大眼長蝽卵黃原蛋白新基因及應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重要半翅目天敵昆蟲大眼長蝽(Geocoris pallidipennis)卵黃原蛋白基因DNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列，補充了半翅目昆蟲卵黃原蛋白基因分子特性的信息，為研究卵黃原蛋白基因在大眼長蝽營養(yǎng)和生殖調(diào)控中的作用機制、卵黃原蛋白基因功能提供了新基因。該發(fā)明將為大眼長蝽大量繁殖和有效利用提供理論基礎(chǔ)，具有應用于害蟲生物防治的廣闊前景。
【專利說明】
大眼長蝽卵黃原蛋白新基因及應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明公開了一種卵黃原蛋白新基因 DNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列，屬于基因 工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種大眼長蝽（Geocoris pallidipennis)卵黃原蛋 白新基因的克隆及應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵黃原蛋白（Vitellogenin，Vg)是特異地存在于非哺乳類性成熟的卵生雌性動 物血液中的一種蛋白，是幾乎所有卵生動物卵黃蛋白的前體。卵黃原蛋白是卵黃發(fā)生的關(guān) 鍵性物質(zhì)，在卵生動物的生殖發(fā)育中起重要作用，它在雌性脂肪體中合成，分泌到血淋巴， 然后通過內(nèi)吞作用被發(fā)育中的卵母細胞攝取，為正在發(fā)育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化 合物、維生素、磷、硫及微量元素等營養(yǎng)和功能性物質(zhì)。
[0003] 昆蟲卵黃原蛋白的研究是近年來昆蟲生理學和生物化學研究的熱點。到目前為 止，已有多種昆蟲的Vg基因被克隆和鑒定，主要包括網(wǎng)翅目、半翅目、鱗翅目、雙翅目、鞘翅 目、脈翅目及膜翅目等昆蟲，但大眼長蝽Vg基因的克隆未見報道。大眼長蝽是一種重要的 半翅目天敵昆蟲，能夠有效地控制棉蚜、棉葉螨、棉薊馬、苜蓿盲蝽、葉蝶、紅鈴蟲、棉鈴蟲等 農(nóng)業(yè)害蟲，是棉花和其它作物害蟲的重要捕食性天敵，由于其分布廣，數(shù)量多，取食范圍廣 而受到生防工作者的關(guān)注。大眼長蝽卵黃原蛋白與該天敵昆蟲營養(yǎng)生理和生殖特性緊密相 關(guān)，因此，研究大眼長蝽卵黃原蛋白具有重要意義和應用價值。本發(fā)明首次在半翅目天敵昆 蟲大眼長蝽中克隆了卵黃原蛋白基因，并對其編碼的氨基酸序列、同源性及進化地位進行 了分析，為Vg基因功能及大分子生物進化研究提供了新基因，為該重要天敵昆蟲大量繁育 和有效利用提供了理論基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明包括以下內(nèi)容：
[0005] 1.本發(fā)明提供了一種編碼大眼長蝽卵黃原蛋白的多核苷酸分子SEQ ID N0. 1，所 述的多核苷酸分子包括與SEQ ID NO. 1相符合的核苷酸序列以及與SEQ ID NO. 1所示的核 苷酸序列部分相符合并具有相似功能的片斷。
[0006] 2.本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，所述的蛋白質(zhì)包含與SEQ ID N0. 2氨基酸序列基本 及部分相符合的氨基酸序列。
[0007] 3. -種卵黃原蛋白基因應用的方法，包括通過監(jiān)測卵黃原蛋白基因片段表達量， 來研究卵黃原蛋白片段含量，從而研究卵黃原蛋白片段對昆蟲營養(yǎng)和生殖如產(chǎn)卵量、發(fā)育 歷期影響的方法。
[0008] 文中涉及氨基酸序列的地方使用"基本相符"這一術(shù)語是想包含那些不會導致卵 黃原蛋白質(zhì)生物活性降低的氨基酸序列上的變化.這些變化可能包括保守的氨基酸替代 等。
[0009] 有益效果
[0010] 1.本發(fā)明公開了一種編碼大眼長蝽卵黃原蛋白基因（GpVg)及其所編碼的蛋白 質(zhì)。該基因為大眼長蝽（Geocoris pallidipennis)中的首次報道，為進一步研究大眼長蝽 卵黃原蛋白基因的表達、調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)；為研究卵黃原蛋白基因參與大眼長蝽生殖 發(fā)育、為該重要天敵昆蟲大量繁育和有效利用提供了理論指導；同時該基因功能及其編碼 產(chǎn)物研究結(jié)果也可應用于其他天敵昆蟲營養(yǎng)和生殖方面的研究，為天敵昆蟲在生物防治以 及害蟲的綜合防治中的利用提供理論基礎(chǔ)。
[0011] 2.本發(fā)明提供了大眼長蝽卵黃原蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)，該卵黃原蛋白基 因補充了半翅目昆蟲卵黃原蛋白基因分子特性的信息，為研究大分子進化提供了有用的材 料。
[0012] 下面將引用非限定性實例對本發(fā)明作進一步的說明。
【具體實施方式】
[0013] 實例 1
[0014] 大眼長蝽卵黃原蛋白Vg基因 cDNA的克隆，通過以下步驟進行：從大眼長蝽羽化雌 性成蟲中提取總RNA ;按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成，根據(jù)半變態(tài)昆蟲已知Vg 保守區(qū)設計兩對簡并引物，以上述cDNA為模板進行PCR擴增，純化以上步驟所得PCR產(chǎn)物， 瓊脂糖凝膠回收目的片段，取純化產(chǎn)物連接到PMD19-T simple載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 感受態(tài)細胞DH5a，37°C平板培養(yǎng)，以M13通用引物對陽性克隆子進行PCR檢測鑒定；根據(jù)克 隆測序的結(jié)果，設計特異引物，將兩片段之間的序列連接起來；按Clontech-RACE試劑盒操 作步驟反轉(zhuǎn)錄進行cDNA第一鏈的合成，并根據(jù)已知的序列設計3'和5' -RACE特異引物， 按照Clontech試劑盒操作步驟進行3'-末端和5'-末端序列擴增，純化步驟所得PCR產(chǎn) 物，瓊脂糖凝膠回收目的片段，取純化產(chǎn)物連接到PMD19-T simple載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿 菌感受態(tài)細胞DH5a，37°C平板培養(yǎng)，以M13通用引物對陽性克隆子進行PCR檢測鑒定；根據(jù) 以上步驟所得的陽性克隆序列測定結(jié)果，將所測得基因序列拼接，得到大眼長蝽卵黃原蛋 白基因全長序列。本發(fā)明大眼長蝽卵黃原蛋白基因（GpVg)DNA序列SEQ ID N0. 1，為首次在 大眼長蝽中克隆的卵黃原蛋白基因，該基因的序列完整，填補了半翅目昆蟲卵黃原蛋白基 因克隆的分子信息，也為研究大分子進化提供了有用的材料。BLAST的結(jié)果證明：該卵黃原 蛋白基因為一新基因。本發(fā)明提供的大眼長蝽卵黃原蛋白基因及其所編碼的產(chǎn)物可應用于 昆蟲營養(yǎng)和生殖方面的研究，同時該發(fā)明也可以應用于天敵昆蟲大量擴繁和工廠化生產(chǎn)。
[0015] 實例 2
[0016] 上述獲得的大眼長蝽（Geocoris pallidipennis)卵黃原蛋白基因 GpVg的DNA 序列SEQ ID N0 :1，其編碼的蛋白質(zhì)含有1848個氨基酸，其序列見SEQ ID N0 :2。在數(shù)據(jù) 庫中比較，卵黃原蛋白基因 GpVg編碼的蛋白質(zhì)與數(shù)據(jù)庫中Riptortus clavatus、Plautia stali、Triatoma infestans、Pyrrhocoris apterus 的相似性分別為 57%、43%、40%、 43%，與 Apolygus lucorum、Nesidiocoris tenuis 等均在 40%之下。
[0017] 綜上所述，本發(fā)明公開了一種大眼長蝽卵黃原蛋白Vg基因（GpVg)及其所編碼的 蛋白質(zhì)。該基因為半翅目天敵昆蟲大眼長蝽中的首次報道，本發(fā)明實例證明該基因能應用 于研究天敵昆蟲營養(yǎng)生理和生殖特性、為該重要天敵昆蟲大量繁育和有效利用提供了理論 指導，填補了半翅目昆蟲卵黃原蛋白基因的信息，也為研究大分子進化提供了有用的材料。 同時該基因及其表達的重組蛋白質(zhì)在天敵昆蟲營養(yǎng)和生殖研究方面、在生物防治以及害蟲 的綜合防治領(lǐng)域具有良好的應用前景。
【主權(quán)項】
1. 一種大眼長蝽卵黃原蛋白基因 Vg的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述。2. 如權(quán)利要求1所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。3. -種如權(quán)利要求1所述的大眼長蝽卵黃原蛋白基因 cDNA克隆方法，包括以下步驟： (1) 從大眼長蝽中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ; (2) 根據(jù)GenBank登錄的半變態(tài)昆蟲Vg基因保守序列設計2對簡并引物； (3) 以步驟⑴得到的cDNA為模板，用步驟⑵所述的引物進行PCR擴增，得到目的片 段； (4) 根據(jù)已知的目的片段設計特異引物，以步驟⑴的cDNA為模板進行PCR擴增，得到 擴增片段，將兩片段之間的序列連接起來； (5) 根據(jù)已知序列的5'和3'端，設計5' -RACE和3' -RACE特異性引物； (6) 按照Clontech-RACE試劑盒操作步驟反轉(zhuǎn)錄進行cDNA的合成； (7) 以cDNA為模板，步驟（5)所述的引物，PCR擴增大眼長蝽Vg基因的5' -末端和 3' -末端序列； (8) 將所述基因5'和3'端序列與擴增片段拼接，得到權(quán)利要求1所述的cDNA。4. 如權(quán)利要求1和2所述的應用，其特征在于：應用的材料中包含權(quán)利要求1多核苷 酸序列或權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)。
【文檔編號】C12N15/10GK105886513SQ201410618992
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月6日
【發(fā)明人】曾凡榮, 梁慧芳, 毛建軍
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所