一種高效的細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效的細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法，其主要內(nèi)容包括：(1)納米氧化鋁可用于細(xì)菌的轉(zhuǎn)化；(2)革蘭氏陰性菌HB101、K12可基于納米氧化鋁作用發(fā)生轉(zhuǎn)化；(3)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌可基于納米氧化鋁作用發(fā)生轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的技術(shù)和方法不要求低溫條件，室溫即可實現(xiàn)；本發(fā)明步驟簡便，無熱激步驟；本發(fā)明高效，細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率高于統(tǒng)CaCl2法；本發(fā)明不但能實現(xiàn)革蘭氏陰性菌轉(zhuǎn)化，也可以實現(xiàn)革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)化。因此本發(fā)明中的技術(shù)和方法簡單、高效、通用，非常適合實驗室科研及工程菌制備等領(lǐng)域。
【專利說明】
一種高效的細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于納米氧化鋁的高效細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]把外源基因?qū)胧荏w細(xì)菌中，使之具有新的可遺傳性狀的過程稱之為轉(zhuǎn)化，是現(xiàn)代基因工程與分子生物學(xué)最重要的操作技術(shù)之一。轉(zhuǎn)化效率的高低決定后續(xù)工作的開展，而細(xì)菌的狀態(tài)是影響轉(zhuǎn)化效率最關(guān)鍵的因素之一。目前革蘭氏陽性細(xì)菌發(fā)生轉(zhuǎn)化比較困難，高效成熟的技術(shù)尚處于探索之中。革蘭氏陰性細(xì)菌以大腸桿菌為例感受態(tài)細(xì)胞的獲得方法主要有兩種，CaCl2法和電轉(zhuǎn)化法，其缺陷要么是步驟復(fù)雜轉(zhuǎn)化率低，要么是需要特定的儀器設(shè)備條件，且對于低溫環(huán)境和細(xì)菌的對數(shù)生長狀態(tài)都有較高的要求。納米材料能引起細(xì)菌細(xì)胞膜的氧化損傷，引起皺褶甚至孔洞，造成膜功能通透性的改變。因此探究一種基于納米材料作用的轉(zhuǎn)化效率高、操作步驟簡單、溫度和細(xì)菌生長條件要求低、革蘭氏陰性菌和陽性菌通用的細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法對分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)領(lǐng)域具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種基于納米鋁高效細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明用納米氧化鋁處理方法實現(xiàn)細(xì)菌轉(zhuǎn)化，可以用10ng質(zhì)粒與18細(xì)胞作用獲得15-1O7個轉(zhuǎn)化子。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0005]一種基于納米氧化鋁的高效細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟:
[0006](I)挑取新活化的細(xì)菌單克隆，接種到1ml Luria-Bertani培養(yǎng)基,在37°C、21Orpm條件下振蕩培養(yǎng)至0D_約為I ;
[0007](2)將(I)中的菌體按 1%接種到 1ml Luria-Bertani 培養(yǎng)基,在 37°C、210rpm條件下振蕩培養(yǎng)12h ；
[0008](3)用Luria-Bertani培養(yǎng)基將(2)中的菌體稀釋100倍，取1.5ml菌體稀釋液置于滅菌的1.5ml離心管中，在室溫下離心，棄上清收集細(xì)菌，離心參數(shù)為5000 X 1min ；
[0009](4)向離心管中加入濃度10mmol/L的納米氧化鋁(顆粒直徑小于50nm) 100 μ I與細(xì)菌細(xì)胞震蕩混勻，室溫下靜止作用一定時間；
[0010](5)將菌液過0.22 μ m微孔濾膜，濾除去納米氧化鋁顆粒；
[0011](6)滅菌生理鹽水沖洗微孔濾膜回收細(xì)胞，在室溫下離心菌液，棄上清去除殘留的納米氧化鋁，離心參數(shù)為5000 X 1min ；
[0012](7)用100 μ I生理鹽水重懸菌體細(xì)胞備用；
[0013](8)加入10ng質(zhì)粒DNA,潤輪振蕩2min ；
[0014](9)加 Luria-Bertani 培養(yǎng)基 900 μ I,在 37°C、21rpm 條件下振蕩復(fù)蘇 Ih ；
[0015](10)菌液涂布在含有相應(yīng)抗生素的選擇性平板上，37°C培養(yǎng)，生長的菌落即為轉(zhuǎn)化成功的克隆。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明采用的納米鋁原子力顯微鏡照片，其中(a)2D，(b)3D。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明:
[0018]實施例1本發(fā)明大腸桿菌HBlOl轉(zhuǎn)化pBR322質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化效率檢測
[0019]材料:pBR322質(zhì)粒、大腸桿菌HB101、納米氧化招(顆粒< 50nm)、CaCl2
[0020]試劑:LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨1g,酵母提取物5g,氯化鈉1g,蒸懼水定容至1000ml, 121°C滅菌20min。LB固體培養(yǎng)基為液體配方加入1.5%的瓊脂。
[0021]主要實施步驟如下:
[0022]一、本發(fā)明大腸桿菌HBlOl轉(zhuǎn)化pBR322質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化效率檢測
[0023](I)挑取新活化的細(xì)菌單克隆，接種到1ml LB培養(yǎng)基，37°C，210rpm，振蕩培養(yǎng)，至OD600約為I ;
[0024](2)將菌體按I %接種到1mi LB培養(yǎng)基，37°C，210rpm,振蕩培養(yǎng)12h ；
[0025](3)菌體稀釋100倍，1.5ml菌體稀釋液/1.5mlEP管，室溫,5000rpm,離心1min,
棄上清，收集細(xì)胞；
[0026](4)每1.5mlEP管加入1mM納米氧化鋁(顆粒直徑小于50nm) 100 μ 1，室溫作用9h ；
[0027](5)作用體系過0.22 μ m微孔濾膜，回收細(xì)胞，除去納米鋁顆粒；
[0028](6)滅菌的生理鹽水沖洗，室溫，5000rpm，離心lOmin，棄上清去除殘留的納米鋁；
[0029](7)重懸菌體細(xì)胞備用；
[0030](8)取100 μ I菌體細(xì)胞(1s)置于1.5mlEP管，加入10ngDNA,渦輪振蕩2min ；
[0031](9)加 LB 液體培養(yǎng)基 900μ l，37°C，210rpm，振蕩復(fù)蘇 Ih ；
[0032](10)轉(zhuǎn)化菌體傾注在抗性平板中，含Amp 80μ g/ml, Tet 50mg/ml，37°C培養(yǎng)，待長出菌落后觀察計數(shù)。
[0033]二、CaCl2法大腸桿菌HBlOl轉(zhuǎn)化pBR322質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化效率檢測(作為本發(fā)明方法的對比)
[0034](I)挑取新活化的細(xì)菌單克隆，接種到1ml LB培養(yǎng)基，37°C，210rpm，振蕩培養(yǎng)，至OD600約為I ;
[0035](2)將菌體按I %接種到1ml LB培養(yǎng)基，37°C，210rpm,振蕩培養(yǎng)12h ；
[0036](3)菌體稀釋100倍，1.5ml菌體稀釋液/1.5mlEP管，室溫,5000rpm,離心1min,
棄上清，收集細(xì)胞；
[0037](4)每 1.5mlEP 管加入 1.5ml 10mM 冰冷的 CaCl2 中，輕吹，4°C作用 30min ；
[0038](5) 4°C, 5000rpm,離心 1min,棄上清，收集細(xì)胞；
[0039](6)菌體重懸于冰冷的CaCl2中，輕吹，4°C備用；
[0040](7)取100 μ I感受細(xì)胞(1s)置于1.5mlEP管，加入10ng pBR322質(zhì)粒，輕輕搖勻，冰上放置30min ；
[0041]⑶42°C水浴，放置90s熱激；
[0042](9)快速置冰浴，保持2min ；
[0043](10)加 LB 液體培養(yǎng)基 900μ l，37°C，210rpm，振蕩復(fù)蘇 lh。
[0044](11)轉(zhuǎn)化菌體傾注在抗性平板中，含Amp 80μ g/ml, Tet 50mg/ml，37°C培養(yǎng)，待長出菌落后觀察計數(shù)。
[0045]本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化效率7.30±0.91 XlOVyg pBR322plasmid
[0046]傳統(tǒng)CaCl2 方法轉(zhuǎn)化效率 3.65±0.51 X 16/ μ g pBR322plasmid
[0047]結(jié)論:由上述結(jié)果可知，本發(fā)明方法可實現(xiàn)革蘭氏陰性菌大腸桿菌HBlOl轉(zhuǎn)化PBR322質(zhì)粒，其轉(zhuǎn)化效率是傳統(tǒng)氯化鈣法的20倍左右。
[0048]實施例2本發(fā)明大腸桿菌K12轉(zhuǎn)化pBR322質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化效率檢測
[0049]材料:pBR322質(zhì)粒、大腸桿菌K12、納米氧化鋁(顆粒< 50nm)
[0050]試劑:LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨1g,酵母提取物5g,氯化鈉1g,蒸懼水定容至1000ml, 121°C滅菌20min。LB固體培養(yǎng)基為液體配方加入1.5%的瓊脂。
[0051]主要實施步驟如下:
[0052](I)挑取新活化的細(xì)菌單克隆，接種到1ml LB培養(yǎng)基，37°C，210rpm，振蕩培養(yǎng)，至OD600約為I ;
[0053](2)將菌體按I %接種到1ml LB培養(yǎng)基，37°C，210rpm,振蕩培養(yǎng)12h ；
[0054](3)菌體稀釋100倍，1.5ml菌體稀釋液/1.5mlEP管，室溫,5000rpm,離心1min,
棄上清，收集細(xì)胞；
[0055](4)每1.5mlEP管加入1mM納米氧化鋁(顆粒直徑小于50nm) 100 μ 1，室溫作用9h ；
[0056](5)作用體系過0.22 μ m微孔濾膜，回收細(xì)胞，除去納米鋁顆粒；
[0057](6)滅菌的生理鹽水沖洗,室溫，5000rpm,離心1min,棄上清去除殘留的納米氧化招；
[0058](7)重懸菌體細(xì)胞備用；
[0059](8)取100 μ I菌體細(xì)胞(1s)置于1.5mlEP管，加入10ngDNA,渦輪振蕩2min ；
[0060](9)加 LB 液體培養(yǎng)基 900 μ 1，37°C，210rpm,振蕩復(fù)蘇 Ih ；
[0061](10)轉(zhuǎn)化菌體傾注在抗性平板中，含Amp 80μ g/ml, Tet 50mg/ml，37°C培養(yǎng)，待長出菌落后觀察計數(shù)。
[0062]本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化效率3.53 ± 1.28χ105/μ g pBR322plasmid
[0063]結(jié)論:由上述結(jié)果可知，本發(fā)明方法可以實現(xiàn)革蘭氏陰性菌大腸桿菌K12轉(zhuǎn)化PBR322 質(zhì)粒。
[0064]實施例3本發(fā)明金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)化PBR322質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化效率檢測
[0065]材料:pBR322質(zhì)粒、金黃色葡萄球菌、納米氧化鋁(顆粒< 50nm)
[0066]試劑:LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨1g,酵母提取物5g,氯化鈉1g,蒸懼水定容至1000ml, 121°C滅菌20min。LB固體培養(yǎng)基為液體配方加入0.9%的瓊脂。
[0067]主要實施步驟如下:
[0068](I)挑取新活化的細(xì)菌單克隆，接種到1ml LB培養(yǎng)基，37°C，210rpm，振蕩培養(yǎng)，至OD600約為I ;
[0069](2)將菌體按I %接種到1ml LB培養(yǎng)基，37°C，210rpm,振蕩培養(yǎng)12h ；
[0070](3)菌體稀釋100倍，1.5ml菌體稀釋液/1.5mlEP管，室溫,5000rpm,離心1min,
棄上清，收集細(xì)胞；
[0071](4)每1.5mlEP管加入1mM納米氧化鋁(顆粒直徑小于50nm) 100 μ 1，室溫作用9h ；
[0072](5)作用體系過0.22 μ m微孔濾膜，回收細(xì)胞，除去納米氧化鋁顆粒；
[0073](6)滅菌的生理鹽水沖洗,室溫，5000rpm,離心1min,棄上清去除殘留的納米氧化招；
[0074](7)重懸菌體細(xì)胞備用；
[0075](8)取100 μ I菌體細(xì)胞(1s)置于1.5mlEP管，加入10ngDNA,渦輪振蕩2min ；
[0076](9)加 LB 液體培養(yǎng)基 900 μ 1，37°C，210rpm,振蕩復(fù)蘇 Ih ；
[0077](10)轉(zhuǎn)化菌體傾注在抗性平板中，含Amp 80μ g/ml, Tet 50mg/ml，37°C培養(yǎng)，待長出菌落后觀察計數(shù)。
[0078]本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化效率2.96 ±0.56x106/μ g pBR322plasmid
[0079]結(jié)論:由上述結(jié)果可知，本發(fā)明方法可以實現(xiàn)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)化PBR322 質(zhì)粒。
【主權(quán)項】
1.一種高效的細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法，其特征包括以下步驟: (1)挑取新活化的細(xì)菌單克隆，接種到1mlLuria-Bertani培養(yǎng)基,在37°C、210rpm條件下振蕩培養(yǎng)至0D6。。約為I ; (2)將(I)中的菌體按1%接種到1mlLuria-Bertani培養(yǎng)基,在37°C、210rpm條件下振蕩培養(yǎng)12h ； (3)用Luria-Bertani培養(yǎng)基將(2)中的菌體稀釋100倍，取1.5ml菌體稀釋液置于滅菌的1.5ml離心管中，在室溫下離心，棄上清收集細(xì)菌，離心參數(shù)為5000 X 1min ； (4)向離心管中加入濃度10mmol/L的納米氧化鋁(顆粒直徑小于50nm)100 μ I與細(xì)菌細(xì)胞震蕩混勻，室溫下靜止作用一定時間； (5)將菌液過0.22 μ m微孔濾膜，濾除去納米氧化鋁顆粒； (6)滅菌生理鹽水沖洗微孔濾膜回收細(xì)胞，在室溫下離心菌液，棄上清去除殘留的納米氧化鋁，離心參數(shù)為5000 X 1min ； (7)用100μ I生理鹽水重懸菌體細(xì)胞備用； (8)加入10ng質(zhì)粒DNA,潤輪振蕩2min； (9)加Luria-Bertani培養(yǎng)基900μ I,在37°C、21rpm條件下振蕩復(fù)蘇Ih ； (10)菌液涂布在含有相應(yīng)抗生素的選擇性平板上，37°C培養(yǎng)，生長的菌落即為轉(zhuǎn)化成功的克隆。
【文檔編號】C12N15/74GK105886522SQ201410668128
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月20日
【發(fā)明人】邱志剛, 李君文, 丁誠實, 金敏, 諶志強, 楊棟, 王新為
【申請人】中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所