用于二惡英類物質(zhì)生物檢測的人源化重組載體和細胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組載體和重組細胞，具體涉及一種用于檢測芳香烴受體配體(例如二惡英類物質(zhì))的人源化重組載體以及重組細胞。本發(fā)明還涉及所述重組載體和細胞在芳香烴受體配體(例如二惡英類物質(zhì))生物檢測方面的用途。本發(fā)明將包含DRE序列的人類CYP1A1基因的啟動子或啟動子的部分區(qū)段克隆到帶有熒光素酶報告基因的基礎(chǔ)載體上，所獲得的重組載體和細胞對二惡英有良好的響應(yīng)，最低檢測限可達到0.3pM，特別適合用于評估芳香烴受體配體(例如二惡英類物質(zhì))對人體健康的影響及其相關(guān)機理研究。
【專利說明】
用于二惡英類物質(zhì)生物檢測的人源化重組載體和細胞
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種重組載體和重組細胞，具體涉及一種用于檢測芳香烴受體(AhR， 也叫二惡英受體)的配體(例如二惡英類物質(zhì)）的人源化重組載體以及包含該重組載體的重 組細胞。本發(fā)明還涉及所述重組載體和細胞用于檢測芳香烴受體的配體(例如二惡英類物 質(zhì)）的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 二惡英類污染物（Dioxins)包括多氯二苯并二惡英（PCDDs)、多氯二苯并呋喃 (PCDFs)和多氯聯(lián)苯(PCBs)等，是一類典型的持久性有機污染物，對人體具有廣泛的毒性效 應(yīng)。由于其具有環(huán)境持久性、可以遠距離迀移、難降解及生物累積性，將對人類健康構(gòu)成長 期的威脅。歷史上二惡英的人體暴露事件已屢見不鮮。例如1949年，美國孟山都化工廠的一 次混有二惡英類物質(zhì)的化學品泄露導致當?shù)鼐用窕忌下瑞畀彙⒏闻K疾病、癌癥等，并導致了 部分居民的死亡;2004年，烏克蘭總統(tǒng)尤先科在二惡英中毒后患上了嚴重的氯痤瘡等一系 列疾病。二惡英的人體暴露事件以及其帶來的嚴重健康危害引起了人們對二惡英健康效應(yīng) 的廣泛關(guān)注和深入研究。研究表明，二惡英類物質(zhì)能夠干擾神經(jīng)系統(tǒng)功能及發(fā)育、阻礙生 殖、引發(fā)肝臟毒性、促進腫瘤的生成、造成嚴重的皮膚病變等等。
[0003] 正是由于人們對二惡英類污染物的持續(xù)高度關(guān)注，目前對這類污染物的毒理機制 的研究是持久性有機污染物中最完善和最深入的。研究表明，二惡英受體(AhR，芳香烴受 體)介導的信號轉(zhuǎn)導機制是二惡英類污染物造成毒性效應(yīng)的主要分子機制。二惡英類污染 物在進入細胞后與胞質(zhì)內(nèi)的AhR結(jié)合，并活化AhR，隨后二惡英-AhR復合物轉(zhuǎn)移入核，在細胞 核中聚集并與AhR轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合形成異源二聚體，進而與基因上游的特異性增強子即二惡 英反應(yīng)原件(Dioxins responsive element,DRE)結(jié)合，激活效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，其中最經(jīng)典 的效應(yīng)基因包括CYP家族成員，如CYP1A1等。二惡英類物質(zhì)的生物檢測系統(tǒng)正是基于上述生 物過程而構(gòu)建的。其中基于報告基因的二惡英類生物檢測系統(tǒng)具有檢測周期短、成本低、高 靈敏度的特征，并在評價二惡英類污染物總體毒性方面有突出的優(yōu)勢，適用于二惡英類污 染物的健康風險評估。
[0004] 隨著對AhR信號通路的研究的深入，越來越多的證據(jù)表明該受體可能具有重要的 生物學功能，包括維持免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)的平衡，調(diào)節(jié)腸道固有免疫功能，參與心血管及神經(jīng)系 統(tǒng)發(fā)育等等。同時也提出一系列內(nèi)源性配體可以激活AhR并引發(fā)下游信號通路機制從而引 起一系列功能基因表達的改變，例如色氨酸的光解產(chǎn)物6-甲?；胚岵3，2-B]咔唑 (FICZ)，其激活AhR的能力與最強的二惡英類污染物2,3，7,8_四氯二苯并二惡英(T⑶D)相 當。另外，研究人員也發(fā)現(xiàn)一系列的藥物及中間體，天然產(chǎn)物及生物代謝物也可以作用于 AhR，激活或抑制其下游的信號通路及基因表達，從而引起一系列分子及細胞效應(yīng)。隨著前 述基于AhR的生物檢測系統(tǒng)的建立和完善，不斷有更多的作用于AhR的化合物被發(fā)現(xiàn)，這些 化合物可能成為一些藥物研發(fā)的備選化合物。
[0005] 目前已有的生物檢測系統(tǒng)大多基于小鼠 CYP1A1基因的增強子所構(gòu)建，雖然對二惡 英類污染物具有良好的響應(yīng)，但是并不能真實反映出二惡英類物質(zhì)對人體的影響。原因在 于AhR信號通路具有顯著的種屬差異性，例如一些多氯聯(lián)苯類物質(zhì)能夠與2,3,7,8_四氯二 苯并二惡英(TCDD)競爭結(jié)合小鼠 AhR，但不會競爭結(jié)合人類AhR，說明鼠源和人源的AhR與二 惡英類化合物的結(jié)合方式存在差異；另外也有證據(jù)表明鼠源和人源的AhR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 的序列不同。
[0006] 因此，無論是環(huán)境監(jiān)測、公共衛(wèi)生，還是活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及新藥研發(fā)都迫切需要人 源化的芳香烴受體配體(例如二惡英類物質(zhì)）的生物檢測系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的發(fā)明人通過反復實驗和大量創(chuàng)造性勞動，提供了基于人的CYP1A1基因啟 動子的生物檢測系統(tǒng)，其靈敏度高，對芳香烴受體的配體化合物(例如二惡英類化合物)有 良好的響應(yīng)，由此完成了本發(fā)明。
[0008] 本發(fā)明第一方面涉及重組載體，所述重組載體沿著其基因轉(zhuǎn)錄的方向可操作地連 接有來源于人的CYP1A1啟動子或該啟動子的部分區(qū)段，以及報告基因；
[0009] 所述人的CYP1A1啟動子或該啟動子的部分區(qū)段調(diào)節(jié)所述報告基因的轉(zhuǎn)錄。
[0010] 在本發(fā)明的一些實施方案中，其中所述人的CYP1A1啟動子的序列包含人的CYP1A1 基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游的-3534~-2448所示的序列或該序列的變體，例如包含SEQ ID N0: 3所示的序列。
[0011]在本發(fā)明中，所述-3534~-2448所示的序列的變體是指由于不同人群所產(chǎn)生的 CYP1A1啟動子的不同序列，其在序列長短和具體序列上可能有微小的差異，例如可以包括 個別堿基的插入、缺失或替換等，但只要其具有與本發(fā)明的人的CYP1A1啟動子相同的功能， 即包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0012] 在本發(fā)明的一些實施方案中，其中所述人的CYP1A1啟動子的部分區(qū)段包括該啟動 子的基本區(qū)段和兩個或多個(例如3、4、5、6、7、8個)相同或不同的二惡英反應(yīng)元件(01^)富 集區(qū)段，并且所述的兩個或多個DRE富集區(qū)段位于所述啟動子的基本區(qū)段的上游。
[0013] 在本發(fā)明的具體實施方案中，人的CYP1A1啟動子的基本區(qū)段和兩個相同的二惡英 反應(yīng)元件富集區(qū)段之間可操作地連接。
[0014] 在本發(fā)明中，所述啟動子的基本區(qū)段為能夠啟動下游基因轉(zhuǎn)錄表達的啟動子核心 區(qū)段。
[0015] 在本發(fā)明的一些實施方案中，其中所述的基本區(qū)段包含人的CYP1A1基因轉(zhuǎn)錄起始 位點上游的-2706~-2448所示的序列或該序列的變體，例如包含SEQ ID N0:10所示的序 列。
[0016] 在本發(fā)明中，所述-2706~-2448所示序列的變體是指由于不同人群所產(chǎn)生的 CYP1A1啟動子基本區(qū)段的不同序列，或者由于在區(qū)段的劃分標準上略有不同而產(chǎn)生的基本 區(qū)段的不同序列，該變體在序列長短和具體序列上可能有微小的差異，例如在該序列5'端 和3'端的選擇上可能略有不同，或者可以包括個別堿基的插入、缺失或替換等，但只要其具 有與本發(fā)明的人的CYP1A1啟動子基本區(qū)段相同的功能，即包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0017] 在本發(fā)明中，所述二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段是指含有兩個或兩個以上DRE且 DRE位置相對比較接近的序列區(qū)段。
[0018] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述二惡英反應(yīng)元件（DRE)富集區(qū)段含有人的 CYP1A1啟動子5'端的3個DRE序列。
[0019] 在本發(fā)明中，所述二惡英反應(yīng)元件(DRE)選自GCGTG和CACGC。
[0020] 在本發(fā)明的一些實施方案中，其中所述的二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段是指包 含人的CYP1A1啟動子5'端的3個DRE序列的相應(yīng)區(qū)段，例如包含人的CYP1A1基因轉(zhuǎn)錄起始位 點上游的-3534~-3217所示的序列或該序列的變體，例如包含SEQ ID N0:11所示的序列。
[0021] 在本發(fā)明中，所述-3534~-3217所示序列的變體是指由于不同人群所產(chǎn)生的含有 三個DRE的富集區(qū)段的不同序列，或者由于在區(qū)段的劃分標準上略有不同而產(chǎn)生的富集區(qū) 段的不同序列，該變體在序列長短和具體序列上可能有微小的差異，例如在該序列5'端和 3'端的選擇上可能略有不同，或者可以包括個別堿基的插入、缺失或替換等，但只要其具有 與本發(fā)明的DRE富集區(qū)段相同的功能，即包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0022] 在本發(fā)明中，所述人的CYP1A1啟動子的基本區(qū)段和兩個或多個二惡英反應(yīng)元件富 集區(qū)段之間的連接方式、或兩個或多個二惡英反應(yīng)元件富集區(qū)段之間的連接方式為本領(lǐng)域 所公知，例如為可操作地連接，例如可以通過linker或酶切位點序列等多種方式可操作地 連接。在本發(fā)明的一些實施方案中，其中所述的兩個或多個二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段 之間、或啟動子的基本區(qū)段與兩個或多個二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段之間通過酶切位 點序列連接。
[0023] 在本發(fā)明的具體實施方案中，人的CYP1A1啟動子的基本區(qū)段和兩個二惡英反應(yīng)元 件富集區(qū)段之間連接后的序列如SEQ ID N0:12所示。
[0024] 在本發(fā)明的一些實施方案中，其中所述的報告基因可以選自熒光素酶(例如為螢 火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶)基因、熒光蛋白（例如綠色、黃色、青色、紅色熒光蛋白）基因 或其它報告基因。
[0025] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述重組載體的基礎(chǔ)載體可以選自適用于真核細胞 表達的含有報告基因的載體，例如pGL、pECFP、pEmcherry、pEGFP、pEmvenus、pEYFP等系列載 體。
[0026] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述重組載體的基礎(chǔ)載體為pGL系列載體。所述重組 載體是在PGL系列載體的螢火蟲熒光素酶基因的上游可操作地連接有所述人的CYP1A1啟動 子或該啟動子的部分區(qū)段。
[0027] 在本發(fā)明的具體實施方案中，其是在基礎(chǔ)載體的多克隆位點處連接有所述人的 CYP1A1啟動子或該啟動子的部分區(qū)段。
[0028]在本發(fā)明的一些實施方案中，其中所述的pGL系列載體選自pGL2、pGL3、pGL4和 pGL6〇
[0029] 在本發(fā)明的具體實施方案中，其中所述的pGL系列載體為pGL3系列載體，例如為 pGL3_bas i c 載體。
[0030] 在本發(fā)明的一些實施方案中，其為重組載體pCL-HFL或PCL-HCR2。
[0031] 本發(fā)明第二方面涉及重組細胞，其含有本發(fā)明第一方面任一項的重組載體。
[0032] 在本發(fā)明的一些實施方案中，其中所述細胞為含有芳香烴受體的來源于人的細胞 (例如為來源于人的腫瘤細胞），例如為來源于人的肝源、肺源、腎源、神經(jīng)源或上皮源細胞 等。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述細胞為來源于人的肝癌細胞，例如為ifep G2細胞。
[0033] 本發(fā)明第三方面涉及檢測試劑或試劑盒，其含有本發(fā)明第一方面任一項的重組載 體或第二方面任一項的重組細胞。
[0034] 在本發(fā)明的一些實施方案中，所述檢測試劑或試劑盒用于檢測芳香烴受體的配 體，或者在體外或體內(nèi)用于評估芳香烴受體的配體對人體(包括人的細胞、組織或器官）的 影響，或者在體外或體內(nèi)用于研究芳香烴受體的配體與人體(包括人的細胞、組織或器官） 相互作用的機理。
[0035] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明第一方面任一項的重組載體或第二方面任一項的重組細胞 或第三方面的檢測試劑或試劑盒用于檢測芳香烴受體的配體的用途，或者在體外或體內(nèi)用 于評估芳香烴受體的配體對人體(包括人的細胞、組織或器官）的影響的用途，或者在體外 或體內(nèi)用于研究芳香烴受體的配體與人體(包括人的細胞、組織或器官)相互作用的機理的 用途，或者在制備試劑中的用途，所述試劑用于在體外或體內(nèi)評估芳香烴受體的配體對人 體(包括人的細胞、組織或器官）的影響或者研究芳香烴受體的配體與人體(包括人的細胞、 組織或器官)相互作用的機理。
[0036] 本發(fā)明還涉及一種檢測芳香烴受體的配體、或者在體外或體內(nèi)評估芳香烴受體的 配體對人體(包括人的細胞、組織或器官）的影響或研究芳香烴受體的配體與人體(包括人 的細胞、組織或器官)相互作用的機理的方法，所述方法包括使用本發(fā)明第一方面任一項的 重組載體或第二方面任一項的重組細胞或第三方面的檢測試劑或試劑盒的步驟。
[0037] 在本發(fā)明中，其中所述的芳香烴受體的配體是指能夠與芳香烴受體結(jié)合進而活化 或抑制芳香烴受體的物質(zhì)，例如選自二惡英類化合物以及其它能夠與芳香烴受體結(jié)合的化 合物或其混合物。優(yōu)選地，其中所述的二惡英類化合物選自多氯二苯并二惡英(PCDDs)(例 如2,3,7,8_四氯二苯并二惡英）、多氯二苯并呋喃(PCDFs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、鹵代芳香烴 (HAHs)、多環(huán)芳香烴(PAHs)、氯代二苯醚和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代(PBDD/ Fs和PBBs)及其它混合鹵代化合物中的一種或兩種以上。優(yōu)選地，其中所述其它能夠與芳香 烴受體結(jié)合的化合物例如選自合成藥物及其中間體、植源性藥物、其他天然來源的活性單 體化合物、生物代謝物等，包括吲哚類化合物、黃酮類化合物、咪唑類、嘧啶類化合物、生物 堿等，例如奧美拉唑（0ΜΕ)、2-巰基-5-甲氧基苯并咪唑（0ΜΕ合成中間體）、伯氨喹、人參皂 苷、金絲桃苷、黃芩素、桑辛素、芒柄花素，次野鳶尾黃素、異鼠李素、靛藍、靛玉紅、大黃素、 吳茱萸次堿、煙堿、6-甲酰吲哚[3，2-b]咔唑(FICZ)、犬尿喹啉酸等。
[0038] 在本發(fā)明中，所述人的CYP1A1啟動子是指該基因的完整啟動子，其包含該啟動子 的基本區(qū)段和能夠進一步調(diào)芐基因轉(zhuǎn)錄的區(qū)段，例如增強子序列等。所述基本區(qū)段可以實 現(xiàn)啟動子的基本功能，例如包含TATA框、GC框和CAAT盒等。在本發(fā)明的實施方案中，所述人 的CYP1A1啟動子是指人類CYP1A1基因5'端位置由-3534bp到-2448bp的序列，其包含該啟動 子的基本區(qū)段和含有6個DRE序列的區(qū)段。
[0039] 在本發(fā)明中，有關(guān)人的CYP1A1啟動子的位點計算方法為本領(lǐng)域公知，例如是以其 轉(zhuǎn)錄起始位點ATG中的A為1，A上游的一個堿基為-1，以此類推。
[0040] 發(fā)明的有益效果
[00411本發(fā)明將包含DRE序列的人類CYP1A1基因的啟動子或啟動子的部分區(qū)段克隆到帶 有熒光素酶報告基因的基礎(chǔ)載體上，得到重組二惡英報告基因載體以及含有該載體的細 胞。所獲得的重組載體和細胞對二惡英有良好的響應(yīng)，最低檢測限可達到0.3pM，特別適合 用于評估芳香烴受體的配體(例如二惡英類物質(zhì))對人體生理功能及健康的影響及其相關(guān) 機理研究。
【附圖說明】
[0042] 圖1為pCL-HFL載體構(gòu)建示意圖；
[0043] 圖2為pCL-HCR2載體構(gòu)建示意圖；
[0044] 圖3為pCL-HFL瞬轉(zhuǎn)Hep G2后TCDD刺激不同時間的比較；
[0045] 圖4為pCL-HCR2瞬轉(zhuǎn)Hep G2后T⑶D刺激不同時間的比較；
[0046]圖5為pCL-HFL瞬轉(zhuǎn)Hep G2后對梯度濃度的T⑶D的反應(yīng)情況；
[0047]圖6為pCL-HCR2瞬轉(zhuǎn)Hep G2后對梯度濃度的T⑶D的反應(yīng)情況；
[0048]圖7為pCL-HFL與pCL-HCR2載體在低濃度TCDD刺激下的反應(yīng)情況。
【具體實施方式】
[0049]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0050] pGL3_basic vector購自Promega.
[0051] 基因組抽提試劑盒購自康為世紀(北京）.
[0052] pRL_SV40,購自 Promega.
[0053] ltx 試劑盒（Lipofectamine? ltx&pIus Reagent)貝勾自 Invitrogen.
[0054] 雙報告檢測試劑盒（Dual-L:uciferas.e? Reporter Assay System)購自 Promega ·貨號E1910 ·
[0055] Hep G2細胞，Michael S.Denison贈。
[0056] 酶標儀:GloMax Mluti+(Promega，USA)
[0057] 實施例1載體的構(gòu)建
[0058] (l)pCL-HFL 載體的構(gòu)建
[0059] 人類基因組DNA來自于Hep G2細胞，按照試劑盒標準方法抽提。并通過標準的分子 克隆手段分別構(gòu)建獲得pCL-HFL(圖1)。
[0060] 本實驗的目的是構(gòu)建包括人類CYP1A1啟動子(-3534~-2448)原始序列的二惡英 報告基因檢測載體，該序列包含6個DRE序列。以人類基因組DNA為模板，用以下引物進行PCR 反應(yīng)。
[0061 ] 5 ' 引物為：CGGGGTACCGAGGCTGGCCCTTTAAGAGC(SEQ ID NO: 1)
[0062] 3'引物為：CCCAAGCTTACTGCCACCTTTATAGGCGG(SEQ ID NO:2)
[0063] 獲得PCR片段后，以Κρη I和Hind ΙΠ 雙酶切，并對載體pGL3-basic進行同樣的雙酶 切，最后將該片段構(gòu)建入pGL3-basic中。最后經(jīng)酶切測序鑒定后，獲得pCL-HFL載體。
[0064]其中人類CYP1A1啟動子（-3534~-2448)的序列為（其中帶下劃線部分為DRE序 列）：
[0066] (2)pCL_HCR2 載體的構(gòu)建
[0067] 本載體的構(gòu)建分為三步，即分別獲得CYP1A1啟動子的基本區(qū)段和兩個相同的富含 DRE區(qū)段，最后把該三段構(gòu)建在一起(見圖2)。第一段為CYP1A1啟動子的基本部分，包括(-2706~-2448)區(qū)段，共259bp。人類基因組DNA來自于Hep G2細胞，按照試劑盒標準方法抽 提。以人類基因組DNA為模板，用如下引物進行PCR:
[0068] 5'引物為：GGA AGATCTGGTTCTGCACTGCCCTTG(SEQ ID N0:4)
[0069] 3'引物為：CCCAAGCTTACTGCCACCTTTATAGG(SEQ ID NO:5)
[0070] 獲得PCR片段后，以Hind ΙΠ 和Bglll雙酶切，并對載體pGL3-Basic進行同樣的雙酶 切，最后將該片段構(gòu)建入pGL3-Basic中。
[0071] 克隆兩個相同的CYP1A1啟動子的DRE富集區(qū)段（-3534~-3217)。該區(qū)段包含3個 DRE序列，長度為318bp。同樣以人類基因組DNA為模板，用如下引物進行PCR:
[0072]第一對該DRE富集區(qū)域的引物為：
[0073] 5'引物為：CGGGGTACCGAGGCTGGCCCTTTAAGA(SEQ ID N0:6)
[0074] 3 ' 引物為：CGACGCGTTGGCAGAGCACAGAAATC(SEQ ID NO: 7)
[0075] 第二對該DRE富集區(qū)域的引物為：
[0076] 5'引物為：CGACGCGTGAGGCTGGCCCTTTAAGA(SEQ ID N0:8)
[0077] 3'引物為：CCCCCCGGGTGGCAGAGCACAGAAATC(SEQ ID N0:9)
[0078] 獲得PCR片段后分別以Κρη I和Mlu I、Mlu I和Xmal雙酶切并分別構(gòu)建入前述包含 CYP1A1基本啟動子的報告基因載體中，經(jīng)鑒定確認后，獲得pCL-HCR2。
[0079]所插入的基本啟動子(-2706~-2448)序列是：
[0080]

[0081 ] 其中插入片段在上述序列的5'端及3'端分別還包含Bglll(AGATCT)和Hind m (AAGCTT)限制性內(nèi)切酶序列。
[0082]所插入的DRE富集區(qū)段(-3534~-3217)序列是(其中帶下劃線部分為DRE序列）：
[0084] 插入片段在上述序列的5'端及3'端分別還包含Kpn I(GGTACC)和Mlu I(ACGCGT)、 Mlu I(ACGCGT)及Xmal(CCCGGG)限制性內(nèi)切酶序列。將三個片段均插入pGL3-Basic載體后 獲得PCL-HCR2載體。
[0085]插入上述三個片段后，包含酶切位點的整個序列為（其中帶下劃線部分為DRE序 列）：
[0087]實施例2載體瞬轉(zhuǎn)Hep G2細胞獲得最佳暴露時間
[0088]將Hep G2細胞以1 X 105/孔的數(shù)量接種到24孔板中，同時用脂質(zhì)體(LTX)瞬轉(zhuǎn)載 體。即0.5yg載體(pCL-HFL或pCL-HCR2載體）另加1/50量的pRL-SV40(對照報告基因載體，表 達海腎熒光素酶)共轉(zhuǎn)細胞22-24小時。以T⑶D終濃度為10nM的α-ΜΕΜ培養(yǎng)基(DMS0含量1%) 培養(yǎng)該細胞4h、12h、24h、48h，而以終濃度1 % DMS0的培養(yǎng)基(不含TCDD)在相同條件下處理 的細胞作為陰性對照。到預定時間后，棄去原培養(yǎng)基，用500ml PBS清洗后加入200μ1細胞裂 解液，400r/min震蕩15分鐘。然后分別吸取50μ1細胞裂解液到96孔白色不透明酶標板中，每 個樣品重復3次。按照說明書配好雙報告檢測所用底物，然后用帶有自動加樣栗的酶標儀分 別檢測TCDD誘導的螢火蟲熒光素酶的反應(yīng)值和陰性對照的反應(yīng)值。最后以pRL-SV40的反應(yīng) 值作為系統(tǒng)對照，獲得不同誘導時間下，TCDD誘導的螢火蟲熒光素酶的反應(yīng)值相對于其溶 劑DMSO誘導的螢火蟲熒光素酶的反應(yīng)值的倍數(shù)情況。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算得出的時間效應(yīng)圖 如圖3和圖4。其中"倍數(shù)"的計算方法為：（待測載體的反應(yīng)值/該孔pRL-SV40的反應(yīng)值)/(陰 性對照的反應(yīng)值/該孔PRL-SV40的反應(yīng)值），以下各圖的計算方法與此相同。
[0089] 由圖可見，在所選時間范圍內(nèi)，載體的響應(yīng)倍數(shù)隨著時間的增加而增大，但是為了 未來檢測方便，選取24小時為最佳暴露時間；并且從圖中可以看出，pCL-HCR2的響應(yīng)倍數(shù)大 于pCL-HFL，前者大約是后者的兩倍以上。而響應(yīng)倍數(shù)一般作為載體篩選的一個重要指標， 響應(yīng)倍數(shù)越高，不同濃度二惡英樣品表現(xiàn)出的區(qū)別越明顯，因此更有利于提高樣品檢測的 靈敏度和準確性，同時可降低對檢測器的要求從而降低檢測成本。
[0090] 實施例3載體瞬轉(zhuǎn)Hep G2細胞獲得濃度效應(yīng)曲線
[0091]將Hep G2細胞以1 X 105/孔的數(shù)量接種到24孔板中，同時用脂質(zhì)體(LTX)瞬轉(zhuǎn)載 體。即0 · 5yg載體(pCL-HFL、pCL-HCR2或pGL6 · 1載體)另加1/50量的pRL-SV40(對照報告基因 載體，表達海腎熒光素酶)共轉(zhuǎn)細胞22-24小時。吸取舊培養(yǎng)基，以TCDD終濃度為1.0 Χ10-13 ~1.0 X 10-8M TCDD的α-ΜΕΜ培養(yǎng)基(DMS0含量1 % )培養(yǎng)該細胞24h，而以終濃度1 %DMS0的培 養(yǎng)基（不含TCDD)在相同條件下處理的細胞作為陰性對照。24h后，棄去原培養(yǎng)基，用500ml PBS清洗后加入200μ1細胞裂解液，400r/min震蕩15分鐘。然后分別吸取50μ1細胞裂解液到 96孔白色不透明酶標板中，每個樣品重復3次。按照說明書配好雙報告檢測所用底物，然后 用帶有自動加樣栗的酶標儀分別檢測TCDD誘導的螢火蟲熒光素酶的反應(yīng)值和陰性對照的 反應(yīng)值。最后以PRL-SV40的反應(yīng)值作為系統(tǒng)對照，獲得不同濃度TCDD誘導的螢火蟲熒光素 酶的反應(yīng)值相對于其溶劑DMS0誘導的螢火蟲熒光素酶的反應(yīng)值的倍數(shù)情況。根據(jù)實驗數(shù)據(jù) 計算得出的時間效應(yīng)圖如圖5、圖6、圖7。
[0092] 由圖可見，在T⑶D暴露濃度為0.3pM時，pCL-HFL、pCL-HCR2對T⑶D的響應(yīng)相對于其 對照DMS0開始顯示出明顯的差異(p〈0.05)，即兩種載體的最低檢測限為0.3pM。因此，在靈 敏度上，我們構(gòu)建的質(zhì)粒非常有利于痕量二惡英類物質(zhì)的分析。同時為降低對酶標儀檢測 參數(shù)的要求，進而降低檢測成本，實現(xiàn)檢測方法的大范圍推廣提供了更加有利的條件。 [0093]盡管本發(fā)明的【具體實施方式】已經(jīng)得到詳細的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根 據(jù)已經(jīng)公開的所有教導，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保 護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
【主權(quán)項】
1. 重組載體，所述重組載體沿著其基因轉(zhuǎn)錄的方向可操作地連接有來源于人的CYPlAl 啟動子或該啟動子的部分區(qū)段，以及報告基因； 所述人的CYPlAl啟動子或該啟動子的部分區(qū)段調(diào)節(jié)所述報告基因的轉(zhuǎn)錄。2. 權(quán)利要求1的重組載體，其中所述人的CYP IAl啟動子的序列包含人的CYPIA1基因轉(zhuǎn) 錄起始位點上游的-3534~-2448所示的序列或該序列的變體，例如包含SEQ ID NO:3所示 的序列。3. 權(quán)利要求1的重組載體，其中所述人的CYPlAl啟動子的部分區(qū)段包括該啟動子的基 本區(qū)段和兩個或多個相同或不同的二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段，并且所述的兩個或多 個二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段位于所述啟動子的基本區(qū)段的上游。4. 權(quán)利要求3的重組載體，其中所述的基本區(qū)段包含人的CYPlAl基因轉(zhuǎn)錄起始位點上 游的-2706~-2448所示的序列或該序列的變體，例如包含SEQ ID NO: 10所示的序列。5. 權(quán)利要求3的重組載體，其中所述的二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段是指包含人的 CYPlAl啟動子5'端的3個DRE序列的相應(yīng)區(qū)段，例如包含人的CYPlAl基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游 的-3534~-3217所示的序列或該序列的變體，例如包含SEQ ID NO: 11所示的序列。6. 權(quán)利要求1的重組載體，其中所述的報告基因選自熒光素酶（例如為螢火蟲熒光素 酶、海腎熒光素酶)基因、熒光蛋白（例如綠色、黃色、青色、紅色熒光蛋白）基因或其它報告 基因。7. 權(quán)利要求1-6任一項的重組載體，所述重組載體的基礎(chǔ)載體選自適用于真核細胞表 達的含有報告基因的載體，例如pGL、pECFP、pEmcherry、pEGFP、pEmvenus、pEYFP等系列載 體，優(yōu)選地，其中所述的PGL系列載體選自pGL2、pGL3、pGL4和pGL6。8. 權(quán)利要求7的重組載體，其為重組載體pCL-HFL或pCL-HCR2。9. 重組細胞，其含有權(quán)利要求1-8任一項的重組載體。10. 權(quán)利要求9的重組細胞，其中所述細胞為來源于人的細胞，例如為來源于人的肝源、 肺源、腎源、神經(jīng)源或上皮源細胞，例如為人的肝癌細胞，例如為H印G2細胞。11. 檢測試劑或試劑盒，其含有權(quán)利要求1-8任一項的重組載體或權(quán)利要求9或10的重 組細胞。12. 權(quán)利要求1-8任一項的重組載體或權(quán)利要求9或10的重組細胞或權(quán)利要求11的檢測 試劑或試劑盒用于檢測芳香烴受體的配體的用途，或者在體外或體內(nèi)用于評估芳香烴受體 的配體對人體(包括人的細胞、組織或器官）的影響的用途，或者在體外或體內(nèi)用于研究芳 香烴受體的配體與人體(包括人的細胞、組織或器官）相互作用的機理的用途，或者在制備 試劑中的用途，所述試劑用于在體外或體內(nèi)評估芳香烴受體的配體對人體(包括人的細胞、 組織或器官）的影響或者研究芳香烴受體的配體與人體(包括人的細胞、組織或器官）相互 作用的機理。13. -種檢測芳香烴受體的配體、或者在體外或體內(nèi)評估芳香烴受體的配體對人體(包 括人的細胞、組織或器官）的影響或研究芳香烴受體的配體與人體(包括人的細胞、組織或 器官)相互作用的機理的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1-8任一項的重組載體或權(quán)利要 求9或10的重組細胞或權(quán)利要求11的檢測試劑或試劑盒的步驟。14. 權(quán)利要求12的用途或者權(quán)利要求13的方法，其中所述的芳香烴受體的配體選自二 惡英類化合物以及其它能夠與芳香烴受體結(jié)合的化合物或其混合物;優(yōu)選地，其中所述的 二惡英類化合物選自多氯二苯并二惡英(P⑶Ds)(例如2，3,7，8_四氯二苯并二惡英）、多氯 二苯并呋喃(PCDFs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、鹵代芳香烴(HAHs)、多環(huán)芳香烴(PAHs)、氯代二苯醚 和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代(PBDD/Fs和I 3BBs)及其它混合鹵代化合物中的 一種或兩種以上;優(yōu)選地，其中所述其它能夠與芳香烴受體結(jié)合的化合物選自合成藥物及 其中間體，植源性藥物，其他天然來源的活性單體化合物，生物代謝物等，包括吲哚類化合 物、黃酮類化合物、咪唑類、啼啶類化合物、生物堿等，例如奧美拉唑(OME )、2-巰基-5-甲氧 基苯并咪挫(0ΜΕ合成中間體）、伯氨喹、人參皂苷、金絲桃苷、黃芩素、桑辛素、芒柄花素，次 野鳶尾黃素、異鼠李素、靛藍、靛玉紅、大黃素、吳茱萸次堿、煙堿、6-甲酰吲哚[3,2-b]咔唑 (FICZ)、犬尿喹啉酸等。
【文檔編號】C12N5/10GK105886532SQ201610286018
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】趙斌, 尹雪嬌, 李帥章, 謝群慧
【申請人】中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心