一種基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制備方法，該方法利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的含天花粉突變體的基因的大腸桿菌，經(jīng)過一定規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)和簡潔有效的分離提純工藝直接得到，具體包括以下步驟：重組天花粉蛋白突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、大腸桿菌發(fā)酵、天花蛋白突變體分離提取，該工藝可作為規(guī)?；a(chǎn)工藝。經(jīng)過發(fā)酵純化的天花粉蛋白突變體，與天然天花粉蛋白相比，生物活性基本不變，得到的蛋白不僅毒性和過敏原性降低，而且也解決了藥物制備的原料問題。
【專利說明】
一種基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制備方 法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝 及純化制備方法，實現(xiàn)了在采用發(fā)酵工藝生產(chǎn)重組天花粉蛋白突變體的藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS)是來源于中藥天花粉，是從萌蘆科植物栝樓根 中抽提取的一個植物蛋白，它的化學(xué)本質(zhì)為一種單鏈的核糖體失活蛋白，能特異切除真核 細胞28S rRNA上第4324位腺嘌呤，從而阻斷蛋白質(zhì)的合成。TCS可以作為新一代的抗艾滋 病良藥，不僅療效確切，而且耐受性較好。近十年來，TCS在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面都有 了很大進展。1989年，McGrath和楊顯榮等在美國科學(xué)院報上發(fā)表關(guān)于TCS抗HIV的研究 報告，美國食品及藥品監(jiān)督管理局（FDA)批準TCS進行分子定點改造，目的在于保留TCS藥 效活性的同時降低其毒副作用，使之臨床應(yīng)用更加安全。
[0003] TCS臨床應(yīng)用時偶爾會引起過敏反應(yīng)，極大的限制了它的應(yīng)用。重組DNA技術(shù)為 TCS的改造和大規(guī)模生產(chǎn)提供了嶄新的途徑?；蛑亟M天花粉蛋白突變體（MTCS)是從基 層水平對TCS的局部進行定點改造后獲得的，既能保留TCS的原有功能，又能解決其毒副作 用，目前國內(nèi)由北京翔天牧生物科技有限公司申請的涉及天花粉蛋白突變體的三項發(fā)明專 利均已授權(quán)，專利號分別為：ZL01103102. 6、ZL01816701. 2 和 ZL200410042402. 4。
[0004] 目前國內(nèi)不少高表達的基因工程產(chǎn)品是以包涵體形式被表達出來，這是由于產(chǎn)品 在表達的宿主菌種未能正確構(gòu)象造成。雖然包涵體有得率高、便于初步純化的優(yōu)點，但要使 其復(fù)性，需要經(jīng)過變性復(fù)性的過程，在這個過程中使用的變性劑和復(fù)性劑很難去除完全，而 國際上對基因工程產(chǎn)品不含變性劑的要求卻是非常嚴格；通常以可溶性的方式被表達出來 的基因工程產(chǎn)品，得率一般不高。
[0005] 本發(fā)明在以往專利的基礎(chǔ)上，在對菌體的生產(chǎn)環(huán)境和MTCS表達條件進行深入研 究后確定的工程菌發(fā)酵工藝，可以保證MTCS工程菌得以高水平表達，并且產(chǎn)品是以可溶方 式被表達出來，整個生產(chǎn)過程不含任何變性劑和復(fù)性劑，符合國際上對基因工程產(chǎn)品的要 求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制備方 法，該發(fā)酵工藝及純化方法，不僅可以高效表達出MTCS，而且在整個純化過程中，不加入任 何的變性劑和復(fù)性劑，是一種高表達可溶性MTCS的發(fā)酵工藝和簡便純化MTCS的方法，通過 該方法，不僅可以生產(chǎn)出低毒副作用的MTCS，而且也為MTCS的生產(chǎn)解決了原料問題。
[0007] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
[0008] 1. -種基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制備方法，該方法的詳細生 產(chǎn)工藝如下：含MTCS基因的質(zhì)粒載體一轉(zhuǎn)化宿主得工程菌一工程菌接種培養(yǎng)一放大發(fā)酵 培養(yǎng)一MTCS基因的誘導(dǎo)表達一離心收集菌體一菌體的超聲波破碎一上清液過柱得粗產(chǎn)品 -透析一產(chǎn)品。
[0009] 2.根據(jù)上述1所述的基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制備方法，其 中，所使用的宿主菌株為大腸桿菌BL21菌株。
[0010] 3.根據(jù)上述1所述的基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制備方法，其 中，發(fā)酵所用培養(yǎng)基為改良的M9ZB培養(yǎng)基，配方如下：
[0011]
[0012] 4.根據(jù)上述3所述的基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，發(fā)酵過程 中所加入的補料為葡萄糖、蛋白胨和氨水，如下所示：
[0015] 5.根據(jù)上述1所述的基因重組天花粉蛋白突變體分離提純步驟方法，其中，所用 填料為CM-Sepharse_CL_6B離子交換柱。
[0016] 6.根據(jù)上述1所述的基因重組天花粉蛋白突變體分離提純步驟方法，其中，所使 用的透析液為50%的醫(yī)用甘油。
[0017] 7.根據(jù)上述1所述的基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制備方法，其 中，所透析后的蛋白要再進行去熱源處理。
[0018] 8.根據(jù)上述7所述的產(chǎn)品去熱源處理，其中，所使用的方法為使用活性炭進行處 理。
【具體實施方式】
[0019] 下面用實施例來進一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0020] 實施例一：MTCS發(fā)酵流程
[0021] 1.將MTCS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)中；
[0022] 2.將轉(zhuǎn)化好的BL21在200mlLB液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，35°C、200rpm振蕩培養(yǎng)15 小時，制備種子液；
[0023] 3.按照以下配方進行培養(yǎng)基配制
[0024] 發(fā)酵培養(yǎng)基
[0025]
[0026] 補料
[0027]
[0028] 4. 110°C，15分鐘，將培養(yǎng)基和補料進行蒸汽滅菌。
[0029] 5.將長至0. 250D左右的種子液接種到發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。
[0030] 6.當0D約為12左右時，加入ImM IPTG進行誘導(dǎo)表達。
[0031] 7.誘導(dǎo)表達4個小時后，收集發(fā)酵液。
[0032] 8.離心收集菌體。
[0033] 最終離心后，得到的濕菌體重量為55g濕菌體/L發(fā)酵液。
[0034] 實施例二：MTCS純化流程
[0035] 1.破碎菌體
[0036] 取55g濕菌體，加入400ml的50m mol Tris-HCl ρΗ7· 4細胞裂解液，放入到超聲 波破碎儀中，在〇°C冰浴條件下，間隔20秒破碎20秒，直到菌體全部破碎。
[0037] 2.離心
[0038] 在4°C下，16950g離心30min，收集上清液。
[0039] 3.上柱
[0040] 先用注射水預(yù)平衡CM-S印harse-CL-6B離子交換柱，平衡完成后，將樣品瓶置 于高于離子交換柱依靠重力緩慢上樣。上樣完成后，用約5個柱體積去熱源的50m mol Tris-HCl pH7. 4平衡液平衡柱。
[0041] 4.洗脫
[0042] 用200mM NaCl，50m mol Tris-HCl pH7. 4洗脫液洗脫樣品，用紫外監(jiān)測器監(jiān)測280 的吸收值，并收集目的樣品峰。
[0043] 5.透析
[0044] 用去熱源的50m mol Tris-HCl pH7. 4緩沖液進行透析。
[0045] 6.再次離心
[0046] 在4°C下，16950g離心30min，收集上清液。
[0047] 7.上柱
[0048] 先用注射水預(yù)平衡CM-S印harse-CL-6B離子交換柱，平衡完成后，將樣品瓶置 于高于離子交換柱依靠重力緩慢上樣。上樣完成后，用約10個柱體積去熱源的50m mol Tris-HCl pH7. 4平衡液平衡柱。
[0049] 8.梯度洗脫
[0050] 將 0-0.3mol NaCl，50m mol Tris-HCl ρΗ7·4 洗脫液梯度洗脫樣品。
[0051] 9.透析
[0052] 用50%的醫(yī)用甘油為緩沖液進行透析，共透析2遍。
[0053] 10.去熱源
[0054] 將待用的活性炭200°C、2h干熱滅菌，在超凈臺內(nèi)將透析后的蛋白通過活性炭吸 附柱進行去熱源處理。
[0055] 最終得到蛋白108mg，得率為108mg/L。
[0056] 以上實施例說明使用本發(fā)明的基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制 備方法能保證MTCS工程菌得以高水平表達，并且產(chǎn)品是以可溶方式被表達出來，整個生產(chǎn) 過程不含任何變性劑和復(fù)性劑，符合國際上對基因工程產(chǎn)品的要求。同時對所得到產(chǎn)品可 以有效的去熱源，是一種高表達可溶性MTCS的發(fā)酵工藝和簡便純化MTCS的方法，通過該方 法，不僅可以生產(chǎn)出低毒副作用的MTCS，而且也為MTCS的生產(chǎn)解決了原料問題。
[0057] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施范例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神 和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制備方法，該方法包括重組天花 粉蛋白突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、菌株發(fā)酵、天花蛋白突變體分離提取。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制備方法，其 特征在于，所使用的宿主菌株為大腸桿菌BL21菌株。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制備方法，其 特征在于，發(fā)酵所用培養(yǎng)基為改良的M9ZB培養(yǎng)基，配方如下4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，發(fā) 酵過程中所加入的補料為葡萄糖、蛋白胨和氨水，其配方如下：5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制備方法，其 特征在于，蛋白分離提取的步驟如下： (1) 離心發(fā)酵液，得到濕菌體； (2) 破碎菌體，離心分離，取上清； (3) 上柱，洗脫； (4) 透析脫鹽。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因重組天花粉蛋白突變體分離提純步驟方法，其特征在 于，所用填料為CM-Sepharse_CL_6B離子交換柱。7. 據(jù)權(quán)利要求5所述的基因重組天花粉蛋白突變體分離提純步驟方法，其特征在于， 所使用的最終透析液為50%的醫(yī)用甘油。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組天花粉蛋白突變體的發(fā)酵工藝及純化制備方法，其
【文檔編號】C12R1/19GK105886579SQ201410717543
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月27日
【發(fā)明人】郭利川, 劉思哲, 劉小曼, 程奇, 王智宏
【申請人】無錫翔天奇生物科技有限公司