV-2特異性抗體的檢測(cè)，屬 于動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛腸道病毒（Bovine enterovirus，BEV)是小 RNA 病毒科（Picornaviridae)、腸 道病毒屬（Enterovirus)成員。小RNA病毒是一個(gè)極為繁雜的病毒科，可分為鼻病毒屬、口 蹄疫病毒屬、腸道病毒屬、心病毒屬和甲肝病毒屬等若干個(gè)屬，共200多種病毒，能引起人 和動(dòng)物的多種疾病，如甲肝、口蹄疫等，在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)研究中均具有重大意義。
[0003] 目前針對(duì)BEV進(jìn)行檢測(cè)技術(shù)研究具有重大意義，原因如下：
[0004] 1、一種綜合征可由不同病毒所引起，同一種（型）病毒可以導(dǎo)致不同綜合征；
[0005] 2、感染腸道病毒后多數(shù)為亞臨床表現(xiàn)，不易被發(fā)現(xiàn)；
[0006] 3、普遍分布于世界各地，感染廣泛存在，并且常引起暴發(fā)；
[0007] 4、在環(huán)境中非常穩(wěn)定，能在環(huán)境中存在很長(zhǎng)時(shí)間；
[0008] --這些是腸道病毒屬病毒感染的普遍現(xiàn)象。
[0009] 5、BEV感染宿主范圍非常廣泛，能引起多種動(dòng)物感染，包括人類。
[0010] 因此，對(duì)牛腸道病毒的監(jiān)測(cè)、檢測(cè)和藥物治療應(yīng)該給以足夠重視。
[0011] 腸道病毒多數(shù)情況下不引起明顯嚴(yán)重的臨床癥狀，但是在某些情況下，會(huì)引起各 種臨床綜合征，導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，例如人的脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩基病毒、人腸細(xì)胞病變孤兒 病毒（簡(jiǎn)稱?？刹《荆?，豬水皰病病毒、豬傳染性腦脊髓炎病毒，以及鴨肝炎病毒等。
[0012] 近年來頻繁爆發(fā)、并且致死率較高，嚴(yán)重危害兒童健康的手足口病 (Hand-Foot-Mouth disease，HFMD)就是由腸道病毒引起的一種常見疾病。其病原體復(fù)雜， 引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種（型），包括柯薩奇病毒A組的16、4、5、9、10型等，B組 的2、5型等，以及腸道病毒71型等，其中以柯薩奇病毒A16型（CA16)和腸道病毒71型（EV 71)最為常見。EV71病毒與CA16型病毒感染雖然在臨床表現(xiàn)上比較接近，但EV71病毒還 可以引起如無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，致 死率較高，因此備受關(guān)注。手足口病于2008年5月被列入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》 法定丙類傳染病。
[0013] 目前，對(duì)BEV的研究不是很多，目前沒有BEV引起嚴(yán)重疾病的報(bào)道，但是正因?yàn)檠?究不多，不夠透徹，我們完全可以推論BEV的某些亞型可能會(huì)有高致病性。2005年初北京的 牛場(chǎng)中發(fā)生BEV感染，嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)生產(chǎn)。部分牛場(chǎng)的產(chǎn)奶牛普遍出現(xiàn)了嚴(yán)重腹瀉癥 狀：水樣腹瀉，有泡沫，少數(shù)嚴(yán)重的還有鮮血，體溫變化不明顯，食欲下降，死亡率不高，但產(chǎn) 奶量大幅下降，并且在康復(fù)后大多數(shù)奶牛的產(chǎn)奶量仍不能恢復(fù)到病前的水平，特別是日產(chǎn) 35千克以上高產(chǎn)奶牛；一半以上的奶牛的產(chǎn)奶量第二年仍無法恢復(fù)到病前的水平，嚴(yán)重降 低了生產(chǎn)性能，并且還有污染奶制品的可能。跟蹤調(diào)查顯示目前該病兩年就發(fā)生一次。我 們?cè)诎l(fā)病的牛場(chǎng)中已經(jīng)分離到了 BEV-2毒株，并進(jìn)行了全基因測(cè)序。這或許正是BEV某些 亞型具有高致病性的表現(xiàn)。
[0014] BEV分布非常廣泛，自1959年Moll和Davis首次分離到BEV以來，全世界很多國(guó) 家和地區(qū)，如德國(guó)、澳大利亞、美國(guó)、英國(guó)、北愛爾蘭、日本、法國(guó)、俄羅斯等國(guó)家和地區(qū)，先后 報(bào)道了 BEV的感染情況。根據(jù)這些報(bào)道，BEV呈地方流行性感染，可以從發(fā)生腹瀉、呼吸系 統(tǒng)疾病以及流產(chǎn)等廣泛種類的臨床癥狀的牛體內(nèi)分離到，但更多的是從無任何臨床癥狀的 健康牛體內(nèi)分離到的，有超過90%的感染牛無癥狀，這一點(diǎn)與人腸道病毒感染很相似。
[0015] BEV在環(huán)境中非常的穩(wěn)定，可在動(dòng)物糞便以及附近被污染的水源中發(fā)現(xiàn)。目前的數(shù) 據(jù)說明病毒可以在環(huán)境中存在很長(zhǎng)時(shí)間，并被牛群中的許多動(dòng)物所散發(fā)。調(diào)查西班牙周邊 地區(qū)不同牛群的BEV流行情況，結(jié)果顯示78%的糞便樣品是陽(yáng)性的。部分研究表明在牛群 密集型及內(nèi)包型放牧很普遍的區(qū)域，檢測(cè)到70%的水樣中存在牛腸道病毒RNA;但是在廣 延性的放牧地區(qū)，卻沒有在水樣中檢測(cè)到BEV陽(yáng)性。因此，分享草場(chǎng)和水源的動(dòng)物的密度越 大，BEV的環(huán)境危險(xiǎn)也就越高。
[0016] 另外，BEV樣序列也曾出現(xiàn)在同一地理區(qū)域中的貝殼中，以及綿羊、山羊、馬和鹿的 糞便中，核苷酸序列分析顯示，BEV分離株為異源性的，而且出現(xiàn)種特異性的變異株。這有 可能是含有BEV的牛糞便污染造成的，也有可能是這些動(dòng)物感染了 BEV。因?yàn)橛醒芯勘砻?牛腸道病毒1型（BEV-1)感染宿主范圍非常廣泛，包括人類。在這項(xiàng)研究中，在8個(gè)哺乳動(dòng) 物物種中對(duì)BEV-1的感染情況進(jìn)行了血清流行病學(xué)調(diào)查。血清樣品分別采自來自土耳其不 同地區(qū)的244個(gè)人，1520頭牛，272匹馬，126條狗，281只綿羊，477只山羊，18頭駱駝（單 峰駝）和82頭瞪羚。微量中和試驗(yàn)表明，羚羊和駱駝沒有任何血清陽(yáng)性反應(yīng)，但其他動(dòng)物 血清都有不同程度的陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性率分別為人（30. 3%)，牛（64. 8%)，馬（12. 8%)，狗 (3. 2% )，綿羊（32.8% )和山羊（27.6% )。因此，BEV有引起人類疾病的危險(xiǎn)存在。
[0017] 綜上所述，我們認(rèn)為BEV雖然目前還不是進(jìn)出境檢驗(yàn)檢疫中的法定檢疫項(xiàng)目，但 隨著人們對(duì)它認(rèn)識(shí)的加深，和對(duì)公共衛(wèi)生安全的重視日益加強(qiáng)，BEV很有可能象豬鏈球菌2 型一樣被列為出入境檢疫中的法檢項(xiàng)目，在這種情況下我們提前針對(duì)BEV建立快速、準(zhǔn)確、 敏感的診斷方法，進(jìn)行技術(shù)儲(chǔ)備顯得格外重要。
[0018] 目前對(duì)病毒的檢測(cè)方法主要包括病原學(xué)檢測(cè)方法，分子生物學(xué)檢測(cè)方法以及血清 學(xué)檢測(cè)方法。病原學(xué)檢測(cè)方法包括病毒分離鑒定、熒光抗體檢測(cè)方法、免疫過氧化物酶方法 以及雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（以下簡(jiǎn)稱ELISA)。分子生物學(xué)檢測(cè)方法有熒光PCR、 普通PCR、核酸分子雜交、基因芯片等。血清學(xué)檢測(cè)方法包括中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、瓊脂 免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、ELISA等。在這些方法中，ELISA是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的 技術(shù)，具有靈敏度高（可達(dá)ng甚至pg水平）、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化 操作（有商品化的全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀）等特點(diǎn)，并且對(duì)環(huán)境沒有污染。不僅適用于臨床標(biāo) 本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本，因此也適合于血清流行病學(xué) 調(diào)查。在實(shí)際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計(jì)，具體的方法有多種：用于檢測(cè)抗體的間接法、用于檢 測(cè)抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等。
[0019] 目前關(guān)于研究檢測(cè)BEV和其抗體的ELISA方法的報(bào)道較少，目前尚未有采用原核 表達(dá)的重組蛋白建立ELISA檢測(cè)方法。同重組抗原方法相比，純化等量的全病毒或病毒亞 單位相對(duì)更為耗時(shí)和昂貴。VP1抗原穩(wěn)定而且不具有感染性，適合于作為ELISA檢測(cè)的抗 原。為進(jìn)一步建立能滿足國(guó)際貿(mào)易需求的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)試劑，我們開展了本研究。本研究利 用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)VP1+蛋白，經(jīng)包涵體的洗滌、溶解和復(fù)性，獲得較高純度的目的蛋白，同 時(shí)，通過方陣滴定初步建立了檢測(cè)BEV抗體的間接ELISA方法，并對(duì)臨床樣品進(jìn)行了檢測(cè)， 為試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化和商品化奠定基礎(chǔ)。
[0020] 本發(fā)明首次采用原核表達(dá)的重組蛋白應(yīng)用于牛腸道病毒2型抗體的檢測(cè)，制備純 化了重組蛋白，建立了間接ELISA檢測(cè)方法，研制出了檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 本發(fā)明的目的是人工克隆一段含有牛腸道病毒VP1蛋白的核酸片段，實(shí)現(xiàn)其高效 表達(dá)，并將表達(dá)的重組蛋白純化，作為包被抗原，建立重組間接ELISA方法，從而研制出重 組間接ELISA檢測(cè)試劑盒。
[0022] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0023] 1)BEV VP1編碼基因擴(kuò)增、克隆
[0024] 用DNAMAN軟件將毒株BJ001的全基因序列與GenBanK數(shù)據(jù)庫(kù)中提交的BEV序列 進(jìn)行比對(duì)和分析，然后用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增包含VPl(840bp)蛋白基因片 段的VPl+(1275bp)序列。引物名稱、序列見表1。
[0025] 表1用于VP1+基因擴(kuò)增的引物
[0026]
[0027] 注：斜體帶下劃線的序列為酶切位點(diǎn)
[0028] 提取BEV-2病毒核酸，以BEV2-VPl-f、BEV2-VPl-r為引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增 條件如下：94°C變性2min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)是94°C /45s、51°C /45s、72°C /lmin，40個(gè) 循環(huán)后，72°C延伸lOmin。將擴(kuò)增的基因片段克隆至pMD-T19載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ToplO 中，篩選陽(yáng)性克隆子，測(cè)序正確后，放置_80°C保存。其質(zhì)粒命名為pMD-T19-BEV2-VPl+。
[0029] 2)原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
[0030] 將質(zhì)粒pMD-T19-BEV2-VPl+和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a同時(shí)經(jīng)限制性內(nèi)切酶 EcoRI、Hind III雙酶切，用連接酶連接過夜，次日轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ToplO。挑取單克 隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的送公司測(cè)序。將重組質(zhì)粒命名為 pET-32a-BEV2-VPl+。
[0031] 3)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及優(yōu)化
[0032] 將重組質(zhì)粒pET-32a-BEV2-VPl+轉(zhuǎn)化到Rosetta宿主菌，培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，取誘導(dǎo)前后的菌液，12000rpm離心10min，收集菌體，充分裂解后，加入等體 積的2XSDS-PAGE上樣緩沖液，100°C煮沸5min。取10uL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳顯示該 蛋白為包涵體表達(dá)。
[0033] 對(duì)培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間以及加入IPTG的終濃度等一系列條件進(jìn)行優(yōu)化。
[0034] 4)包涵體蛋白的洗滌、溶解
[0035] 將包涵體用含2mol/L、4mol/L、6mol/L尿素的Tris緩沖液依次進(jìn)行洗滌后，再用 含8mol/L尿素的Tris緩沖液溶解，最后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。
[0036] 5)蛋白的純化、復(fù)性
[0037] 蛋白純化用HIS. BIND resin蛋白純化試劑盒在變性條件下進(jìn)行。
[0038] 將純化后的蛋白裝入透析袋中，透析梯度依次為6mol/L、4mol/L、2mol/L、0mol/L 尿素的Tris緩沖液，進(jìn)行透析復(fù)性。蛋白復(fù)性后，用Western-Blot檢測(cè)其反應(yīng)原性。
[0039] 6)重組間接ELISA方法的建立
[0040] 用碳酸鹽緩沖液將抗原按1 : 50、1 : 100依次倍比稀釋至1 : 6400包被酶標(biāo)板； 用含1%BSA的PBST將陽(yáng)性血清、陰性血清按1 : 20、1 : 40、1 : 80、1 : 160稀釋，進(jìn)行 ELISA方陣試驗(yàn)，測(cè)其0D450nm值，來確定抗原包被濃度和血清最佳工作濃度。
[0041] 確定抗原包被濃度和血清最佳工作濃度后，將酶標(biāo)蛋白G作1 : 500、1 : 1000、 1 : 1500稀釋，作ELISA，測(cè)其0D450nm值，以測(cè)定酶標(biāo)蛋白G工作濃度。
[0042] 分別以5 %脫脂奶粉、1 %牛血清白蛋白和1 %卵清蛋白封閉，比較封閉效果，從而 確定封閉液。
[0043] 按優(yōu)化好的條件對(duì)30份BEV-2陰性血清樣品進(jìn)行間接ELISA測(cè)定，用酶標(biāo)儀檢測(cè) 0D450nm值，以0D平均值(7)加3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差（SD)作為判定的臨界值，待檢血清高于此值的 判為陽(yáng)性，小于等于此值的為陰性。
[0044] 7)重組間接ELISA的特異性
[0045] 用間接ELISA方法檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV)陽(yáng)性血清、牛病毒性腹瀉病 毒（BVDV)陽(yáng)性血清、牛白血病病毒（BLV)陽(yáng)性血清、BEV-2陽(yáng)性血清，驗(yàn)證該ELISA方法的 特異性。
[0046] 8)間接ELISA的重復(fù)性
[0047] 用重組蛋白包被ELISA板，選取4份血清樣品，重復(fù)4次，進(jìn)行板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；用 重組蛋白分別包被3塊ELISA板，檢測(cè)板間重復(fù)性，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，分別計(jì) 算板內(nèi)和板間變異系數(shù)。
[0048] 9)臨床樣品檢測(cè)
[0049] 用建立的間接ELISA方法檢測(cè)美國(guó)、澳大利、新西蘭、加拿大進(jìn)口牛的血清及國(guó)內(nèi) 牛血清，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率。
[0050] 10)間接ELISA與中和試驗(yàn)結(jié)果分析比較
[0051 ] 用建立的間接ELISA方法對(duì)45份不同中和效價(jià)的BEV-2陽(yáng)性血清做倍比稀釋，測(cè) 其ELISA效價(jià)，與中和效價(jià)進(jìn)行分析比較。
[0052] 11) ELISA包被板保存期的確定
[0053] 將包被的蛋白酶標(biāo)板（蛋白包被時(shí)加入0· 01 %的疊氮鈉）密封后置于4°C冰箱中 保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，測(cè)定其穩(wěn)定性。
[0054] 用建立的間接ELISA方法檢測(cè)362份不同國(guó)家牛血清，數(shù)據(jù)顯示：除加拿大以外其 他各國(guó)陽(yáng)性率均高達(dá)80 %以上。
[0055] -種檢測(cè)血清中BEV抗體的間接ELISA試劑盒，由以下組分組成：
[0056] 1)包被有BEV抗原的重組酶標(biāo)反應(yīng)板：將純化的重組蛋白用包被液（pH9. 6的碳 酸鹽緩沖液）稀釋為1. 56 μ g/mL，100 μ L/孔加入酶標(biāo)反應(yīng)板，包被條件為37°C lh，然后于 4°C條件下過夜。棄去孔內(nèi)液體，然后用洗滌液（PBST)洗滌3遍，排干反應(yīng)板，加入含1%牛 血清白蛋白的PBST封閉，100 μ L/孔，37°C作用2h效果最好，棄去孔內(nèi)液體，然后用洗滌液 (PBST)洗滌3遍，排干反應(yīng)板，然后真空包裝，存于4°C。
[0057] 2)樣品稀釋液：1%卵清蛋白溶液，取卵清蛋白lg，溶于100mL 1XPBST緩沖液中。
[0058] 3) 10 X 濃縮洗滌液：10 X 濃縮的 PBST 洗滌液（含 0· 5% Tween-20 的 0· Olmol/L、 pH7. 4 的 PBS)。
[0059] 4)陽(yáng)性對(duì)照，BEV陽(yáng)性血清，用樣品稀釋液稀釋至用本方法檢測(cè)的0D值為 1. 0+/-0. 1的范圍內(nèi)。
[0060] 5)陰性對(duì)照，BEV抗體呈陰性的牛血清，用樣品稀釋液作1 : 40稀釋。
[0061] 6)底物稀釋液，含0. 15mg/mL尿素過氧化氫的磷酸鹽檸檬酸緩沖液（pH 5. 0， 24. 3ml 0. 1M檸檬酸溶液加入到25. 7ml 0. 2M磷酸鈉溶液中，用純水定容至100mL)
[0062] 7) 10 X濃縮TMB底物液：10mg TMB溶于lmL的底物稀釋液中。
[0063] 8) 2000 X濃縮辣根過氧化物酶標(biāo)記的重組蛋白G :HRP標(biāo)記的rec Protein G。
[0064] 9)終止液，1 % SDS溶液。
[0065] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明選擇牛腸道病毒保守的VP1蛋白作為目標(biāo)，擴(kuò)增、克隆得 到VP1蛋白基因片段，并實(shí)現(xiàn)了在原核系統(tǒng)的高效表達(dá)，建立了間接ELISA檢測(cè)方法并研制 出試劑盒，取得了優(yōu)異的技術(shù)效果：
[0066] 1)簡(jiǎn)便快速：可快速的對(duì)牛腸道病毒抗體作出評(píng)價(jià)。
[0067] 2)特異：與牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV)陽(yáng)性血清、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV) 牛白血病病毒（BLV)陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0068] 3)穩(wěn)定：重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好。
[0069] 4)安全：不接觸病毒，不具有生物安全問題。
[0070] 下面結(jié)合說明書附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
【附圖說明】
[0071] 圖1牛腸道病毒2型VP1+蛋白擴(kuò)增結(jié)果。
[0072] 圖2重組蛋白BEV VP1+的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果。
[0073] 圖3Western_Blot評(píng)價(jià)重組蛋白的反應(yīng)原性結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0074] 實(shí)施例1、試劑盒的配制和使用
[0075] 1、試劑盒的配制組成見表2。
[0076] 表2試劑盒配制組成
[0077]

[0078] 2、試劑盒的使用方法
[0079] 1)用樣品稀釋液40彳首稀釋被測(cè)樣品（例如：10 μ 1樣品加390 μ 1樣品稀釋液）。 不稀釋陽(yáng)性和陰性對(duì)照。取每個(gè)樣品后都要更換吸頭，準(zhǔn)確記錄每個(gè)樣品在板上的位置。每 個(gè)樣品應(yīng)在添加到包被板前混勻。
[0080] 2)使用前所用試劑應(yīng)恢復(fù)至室溫。試劑應(yīng)輕輕旋轉(zhuǎn)或振蕩予以混合。濃縮洗滌液 使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫，并搖動(dòng)使沉淀鹽溶解。使用前濃縮洗滌液應(yīng)用蒸餾水或去離子水10 倍稀釋。
[0081] 3)取出抗原包被板，在記錄表上記錄樣本的位置。在Α1孔內(nèi)加入100 μ 1陰性對(duì) 照。在Β1的孔內(nèi)加入100 μ 1陽(yáng)性對(duì)照。在其余孔內(nèi)分別加入100 μ 1已稀釋好的樣本。
[0082] 4) 37°C下孵育1小時(shí)（濕盒內(nèi)）。
[0083] 5)吸取各孔的液體棄入廢液筒。用大約350 μ 1洗滌液洗滌板孔，重復(fù)4次。每次 洗滌后應(yīng)吸去孔內(nèi)的液體。注意應(yīng)避免包被板孔干燥。在最后一次洗滌液吸去后，將每塊 板中殘留的洗滌液扣拍到吸水材料上。
[0084] 6)稀釋HRP標(biāo)記的重組蛋白G，HRP標(biāo)記的重組蛋白G用樣品稀釋液作1 : 2000 稀釋。每孔加入100 μ 1稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗。
[0085] 7) 37°C下孵育1小時(shí)（濕盒內(nèi)）。重復(fù)上面的步驟5)。
[0086] 8)每孔加入100 μ LTMB底物液，室溫下孵育15分鐘。每孔加入100 μ L終止液，使 反應(yīng)終止。測(cè)量并且記錄樣本和對(duì)照的0D值（450nm)。
[0087] 9)結(jié)果判定。符合下列條件，實(shí)驗(yàn)方能有效：陽(yáng)性對(duì)照的值必須大于或等于0. 5， 陰性對(duì)照值必須小于或等于0. 250。如果試驗(yàn)無效，試驗(yàn)中的操作值得懷疑，試驗(yàn)應(yīng)重做，并 應(yīng)全面的仔細(xì)核對(duì)各組份。試劑盒檢測(cè)的臨界值為0. 3925,如果測(cè)定的0D值小于等于臨界 值，樣品應(yīng)判為BEV抗體陰性；如果測(cè)定的0D值大于臨界值，樣品應(yīng)判為BEV抗體陽(yáng)性。
[0088] 實(shí)施例2、試劑盒抗原制備中基因克隆與重組蛋白的表達(dá)
[0089] 1、材料
[0090] TRIZ0L，購(gòu)自 Invitrogen 公司；
[0091] DNA片段回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRI和Hind III、質(zhì)?？焖偬崛〖兓噭?盒，購(gòu)自TaKaRa公司；
[0092] M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶，購(gòu)自Promega公司；
[0093] HRP標(biāo)記的rec Protein G，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。
[0094] 2、方法
[0095] 1)提取 BEV-2 病毒核酸，以 BEV2-VPl-f、BEV2-VPl-r 為引物，進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：94°C變性2min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)是94°C /45s、51°C /45s、 72°C /lmin，40個(gè)循環(huán)后，72°C延伸lOmin。將擴(kuò)增的基因片段克隆至pMD-T19載體并轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌ToplO中，篩選陽(yáng)性克隆子，測(cè)序正確后，放置-80°C保存。其質(zhì)粒命名為 PMD-T19-BEV2-VP1+。
[0096] 2)原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定，將質(zhì)粒pMD-T 19-BEV2-VP1 +和原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a同時(shí)經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI、Hind III雙酶切，用連接酶連接過夜，次日轉(zhuǎn)化至大 腸桿菌Top 10。挑取單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的送公司測(cè)序。 將重組質(zhì)粒命名為pET-32a-BEV2-VPl+。
[0097] 3)將重組質(zhì)粒pET-32a-BEV2_VPl+轉(zhuǎn)化到Rosetta宿主菌，培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，取誘導(dǎo)前后的菌液，12000rpm離心10min，收集菌體，充分裂解后，加入等體 積的2XSDS-PAGE上樣緩沖液，100°C煮沸5min。取10uL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳顯示該 蛋白為包涵體表達(dá)。
[0098] 4)將包涵體用含2mol/L、4mol/L、6mol/L尿素的Tris緩沖液依次進(jìn)行洗滌后，再 用含8mol/L尿素的Tris緩沖液溶解，最后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。
[0099] 5)蛋白純化用HIS. BIND resin蛋白純化試劑盒在變性條件下進(jìn)行。
[0100] 6)將純化后的蛋白裝入透析袋中，透析梯度依次為6mol/L、4mol/L、2mol/L、 Omol/L尿素的Tris緩沖液，進(jìn)行透析復(fù)性。蛋白復(fù)性后，用Western-Blot檢測(cè)其反應(yīng)原 性。
[0101] 3、結(jié)果
[0102] 1)對(duì)牛腸道病毒2型VP1+蛋白基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳 可見一條與預(yù)期大?。?275bp)相符的DNA片段，見圖1。
[0103] 2)將克隆到pMD-T19載體的目的片段和原核表達(dá)質(zhì)粒pET_32a同時(shí)經(jīng)限 制性內(nèi)切酶EcoRI、Hindlll雙酶切，用連接酶連接過夜，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體 pET-32a-BEV2-VPl+。將重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與原序列一致。
[0104] 3)將重組質(zhì)粒pET-32a-BEV2-VPl+轉(zhuǎn)化至Rosetta宿主菌后，在37°C溫箱培養(yǎng)一 段時(shí)間后，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE顯示在預(yù)期分子量大小處即52Kda出現(xiàn)大量 表達(dá)的特異蛋白條帶（見圖2)。
[0105] 4)重組蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化：經(jīng)摸索確定最佳表達(dá)條件為菌液培養(yǎng)至0D600nm = 0. 6時(shí)，用0. 6mmol/LIPTG在37°C誘導(dǎo)4h，目的蛋白為包涵體表達(dá)，最終溶于8mol/L尿素 中。
[0106] 5)純化后得到高純度的重組蛋白，Western-Blot結(jié)果表明重組蛋白具有良好的 反應(yīng)原性，見圖3。
[0107] 6)誘導(dǎo)后不同時(shí)間均可觀察到約24KD的重組蛋白，與預(yù)期大小一致。誘導(dǎo)后2h， 蛋白量達(dá)到高峰。包涵體重新溶解后，收集上清和菌體裂解后的上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳， 檢查包涵體溶解后重組蛋白的純度。表明溶解后的包涵體為高純度重組蛋白，結(jié)果見圖2。
[0108] 實(shí)施例3、試劑盒對(duì)臨床樣品的檢測(cè)
[0109] 1、材料
[0110] 本研究發(fā)明BEV-2抗體間接ELISA試劑盒。
[0111] 不同國(guó)家進(jìn)口牛血清362份。
[0112] 2、方法
[0113] 1)抗原、血清工作濃度的確定：用碳酸鹽緩沖液將重組抗原按1 : 50、1 : 100依 次倍比稀釋至1 : 6400包被酶標(biāo)板；用含1%BSA的PBST將陽(yáng)性血清、陰性血清按1 : 20、 1 : 40、1 : 80、1 : 160稀釋，進(jìn)行ELISA方陣試驗(yàn)，測(cè)其0D450nm值，來確定抗原包被濃度 和血清最佳工作濃度。
[0114] 2)重組蛋白抗原包被條件的確定：以最適濃度抗原包被酶標(biāo)板，100 μ L/孔，分成 2組：第1組：為37°C lh，然后于4°C條件下過夜；第2組，僅為4°C條件下過夜。作ELISA 測(cè)定。
[0115] 3)酶標(biāo)蛋白G工作濃度的測(cè)定：確定抗原包被濃度和血清最佳工作濃度后，將酶 標(biāo)蛋白 G 作 1 : 500、1 : 1000、1 : 1500 稀釋，作 ELISA，測(cè)其 0D450nm 值。
[0116] 4)封閉液的確定：分別以5%脫脂奶粉、1%牛血清白蛋白和1%卵清蛋白封閉，比 較封閉效果。
[0117] 5)臨界值的確定：按優(yōu)化好的條件對(duì)30份BEV-2陰性血清樣品進(jìn)行間接ELISA測(cè) 定，用酶標(biāo)儀檢測(cè)〇D450nm值，以0D平均值（I)加3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差（SD)作為判定的臨界值，待 檢血清高于此值的判為陽(yáng)性。
[0118] 6)間接ELISA的特異性：用間接ELISA方法檢測(cè)IBR陽(yáng)性血清、BVDV陽(yáng)性血清、 BLV陽(yáng)性血清、BEV-2陽(yáng)性血清，驗(yàn)證該ELISA方法的特異性。
[0119] 7)間接ELISA的重復(fù)性：用重組蛋白包被ELISA板，選取4份血清樣品，重復(fù)4次， 進(jìn)行板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；用重組蛋白分別包被3塊ELISA板，檢測(cè)板間重復(fù)性，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，分別計(jì)算板內(nèi)和板間變異系數(shù)。
[0120] 8)臨床樣品檢測(cè)：用建立的間接ELISA方法檢測(cè)美國(guó)、澳大利、新西蘭、加拿大進(jìn) 口牛的血清及國(guó)內(nèi)牛血清，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率。
[0121] 9)間接ELISA與中和試驗(yàn)結(jié)果分析比較：用建立的間接ELISA方法對(duì)45份不同 中和效價(jià)的BEV-2陽(yáng)性血清做倍比稀釋，測(cè)其ELISA效價(jià)，與中和效價(jià)進(jìn)行分析比較。
[0122] 10)ELISA包被板保存期的確定：將包被的蛋白酶標(biāo)板（蛋白包被時(shí)加入0. 01%的 疊氮鈉）密封后置于4°C冰箱中保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月進(jìn)行間接ELISA 檢測(cè)，測(cè)定其穩(wěn)定性。
[0123] 3、結(jié)果
[0124] 1)間接ELISA反應(yīng)條件確定：經(jīng)測(cè)定，抗原包被濃度為1. 56 μ g/mL，37°C溫箱作用 lh后4°C放置過夜；血清最佳工作濃度為1 : 40;酶標(biāo)蛋白G 1 : 1000稀釋時(shí)，P/N值相 對(duì)較大。
[0125] 2)封閉液的確定：封閉液用含1%牛血清白蛋白的PBST封閉，37°C作用2h效果最 好。
[0126] 3)臨界值的確定：測(cè)定30份BEV-2陰性血清，其0D450nm的Γ為0. 1762, SD值為 0· 07211，臨界值為 I+3SD=0. 3925。
[0127] 4)間接ELISA的特異性：間接ELISA結(jié)果顯示，BEV-2陽(yáng)性血清為陽(yáng)性。IBR陽(yáng)性 血清、BVDV陽(yáng)性血清、BLV陽(yáng)性血清0D450nm值均小于0. 3925,為陰性。
[0128] 5)間接ELISA的重復(fù)性：經(jīng)測(cè)定計(jì)算，板內(nèi)變異系數(shù)為2. 20%~7. 56%，板間變 異系數(shù)為2. 28%~8. 42%，均小于10%，證明該方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性高。
[0129] 6)臨床樣品檢測(cè)：用建立的間接ELISA方法檢測(cè)362份不同國(guó)家牛血清，數(shù)據(jù)顯 示：除加拿大以外其他各國(guó)陽(yáng)性率均高達(dá)80%以上，見表3。
[0130] 表3對(duì)不同國(guó)家牛血清的檢測(cè)
[0131]

[0132] 7)間接ELISA與中和試驗(yàn)結(jié)果分析比較
[0133] 兩種方法同時(shí)檢測(cè)45份牛血清，陽(yáng)性符合率為50%，陰性符合率為55. 2%，總符 合率為53. 3%。結(jié)果顯示血清的中和效價(jià)和ELISA效價(jià)不成正相關(guān)，見表4。
[0134] 表4NT和ELISA的符合率試驗(yàn)結(jié)果
[0135]
[0136] 8) ELISA包被板保存期的確定
[0137] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蛋白包被時(shí)加入疊氮鈉對(duì)試驗(yàn)結(jié)果沒有影響，保存于4°C 1~6個(gè)月 的ELISA包被板陰陽(yáng)性血清的變異系數(shù)均小于10%，ELISA包被板保存期為6個(gè)月。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT-PCR方法擴(kuò)增BEV-2包含VPl (840bp)蛋白基因片段的 VPl+(1275bp)序列，并于原核載體pET-32a實(shí)現(xiàn)其高效表達(dá)。下面為擴(kuò)增時(shí)設(shè)計(jì)的引物序 列： BEV2-VP -CCGGAATTCTGGGATTTCGGGCTAC-3r BEV2-VPl-r :5' -CCCAAGCTTTCACACCACTAGTACAG-3'2. -種檢測(cè)牛腸道病毒2型抗體的間接ELISA試劑盒，96testsX 2/盒，由以下組分組 成： 1) 包被有牛腸道病毒2型抗原的重組酶標(biāo)反應(yīng)板：將純化的重組蛋白用包被液（pH9. 6 的碳酸鹽緩沖液）稀釋為1. 56 μ g/mL，100 μ L/孔加入酶標(biāo)反應(yīng)板，包被條件為37°C lh，然 后于4°C條件下過夜。棄去孔內(nèi)液體，然后用洗滌液（PBST)洗滌3遍，排干反應(yīng)板，加入含 1 %牛血清白蛋白的PBST，100 μ L/孔，37°C封閉2h，棄去孔內(nèi)液體，然后用洗滌液（PBST)洗 滌3遍，排干反應(yīng)板，然后真空包裝，存于4°C。 2) 樣品稀釋液：1%卵清蛋白溶液，取卵清蛋白lg，溶于IOOmLlXPBST緩沖液中。 3. IOX 濃縮洗滌液：10X 濃縮的 PBST 洗滌液（含 0· 5% Tween-20 的 0· 01mol/L、pH7. 4 的 PBS)。 4) 陽(yáng)性對(duì)照，牛腸道病毒2型陽(yáng)性血清，用樣品稀釋液稀釋至用本方法檢測(cè)的OD值為 1. 0+/-0. 1的范圍內(nèi)。 5) 陰性對(duì)照，牛腸道病毒2型抗體呈陰性的牛血清，用樣品稀釋液作1 : 40稀釋。 6) 底物稀釋液，含0. 15mg/mL尿素過氧化氫的磷酸鹽檸檬酸緩沖液（PH5. 0， 24. 3ml0.1 M檸檬酸溶液加入到25. 7ml0. 2M磷酸鈉溶液中，用純水定容至IOOmL) 7. IOX濃縮TMB底物液：IOmg TMB溶于ImL的底物稀釋液中。 8) 2000X濃縮辣根過氧化物酶標(biāo)記的重組蛋白G:HRP標(biāo)記的rec Protein G。 9) 終止液，1 % SDS溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)牛腸道病毒2型抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于： 抗原為人工克隆的一段序列于原核載體pET-32a中高效表達(dá)獲得的重組蛋白。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105886496SQ201410581424
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年10月28日
【發(fā)明人】吳丹, 劉艷華, 郭金玉, 谷強(qiáng), 高志強(qiáng), 吳濤, 張鶴曉, 張樂萃, 郭錚蕾, 韓玥, 范斐, 徐姍, 汪琳, 張偉, 蒲靜, 喬彩霞, 柏亞鐸
【申請(qǐng)人】中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局, 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所