一種微生物生產(chǎn)羥基巰基苯酸的方法
【專利摘要】一種微生物生產(chǎn)羥基巰基苯酸的方法，具體是一種近平滑假絲酵母生物催化制備醫(yī)藥中間體2?羥基?5?巰基?苯酸的方法，微生物發(fā)酵液中加入底物，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，產(chǎn)品收率高，反應(yīng)條件溫和，常溫、常壓操作，解決了現(xiàn)有方法生產(chǎn)條件苛刻的困難。
【專利說(shuō)明】
一種微生物生產(chǎn)羥基巰基苯酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到近平滑假絲酵母生物催化制備醫(yī)藥中 間體2-羥基-5-巰基-苯酸的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物催化具有催化效率高、選擇性強(qiáng)、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點(diǎn)，是可持續(xù) 發(fā)展過(guò)程中替代和拓展傳統(tǒng)有機(jī)化學(xué)合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸 引力的應(yīng)用領(lǐng)域之一，在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。
[0003] 芳烴的羧化反應(yīng)是一類重要的反應(yīng)，其產(chǎn)物為芳烴羥基羧酸，是重要的藥物合成 起始原料。但是，現(xiàn)在的生產(chǎn)采用傳統(tǒng)的化學(xué)合成，用芳烴與C0 2反應(yīng)，反應(yīng)壓力高達(dá)lOMPa， 溫度高達(dá)140-380°C，反應(yīng)選擇性差，副產(chǎn)物多。采用微生物催化，則可能改變這種狀況。采 用微生物催化，可以在常溫、常壓下反應(yīng)生產(chǎn)芳烴羥基羧酸，條件溫和，選擇性高，副反應(yīng) 少，產(chǎn)率高。
[0004] 本發(fā)明將采用微生物催化反應(yīng)，生產(chǎn)芳烴羥基羧酸:2_羥基-5-巰基-苯酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明采用近平滑假絲酵母催化制備2-羥基-5-巰基-苯酸，反應(yīng)式如下：
底物對(duì)-酚基磺酸（1)經(jīng)近平滑假絲酵母催化反應(yīng)，得到產(chǎn)物2-羥基-5-巰基-苯酸(2 )。 有多種微生物可以催化此反應(yīng)，經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選，最終確定采用近平滑假絲酵母作為催 化劑，因?yàn)槠浯呋磻?yīng)的效果最好，副產(chǎn)物極少，反應(yīng)收率高。
[0006] 許多假絲酵母都可以進(jìn)行生物催化此反應(yīng)，然而，其效果不同，相差很大，經(jīng)實(shí)驗(yàn)， 本發(fā)明選用近平滑假絲酵母菌株為DSM-70125，其催化反應(yīng)效果最佳。
[0007] 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。盡管表面活性 劑增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，屬于液-液2相反應(yīng)，底物、產(chǎn)物的相間傳質(zhì) 為反應(yīng)的限制環(huán)節(jié)，所以，還需采取措施，以提高反應(yīng)速度。增加非均相反應(yīng)的反應(yīng)界面，是 提高非均相反應(yīng)的有效措施之一。加入表面活性劑后，在強(qiáng)烈攪拌下，反應(yīng)液成為乳液，使 得催化反應(yīng)界面大幅度增加，從而大幅度提高反應(yīng)速度。特別是，加入的表面活性劑，必須 生物相容，不抑制微生物的催化活性，所以，表面活性劑種類和濃度的選擇，是非常重要的。 大量實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于本反應(yīng)，加入平平加〇(PerogolO, 15個(gè)單位的氧乙稀與油醇的縮合物） 19-20g/L是最佳的。
[0008] 反應(yīng)結(jié)束后，用有機(jī)溶劑萃取產(chǎn)物。需要破乳，有多種方法可以破乳，包括鹽析法： 加入氯化鈉、硫酸銨或氯化鈣、氯化鎂、硫酸鈣、硫酸鎂;凝聚法:加入聚合氯化鋁、明礬等； 或者將上述2類混合加入;加熱等。不同產(chǎn)物，所用的方法不同，實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于本反應(yīng)，加入 1.6%的氯化鈣+0.05%聚合氯化鋁是最佳的。
[0009] 羧化反應(yīng)中，采用NaHC〇3提供C02,實(shí)際上，有多種物質(zhì)可以提供C02,但是，通過(guò)大 量實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，對(duì)于本發(fā)明，使用NaHC0 3是最佳的。由于加入NaHC03會(huì)使反應(yīng)液的pH升 高，而適宜的PH，對(duì)微生物催化反應(yīng)致關(guān)重要，所以，不能一次加入，必須采用流加方式加入 NaHC03。然而，即使流加 NaHC03，反應(yīng)液的pH仍然升高，所以，還必須采取措施，維持反應(yīng)液處 于適宜的PH，使微生物能夠正常發(fā)揮生物催化作用。通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)表明，流加鹽酸水溶液是 適宜的方法，調(diào)節(jié)NaHC0 3與鹽酸水溶液的流加速率，可以使溶液的pH處于最佳范圍，使生物 催化反應(yīng)正常進(jìn)行。
[0010] 可以明顯看出，本發(fā)明所涉及的微生物菌株選擇、表面活性劑選擇、破乳劑選擇、 C02供體選擇，還有反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)pH，底物濃度，生物催化反應(yīng)液成分確定等，眾 多因素均需考慮，并且，它們相互影響。特別是，需要從實(shí)驗(yàn)室小試、中試，直到工業(yè)規(guī)模反 應(yīng)，更是大幅度增加了工作難度、工作量。所以，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)至管重要，如此多的因素，生物催 化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論分析和實(shí)驗(yàn)工作量巨大。
[0011] 培養(yǎng)介質(zhì)： 1、種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH6.2;配 制固體培養(yǎng)基時(shí)添加15g/L的瓊脂粉。
[0012] 2、培養(yǎng)液成份:葡萄糖32-36 g/L，木糖7-8g/L，玉米胚芽粉13-15 g/L，酵母提 取物 6-8 g/L，（NH4 ) 2HP〇4 12-15 g/L，KH2P0 4 6.5-7.5 g/L. MgS〇4 ·7Η20 0.7-0.8 g/L， NaCl 0·卜0.12 g/L; ρΗ6·4。
[0013] 2、固體培養(yǎng)基成份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0014]微生物發(fā)酵液制備。近平滑假絲酵母DSM-70125經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種 子液;發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，裝料系數(shù)為0.6-0.7，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至32-33°C，將 近平滑假絲酵母種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為7.3-7.9%，通氣比為1.2 -1.4V/V·分 鐘，32-33°C培養(yǎng)40-44小時(shí)，發(fā)酵液中濕酵母細(xì)胞濃度為92-96g/L，此發(fā)酵液用作生物催化 反應(yīng)催化劑。
[0015] 用HPLC測(cè)產(chǎn)品收率及純度，C18柱，紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)254nm，流動(dòng)相為pH3的磷酸緩 沖液：甲醇=90:10。
[0016] 生物催化反應(yīng):發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物對(duì)-酚基磺酸，使?jié)舛葹?2-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹椋浩狡郊? 19-20g/L，葡萄糖18-22g/L，木糖45-50g/L、蔗糖25-28g/L、綠豆粉18-22 g/L;調(diào)節(jié)pH為6 · 1-6 · 4，攪拌使反應(yīng)液 乳化，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)溫度35°C，反應(yīng)時(shí)間為36-40小時(shí);反應(yīng)開(kāi)始時(shí)， 立即流加濃度為5 %的NaHC03水溶液，同時(shí)流加濃度為1 %的鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)NaHC03與鹽酸 水溶液的流加速率，維持PH6.1-6.4，所加入的物料均經(jīng)過(guò)滅菌處理;通氣比為0.6-0.65V/ V ·分鐘，即每分鐘通氣量為〇. 6-0.65倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后，破乳，用0.2倍反應(yīng)液體積 乙酸乙酯萃取反應(yīng)液萃取3次，合并有機(jī)相，有機(jī)相蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物2-羥基-5-巰 基-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率97.5-99.3 %，產(chǎn)品收率95.5-97.2 %。
[0017] 實(shí)施例1 培養(yǎng)液成份:葡萄糖32-36 g/L，木糖7-8g/L，玉米胚芽粉13-15 g/L，酵母提取物6-8 g/L, (NH4 ) 2HPO4 12-15 g/L, KH2PO 4 6.5-7.5 g/L. MgS04 . 7H20 0.7-0.8 g/L, NaCl 0.1-0.12 g/L; pH6.4。
[0018] 微生物發(fā)酵液制備。近平滑假絲酵母DSM-70125經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種 子液;發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，裝料系數(shù)為0.6-0.7，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至32-33°C，將 近平滑假絲酵母種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為7.3-7.9%，通氣比為1.2 -1.4V/V·分 鐘，32-33°C培養(yǎng)40-44小時(shí)，發(fā)酵液中濕酵母細(xì)胞濃度為92-96g/L，此發(fā)酵液用作生物催化 反應(yīng)催化劑。
[0019] 生物催化反應(yīng)：15L發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物 對(duì)-酚基磺酸，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹?平平加 0 19-20g/L，葡萄糖 18-22g/L，木糖45-50g/L、蔗糖25-28g/L、綠豆粉 18-22 g/L;調(diào)節(jié)pH為6 · 1-6 · 4，攪拌使反應(yīng) 液乳化，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)溫度35 °C，反應(yīng)時(shí)間為36-40小時(shí)；反應(yīng)開(kāi)始 時(shí)，立即流加濃度為5 %的NaHC03水溶液，同時(shí)流加濃度為1 %的鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)NaHC03與 鹽酸水溶液的流加速率，維持PH6.1-6.4，所加入的物料均經(jīng)過(guò)滅菌處理；通氣比為0.6-0.65V/V ·分鐘，即每分鐘通氣量為0.6-0.65倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后，破乳，用0.2倍反應(yīng) 液體積乙酸乙酯萃取反應(yīng)液萃取3次，合并有機(jī)相，有機(jī)相蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物2-羥基-5-巰基-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率97.5-99.3 %，產(chǎn)品收率95.5-97.2 %。
[0020] 實(shí)施例2 培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實(shí)施例1。
[0021 ]生物催化反應(yīng):150L發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物 對(duì)-酚基磺酸，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹?平平加0 19-20g/L，葡萄糖18-22g/L，木糖45-50g/L、蔗糖25-28g/L、綠豆粉18-22 g/L;調(diào)節(jié)pH為6 · 1-6 · 4，攪拌使反應(yīng)液 乳化，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)溫度35°C，反應(yīng)時(shí)間為36-40小時(shí);反應(yīng)開(kāi)始時(shí)， 立即流加濃度為5 %的NaHC03水溶液，同時(shí)流加濃度為1 %的鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)NaHC03與鹽酸 水溶液的流加速率，維持PH6.1-6.4，所加入的物料均經(jīng)過(guò)滅菌處理;通氣比為0.6-0.65V/ V·分鐘，即每分鐘通氣量為〇. 6-0.65倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后，破乳，分別用0.2倍、0.15 倍、0.1倍反應(yīng)液體積的乙酸乙酯萃取反應(yīng)液各萃取1次，合并有機(jī)相，蒸出乙酸乙酯，得到 產(chǎn)物2-羥基-5-巰基-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率97.5 %，產(chǎn)品收率95.5 %。
[0022] 實(shí)施例3 培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實(shí)施例1。
[0023]生物催化反應(yīng)：1000L發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底 物對(duì)-酚基磺酸，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹?平平加0 19-20g/L，葡萄糖 18-22g/L，木糖45-50g/L、蔗糖25-28g/L、綠豆粉 18-22 g/L;調(diào)節(jié)pH為6 · 1-6 · 4，攪拌使反應(yīng) 液乳化，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)溫度35 °C，反應(yīng)時(shí)間為36-40小時(shí)；反應(yīng)開(kāi)始 時(shí)，立即流加濃度為5 %的NaHC03水溶液，同時(shí)流加濃度為1 %的鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)NaHC03與 鹽酸水溶液的流加速率，維持PH6.1-6.4，所加入的物料均經(jīng)過(guò)滅菌處理；通氣比為0.6-0.65V/V ·分鐘，即每分鐘通氣量為0.6-0.65倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后，破乳，分別用0.2 倍、Ο . 15倍、0.1倍反應(yīng)液體積的乙酸乙酯萃取反應(yīng)液各萃取1次，合并有機(jī)相，蒸出乙酸乙 酯，得到產(chǎn)物2-羥基-5-巰基-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率98.5 %，產(chǎn)品收率96.5 %。
[0024] 實(shí)施例4 培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實(shí)施例1。
[0025]生物催化反應(yīng):15000L發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底 物對(duì)-酚基磺酸，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹?平平加 0 19-20g/L，葡萄糖 18-22g/L，木糖45-50g/L、蔗糖25-28g/L、綠豆粉 18-22 g/L;調(diào)節(jié)pH為6 · 1-6 · 4，攪拌使反應(yīng) 液乳化，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)溫度35 °C，反應(yīng)時(shí)間為36-40小時(shí)；反應(yīng)開(kāi)始 時(shí)，立即流加濃度為5 %的NaHC03水溶液，同時(shí)流加濃度為1 %的鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)NaHC03與 鹽酸水溶液的流加速率，維持PH6.1-6.4，所加入的物料均經(jīng)過(guò)滅菌處理；通氣比為0.6-0.65V/V ·分鐘，即每分鐘通氣量為0.6-0.65倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后，破乳，用逆流萃取 機(jī)萃取，萃取液為乙酸乙酯，蒸出有機(jī)相的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物2-羥基-5-巰 基-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率99.3 %，產(chǎn)品收率97.2 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種近平滑假絲酵母生物催化制備2-羥基-5-巰基-苯酸的方法，其特征在于近平滑 假絲酵母發(fā)酵液中加入底物對(duì)-酚基磺酸，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹?平 平加 O 19-20g/L，葡萄糖 18-22g/L，木糖45-50g/L、蔗糖25-28g/L、綠豆粉 18-22 g/L;調(diào)節(jié) pH為6.1-6.4，攪拌使反應(yīng)液乳化，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)溫度35 °C，反應(yīng)時(shí)間 為36-40小時(shí)；反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，立即流加濃度為5%的NaHCO3水溶液，同時(shí)流加濃度為1 %的鹽 酸水溶液，調(diào)節(jié)NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.1-6.4，所加入的物料均經(jīng)過(guò)滅 菌處理;通氣比為0.6-0.65V/V ·分鐘，即每分鐘通氣量為0.6-0.65倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束 后，破乳，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，有機(jī)相蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物2-羥基-5-巰基-苯酸，反 應(yīng)轉(zhuǎn)化率97.5-99.3 %，產(chǎn)品收率95.5-97.2 %，所述發(fā)酵液由培養(yǎng)液發(fā)酵微生物得到。2. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于近平滑假絲酵母發(fā)酵液制備過(guò)程如下:近平滑假 絲酵母經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液;發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，裝料系數(shù)為0.6-0.7，121 °(：高壓滅菌30分鐘，冷卻至32-33Γ，將近平滑假絲酵母種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為 7.3-7.9%，通氣比為1.2 -1.4V/V·分鐘，32-33°C培養(yǎng)40-44小時(shí)，發(fā)酵液中濕酵母細(xì)胞濃 度為92-96g/L，此發(fā)酵液用作生物催化反應(yīng)催化劑;發(fā)酵罐中培養(yǎng)液成份為:葡萄糖32-36 g/L，木糖7-8g/L，玉米胚芽粉 13-15 g/L，酵母提取物 6-8 g/L，（順4 ) 2HP〇4 12-15 g/ L，KH2PO 4 6.5-7.5 g/L. MgS〇4 ·7Η20 0.7-0.8 g/L，NaCl 0.1-0.12 g/L; ρΗ6·4。
【文檔編號(hào)】C12R1/72GK105886563SQ201610464860
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】馬玉潔, 劉均洪
【申請(qǐng)人】青島科技大學(xué)