一種重組人胸腺法新的高密度發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地提供一種重組人胸腺法新的高密度發(fā)酵方法。根據(jù)本發(fā)明的重組人胸腺法新的高密度發(fā)酵方法，包括以下步驟：1)工作種子培養(yǎng)；2)接種于發(fā)酵罐發(fā)酵；3)誘導(dǎo)前補(bǔ)料；4)誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)酵方法可實(shí)現(xiàn)在55L規(guī)模發(fā)酵中重組人胸腺法新的高效表達(dá)，最終菌體濃度OD600可達(dá)90以上，且融合蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的45％以上，使重組人胸腺法新的發(fā)酵工藝規(guī)模達(dá)到了世界先進(jìn)水平，并解決了重組人胸腺法新表達(dá)量低和產(chǎn)率達(dá)不到規(guī)?；蟮募夹g(shù)難題，為重組人胸腺法新的產(chǎn)業(yè)化奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種重組人胸腺法新的高密度發(fā)酵方法
(一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種重組人胸腺法新的高密度、高表達(dá)發(fā)酵方法。
(二)
【背景技術(shù)】
[0002]胸腺法新是由胸腺分泌的免疫功能較強(qiáng)的小分子多肽，由28個(gè)氨基酸組成。在體內(nèi)、外試驗(yàn)中，胸腺法新對(duì)細(xì)胞因子的分泌、淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志及淋巴細(xì)胞功能均有影響，在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中起著重要的作用，被認(rèn)為是生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，因此被廣泛用于免疫損害病者的疫苗免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑、治療慢性乙型肝炎、丙型肝炎、癌癥以及自身免疫性疾病。
[0003]胸腺法新的制備有化學(xué)合成與基因工程兩種方法?；瘜W(xué)合成胸腺法新:于上世紀(jì)90年代初由美國(guó)賽生藥業(yè)國(guó)際有限公司研發(fā)，商品名為日達(dá)仙。自2002年以來，國(guó)內(nèi)也有多家公司開發(fā)出化學(xué)合成胸腺法新，如邁普新、基泰以及和日等?；蚬こ绦叵俜ㄐ?目前仍處于研究階段，國(guó)內(nèi)外尚未有基因工程胸腺法新產(chǎn)品上市。
[0004]化學(xué)合成胸腺法新采用固相合成法制備，需要用肽合成儀合成胸腺法新，經(jīng)化學(xué)修飾后，再用高效液相色譜進(jìn)行純化，對(duì)原料純度要求高，合成儀器和設(shè)備投資大，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，環(huán)境污染嚴(yán)重，成本高。因此，產(chǎn)品價(jià)格昂貴，醫(yī)療費(fèi)用較高，合成過程可能引入一定的毒性，在一定程度上限制了臨床上廣泛應(yīng)用。
[0005]基因工程胸腺法新是用生物工程技術(shù)構(gòu)建胸腺法新基因表達(dá)載體，主要在大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)分離純化而制成，可以克服化學(xué)合成法存在的不足。因此，國(guó)內(nèi)外一些單位正在研發(fā)基因工程胸腺法新，但大多數(shù)單位目前尚未解決小分子多肽表達(dá)量低的技術(shù)難題，其產(chǎn)率達(dá)不到規(guī)?；螅写M(jìn)一步研究。例如，林陳水在15L發(fā)酵罐中(發(fā)酵規(guī)模9L)進(jìn)行分批補(bǔ)料培養(yǎng)，最終菌體濃度OD6。?？蛇_(dá)40以上，目的產(chǎn)物占菌體總蛋白25%以上(林陳水等，浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2006 ；34(3) =277-280)。程波在5L發(fā)酵罐中(發(fā)酵規(guī)模3L)進(jìn)行了補(bǔ)料分批培養(yǎng)，最終獲得菌體的干重達(dá)10g/L(相當(dāng)于菌體濃度0D6。。25)，融合蛋白表達(dá)量達(dá)23.25% (程波等，武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào).2007 ;29(3):21-25)。顏真在5L發(fā)酵罐中(發(fā)酵規(guī)模3.5L)進(jìn)行分批補(bǔ)料培養(yǎng)，最終菌體濃度OD6。。達(dá)到60以上，融合蛋白表達(dá)占菌體總蛋白的42.4%左右(顏真等，藥物生物技術(shù).2000 ;7(4):209-212)。總之，在現(xiàn)有關(guān)重組人胸腺法新的發(fā)酵工藝報(bào)道中，所涉及的發(fā)酵規(guī)模仍處于9L以下小規(guī)模研究階段，并且在較小規(guī)模發(fā)酵時(shí)雖然可以獲得較高的菌體濃度和融合蛋白表達(dá)量，但是在較大規(guī)模發(fā)酵時(shí)卻獲得較低的菌體濃度和融合蛋白表達(dá)量，因此，現(xiàn)報(bào)道的發(fā)酵工藝中存在大問題是發(fā)酵規(guī)模、菌體濃度和融合蛋白表達(dá)量三者不能以較高水平同時(shí)呈現(xiàn)，從而導(dǎo)致其產(chǎn)率達(dá)不到規(guī)?；?。
[0006]基于上述，因而目前急需一套可實(shí)現(xiàn)重組人胸腺法新高密度、高表達(dá)，而且能夠到達(dá)規(guī)模化要求的發(fā)酵工藝，為其生產(chǎn)制備提供充足的原料以及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，使基因工程胸腺法新成為化學(xué)合成胸腺法新的有效替代品。(三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]發(fā)明的目的是提供一種重組人胸腺法新的高密度發(fā)酵方法，從而實(shí)現(xiàn)高密度、高表達(dá)生產(chǎn)重組人胸腺法新。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的重組人胸腺法新的高密度發(fā)酵方法，包括以下步驟:
[0009]I)工作種子培養(yǎng):
[0010]將工作種子庫(kù)的菌種接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中，置于搖床進(jìn)行培養(yǎng)，控制溫度35-37°C，轉(zhuǎn)速200-230rpm，培養(yǎng)7_9h，得到一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液以2-5%的接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中，置于搖床進(jìn)行培養(yǎng)，控制溫度35-37°C，轉(zhuǎn)速200-230rpm，培養(yǎng)15-17h，即得到發(fā)酵工作種子液；
[0011]2)接種于發(fā)酵罐發(fā)酵:
[0012]將制備好的發(fā)酵工作種子液以5-15%的接種量接種于含發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速為150-500rpm，通氣量為10_80L/min，罐壓為0.2-0.4par，維持溶氧水平在20-60%，發(fā)酵溫度為35-37 °C，加入25-28% (v/v)氨水控制發(fā)酵pH在6.8-7.2 ;
[0013]3)誘導(dǎo)前補(bǔ)料:
[0014]紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度0D_為1.0-1.5時(shí)，開始以2.5mL/L.h的流速補(bǔ)加碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中每隔Ih進(jìn)行離線檢測(cè)葡萄糖濃度，根據(jù)葡萄糖濃度反饋補(bǔ)料，控制葡萄糖濃度在0.8-1.2g/L ;紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度0D_為30-35時(shí)，以5-7mL/L -h的流速開始補(bǔ)加有機(jī)氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基；其中所述的碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基為50%葡糖糖溶液，所述的有機(jī)氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基為200%胰蛋白胨與酵母粉(I: 3)混合溶液；
[0015]4)誘導(dǎo)表達(dá):
[0016]紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度OD6。。為70-90時(shí)，向發(fā)酵罐中加入含異丙基硫代半乳酸糖苷(IPTG)的水溶液，至IPTG終濃度為0.5-0.7mM，1min后開始以12_14mL/L-h的流速補(bǔ)加碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基，同時(shí)以12-14mL/L.h的流速補(bǔ)加有機(jī)氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基，同時(shí)將發(fā)酵溫度調(diào)為30°C，開始進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)4-5h。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于根據(jù)菌體生長(zhǎng)規(guī)律，結(jié)合底物濃度反饋補(bǔ)料，調(diào)節(jié)碳源和有機(jī)氮補(bǔ)料液流加速度，維持葡糖糖濃度在0.8-1.2g/L和控制C: N比例，從而調(diào)節(jié)菌體的生長(zhǎng)速度以及目的產(chǎn)物的合成效率。本發(fā)酵方法可實(shí)現(xiàn)重組人胸腺法新的高密度、高表達(dá)發(fā)酵，在100L中試發(fā)酵罐(發(fā)酵規(guī)模55L)發(fā)酵獲得的最終菌體濃度OD6。。可高達(dá)90以上，且融合蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的45%以上，使其發(fā)酵規(guī)模、最終菌體濃度和融合蛋白表達(dá)量三者能夠以較高水平同時(shí)呈現(xiàn)，即使其發(fā)酵工藝的實(shí)用性和效率性更強(qiáng)，從而解決了重組人胸腺法新表達(dá)量低的技術(shù)難題和產(chǎn)率達(dá)不到規(guī)模化要求問題，為重組人胸腺法新的產(chǎn)業(yè)化奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
(四)
【附圖說明】
[0018]圖1為30L發(fā)酵罐中試高密度發(fā)酵時(shí)菌體生長(zhǎng)曲線圖；圖中，橫坐標(biāo)為發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)為菌體濃度0D6。。。
[0019]圖2為30L發(fā)酵罐中試高密度發(fā)酵時(shí)菌體濕重變化示意圖；圖中，橫坐標(biāo)為發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)為菌體濕重。
[0020]圖3為重組人胸腺法新的30L發(fā)酵罐中試高密度發(fā)酵表達(dá)SDS-PAGE電泳圖；圖中，M為蛋白分子量Marker，泳道I為誘導(dǎo)前，泳道2為誘導(dǎo)后。
[0021]圖4為100L發(fā)酵罐中試高密度發(fā)酵時(shí)菌體生長(zhǎng)曲線圖；圖中，橫坐標(biāo)為發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)為菌體濃度0D6。。。
[0022]圖5為100L發(fā)酵罐中試高密度發(fā)酵時(shí)菌體濕重變化示意圖；圖中，橫坐標(biāo)為發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)為菌體濕重。
[0023]圖6為重組人胸腺法新的100L發(fā)酵罐中試高密度發(fā)酵表達(dá)SDS-PAGE電泳圖；
[0024]圖中，M為蛋白分子量Marker，泳道I為誘導(dǎo)后，泳道2為誘導(dǎo)前。
(五)
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅僅是用于更詳細(xì)具體地說明之用，而不應(yīng)將其理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。
[0026]實(shí)施例中所用的材料，如下所示:
[0027]工作菌種:采用本公司自行構(gòu)建的BL21/pNL-06_T α I工程菌(參見發(fā)明專利CN101993885Α)作為工作菌種。
[0028]主要設(shè)備:100L發(fā)酵罐(HaniI，LIFLUS SP 100L)，30L發(fā)酵罐(上海保興，B10TECH-30JS)，高壓蒸汽滅菌器(江陰濱江，LS-B100L-1)，氣浴恒溫振蕩器(江蘇太倉(cāng)，THZ-22)，電子天平(Sartorius，TE4101-L、TE212-L)，紫外分光光度計(jì)(AgilentTechnologies，Cary60),工作超凈臺(tái)(蘇州安泰，Sff-CJ-lF), pH 計(jì)(Mettler Toledo，F(xiàn)E20)，生化分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所，SBA-40C)，凝膠成像儀(Tanon，1600)，臺(tái)式離心機(jī)(Sigma，1-13)，連續(xù)流高速冷凍離心機(jī)(HITACHI，CR2IGIII)。
[0029]種子培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉lg/L。
[0030]發(fā)酵培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀13.3g/L、磷酸氫二錢4g/L、一水合梓檬酸1.7g/L、胰蛋白胨lg/L、酵母粉lg/L、七水硫酸鎂1.145g/L、葡萄糖lg/L、微量元素溶液4mL/L、硫酸卡那霉素 0.03g/Lo
[0031]碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基:50%葡萄糖溶液。
[0032]有機(jī)氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基:200%有機(jī)氮源混合溶液(胰蛋白胨:酵母粉=1:3)。
[0033]實(shí)施例1
[0034]1.30L發(fā)酵罐中試高密度發(fā)酵:
[0035]I)工作種子培養(yǎng)
[0036]從-80°C工作種子庫(kù)中取一支菌種，待其完全融化后取100 μ L菌液接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基(250mL三角瓶裝50mL，含50 μ g/mL卡那霉素)中，置于搖床進(jìn)行培養(yǎng)，控制溫度37°C，轉(zhuǎn)速230rpm，培養(yǎng)8h，得到一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液以3%的接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基(2L三角瓶分別裝800mL，含50 μ g/mL卡那霉素)中，置于搖床進(jìn)行培養(yǎng)，控制溫度37°C，轉(zhuǎn)速230rpm，培養(yǎng)15_17h，即得到發(fā)酵工作種子液。
[0037]2)接種于30L發(fā)酵罐發(fā)酵
[0038]將制備好的發(fā)酵工作種子液以10%的接種量接種于含14L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵；機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速為150-500rpm，通氣量為10_80L/min，罐壓為0.2-0.4par,維持溶氧水平在20-50 %，控制發(fā)酵溫度37 °C，加入25-28 % (v/v)氨水控制發(fā)酵pH在6.9-7.1o
[0039]3)誘導(dǎo)前補(bǔ)料
[0040]紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度0D_為1.0-1.3時(shí)，開始以2.5mL/L.h的流速補(bǔ)加碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中每隔Ih進(jìn)行離線檢測(cè)葡萄糖濃度，根據(jù)葡萄糖濃度進(jìn)行反饋補(bǔ)料，控制葡萄糖濃度在0.8-1.2g/L ;紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度0D_為32左右時(shí)，以6mL/L.h的流速開始補(bǔ)加有機(jī)氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基。
[0041]4)誘導(dǎo)表達(dá)
[0042]紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度OD6。。為80左右時(shí)，向發(fā)酵罐中加入含2g異丙基硫代半乳酸糖苷(IPTG)的水溶液，1min后開始以14mL/L -h的流速補(bǔ)加碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基，同時(shí)以14mL/L -h的流速補(bǔ)加有機(jī)氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基，同時(shí)將發(fā)酵溫度調(diào)為30°C，開始進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)4h。
[0043]5)下罐收集菌體
[0044]誘導(dǎo)表達(dá)4h后，停止流加碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基和有機(jī)氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基，關(guān)閉所有控制參數(shù)，結(jié)束發(fā)酵進(jìn)程，之后利用罐壓將發(fā)酵菌液排放至干凈的100L收集桶中。采用連續(xù)流離心機(jī)離心(9500rpm、4°C、進(jìn)樣流速100mL/min)收集的發(fā)酵菌液，棄上清，收集沉淀物，稱量沉淀物總重即得到總菌體濕重。
[0045]2.主要指標(biāo)測(cè)定方法:
[0046]I)菌體濃度的測(cè)定
[0047]A.取樣:每隔Ih從發(fā)酵罐中進(jìn)行取樣，每次取樣量lOOmL，取樣時(shí)棄掉前50mL發(fā)酵菌液，收集后50mL發(fā)酵菌液。
[0048]B.樣品處理:將采集的發(fā)酵菌液吹打混勻后，取適量菌液，用純水進(jìn)行稀釋，使其稀釋液的吸光值OD6。。讀數(shù)在0.2-0.8范圍內(nèi)。
[0049]C.測(cè)定:以純水作為空白對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600nm處測(cè)定稀釋液的吸光值。
[0050]D.數(shù)據(jù)處理:根據(jù)公式(菌體濃度=稀釋液吸光值X稀釋倍數(shù))計(jì)算得出菌體濃度0D_，并以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌體濃度0D_為縱坐標(biāo)，繪制出發(fā)酵過程的菌體生長(zhǎng)曲線圖。
[0051]2)菌體濕重的測(cè)定
[0052]A.取樣:每隔Ih從發(fā)酵罐中取樣，每次取樣量lOOmL，取樣時(shí)棄掉前50mL發(fā)酵菌液，收集后50mL發(fā)酵菌液。
[0053]B.測(cè)定:將采集的發(fā)酵菌液吹打混勻后，分別取ImL菌液裝于4支已稱重的1.5mL離心管中，12000rpm離心2min，棄上清，最后采用電子天平稱量4支離心管的重量，即得到總重。
[0054]C.數(shù)據(jù)處理:根據(jù)公式{菌體濕重=(總重-總皮重)/4X103}計(jì)算得出單位體積的菌體濕重，并以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌體濕重為縱坐標(biāo)，繪制出發(fā)酵過程的菌體濕重變化示意圖。
[0055]3)融合蛋白含量測(cè)定
[0056]采用非還原性SDS-PAGE電泳法測(cè)定融合蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的百分比，具體操作為:
[0057]A.取樣:在誘導(dǎo)前(對(duì)照組)和發(fā)酵結(jié)束(樣品組)時(shí)，分別取等菌體量的發(fā)酵菌液(100-200 μ L)，各I支，12000rpm離心2min，棄上清，收集菌體。
[0058]B.樣品處理:首先，在對(duì)照組和樣品組樣品中分別加入90 μ L破菌液；其次，在對(duì)照組和樣品組樣品中分別加入2 μ LDNA酶，吹打混勻，12000rpm離心2min，分別取20 μ L上清；最后，與2Χ非還原型上樣緩沖液以1:1混合，煮沸2min，同樣，蛋白分子量Marker煮沸 2min0
[0059]C.SDS-PAGE 凝膠配制:
[0060]15%分離膠(1mL):純水 2.3mL、1.5M Tris-HCl PH8.82.5mL、30% Arc/Bis 凝膠儲(chǔ)液 5mL、10% SDS 0.lmL、TEMED 5 μ L、10% AP 100 μ L0
[0061]5%濃縮膠(6mL):純水 3.4mL、lM Tris-HCl ρΗ6.80.625mL、30% Arc/Bis 凝膠儲(chǔ)液 0.85mL、TEMED 5 μ L、10% AP 50 μ L。
[0062]按上述配方配制分離膠溶液，混勻后立即倒入準(zhǔn)備好的凝膠模具中，用移液器在凝膠上方輕輕加入純水，水封，靜置20min聚合。聚合后倒掉模具中水封用蒸餾水，再按上述配方配制濃縮膠溶液，混勻后立即倒入濃縮膠，插上梳子，靜置20min聚合。
[0063]D.上樣跑電泳:對(duì)照組和樣品組上樣量均為20 μ L/孔，蛋白分子量Marker上樣量10 μ L/孔；上樣后開始以30mA恒流跑電泳Ih。
[0064]E.染色和脫色:電泳結(jié)束，關(guān)閉電泳儀，將電泳膠轉(zhuǎn)移至染色盒中，加入考馬斯亮蘭染色液，置于搖床上染色30min，之后更換為脫色液，于搖床上脫色至背景全無，取出電泳膠置于水中。
[0065]F.拍照保存:將脫色后的電泳膠轉(zhuǎn)移至白色板上，采用Tanon凝膠成像儀拍攝電泳膠，保存照片。
[0066]G.數(shù)據(jù)處理:利用Tanon Gel Image SystemlD分析軟件分析電泳圖片，得出融合蛋白的表達(dá)量。
[0067]3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0068]實(shí)施例1，經(jīng)菌體濃度測(cè)定，顯示最終菌體濃度0D_可高達(dá)100以上(見圖1);經(jīng)菌體濕重測(cè)定，顯示最終單位菌體濕重約為210g/L(見圖2);經(jīng)融合蛋白含量測(cè)定，顯示融合蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的45 %以上(見圖3)。
[0069]實(shí)施例2
[0070]1.100L發(fā)酵罐中試高密度發(fā)酵:
[0071]I)工作種子培養(yǎng)
[0072]從-80°C工作種子庫(kù)中取一支菌種，待其完全融化后取200 μ L菌液接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基(500mL三角瓶裝lOOmL，含50 μ g/mL卡那霉素)中，置于搖床進(jìn)行培養(yǎng)，控制溫度37°C，轉(zhuǎn)速230rpm，培養(yǎng)8h，得到一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液以3%的接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基(4個(gè)2L三角瓶分別裝800mL，含50 μ g/mL卡那霉素)中，置于搖床進(jìn)行培養(yǎng)，控制溫度37°C，轉(zhuǎn)速230rpm，培養(yǎng)15_17h，即得到發(fā)酵工作種子液。
[0073]2)接種于100L發(fā)酵罐發(fā)酵
[0074]將制備好的發(fā)酵工作種子液以5.5%的接種量接種于含55L發(fā)酵培養(yǎng)基的100L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速為150-500rpm，通氣量為10_80L/min，罐壓為0.2-0.4par,維持溶氧水平在20-50%，發(fā)酵溫度37°C，加入25-28% (v/v)氨水控制發(fā)酵pH在6.9-7.1。
[0075]3)誘導(dǎo)前補(bǔ)料
[0076]紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度0D_為1.0-1.3時(shí)，開始以2.5mL/L.h的流速補(bǔ)加碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中每隔Ih進(jìn)行離線檢測(cè)葡萄糖濃度，根據(jù)葡萄糖濃度進(jìn)行反饋補(bǔ)料，控制葡萄糖濃度在0.8-1.2g/L ;紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度0D_為32左右時(shí)，以6mL/L.h的流速開始補(bǔ)加有氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基。
[0077]4)誘導(dǎo)表達(dá)
[0078]紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度OD6。。為80左右時(shí)，向發(fā)酵罐中加入含8g異丙基硫代半乳酸糖苷(IPTG)的水溶液，1min后開始以14mL/L -h的流速補(bǔ)加碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基，同時(shí)以14mL/L -h的流速補(bǔ)加有機(jī)氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基，同時(shí)將發(fā)酵溫度調(diào)為30°C，開始進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)4h。
[0079]5)下罐收集菌體
[0080]誘導(dǎo)表達(dá)4h后，停止流加碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基和有機(jī)氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基，關(guān)閉所有控制參數(shù)，結(jié)束發(fā)酵進(jìn)程，之后利用罐壓將發(fā)酵菌液排放至干凈的100L收集桶中。采用連續(xù)流離心機(jī)離心(9500rpm、4°C、進(jìn)樣流速100mL/min)收集的發(fā)酵菌液，棄上清，收集沉淀物，稱量沉淀物總重即得到總菌體濕重。
[0081]2.主要指標(biāo)測(cè)定方法:
[0082]I)菌體濃度的測(cè)定
[0083]A.取樣:每隔Ih從發(fā)酵罐中進(jìn)行取樣，每次取樣量lOOmL，取樣時(shí)棄掉前50mL發(fā)酵菌液，收集后50mL發(fā)酵菌液。
[0084]B.樣品處理:將收集的發(fā)酵菌液吹打混勻，取適量菌液，用純水進(jìn)行稀釋，使其稀釋液的吸光值OD6。。讀數(shù)在0.2-0.8范圍內(nèi)。
[0085]C.測(cè)定:以純水作為空白對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600nm處測(cè)定稀釋液的吸光值。
[0086]D.數(shù)據(jù)處理:根據(jù)公式(菌體濃度=稀釋液吸光值X稀釋倍數(shù))計(jì)算得出菌體濃度0D_，并以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌體濃度0D_為縱坐標(biāo)，繪制出發(fā)酵過程的菌體生長(zhǎng)曲線圖。
[0087]2)菌體濕重的測(cè)定
[0088]A.取樣:每隔Ih從發(fā)酵罐中取樣I次，每次取樣量lOOmL，取樣時(shí)棄掉前50mL發(fā)酵菌液，收集后50mL發(fā)酵菌液。
[0089]B.測(cè)定:將收集的發(fā)酵菌液吹打混勻后，分別取ImL菌液裝于4支已稱重的1.5mL離心管中，12000rpm離心2min，棄上清，最后采用電子天平稱量4支離心管的重量，即得到總重。
[0090]C.數(shù)據(jù)處理:根據(jù)公式{菌體濕重=(總重-總皮重)/4X103}計(jì)算得出單位體積的菌體濕重，并以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌體濕重為縱坐標(biāo)，繪制出發(fā)酵過程的菌體濕重變化示意圖。
[0091]3)融合蛋白含量測(cè)定
[0092]采用非還原性SDS-PAGE電泳法測(cè)定融合蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的百分比，具體操作為:
[0093]A.取樣:在誘導(dǎo)前(對(duì)照組)和發(fā)酵結(jié)束(樣品組)時(shí)，分別取等菌體量的發(fā)酵菌液(100-200 μ L)，各I支，12000rpm離心2min，棄上清，收集菌體。
[0094]B.樣品處理:首先，在對(duì)照組和樣品組樣品中分別加入90 μ L破菌液；其次，在對(duì)照組和樣品組樣品中分別加入2 μ LDNA酶，吹打混勻，12000rpm離心2min，分別取20 μ L上清；最后，分別與2Χ非還原型上樣緩沖液以1:1混合，煮沸2min，同樣，蛋白分子量Marker 煮沸 2min。
[0095]C.SDS-PAGE 凝膠配制:
[0096]15%分離膠(1mL):純水 2.3mL、1.5M Tris-HCl PH8.82.5mL、30% Arc/Bis 凝膠儲(chǔ)液 5mL、10% SDS 0.lmL、TEMED 5 μ L、10% AP 100 μ L0
[0097]5%濃縮膠(6mL):純水 3.4mL、lM Tris-HCl ρΗ6.80.625mL、30% Arc/Bis 凝膠儲(chǔ)液 0.85mL、TEMED 5 μ L、10% AP 50 μ L。
[0098]按上述配方配制分離膠溶液，混勻后立即倒入準(zhǔn)備好的凝膠模具中，用移液器在凝膠上方輕輕加入純水，水封，靜置20min聚合。聚合后倒掉模具中水封用蒸餾水，再按上述配方配制濃縮膠溶液，混勻后立即倒入濃縮膠，插上梳子，靜置20min聚合。
[0099]D.上樣跑電泳:對(duì)照組和樣品組上樣量均為20 μ L/孔，蛋白分子量Marker上樣量10 μ L/孔；上樣后開始以30mA恒流跑電泳Ih。
[0100]E.染色和脫色:電泳結(jié)束，關(guān)閉電泳儀，將電泳膠轉(zhuǎn)移至染色盒中，加入考馬斯亮蘭染色液，置于搖床上染色30min，之后更換為脫色液，于搖床上脫色至背景全無，取出電泳膠置于水中。
[0101]F.拍照保存:將脫色后的電泳膠轉(zhuǎn)移至白色板上，采用凝膠成像儀拍攝電泳膠，保存照片。
[0102]G.數(shù)據(jù)處理:利用Tanon Gel Image SystemlD分析軟件分析電泳圖，得出融合蛋白的表達(dá)量。
[0103]3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0104]實(shí)施例2，經(jīng)菌體濃度測(cè)定，顯示最終的菌體濃度0D_可高達(dá)90以上(見圖4);經(jīng)菌體濕重測(cè)定，顯示最終單位菌體濕重約為191g/L(見圖5);經(jīng)融合蛋白含量測(cè)定，顯示融合蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的45%以上(見圖6)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種重組人胸腺法新的高密度發(fā)酵方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 1)工作種子培養(yǎng): 將工作種子庫(kù)的菌種接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中，置于搖床進(jìn)行培養(yǎng)，控制溫度35-37°C，轉(zhuǎn)速200-230rpm，培養(yǎng)7_9h，得到一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液以2-5%的接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中，置于搖床進(jìn)行培養(yǎng)，控制溫度35-37°C，轉(zhuǎn)速200-230rpm，培養(yǎng)15-17h，即得到發(fā)酵工作種子液； 2)接種于發(fā)酵罐發(fā)酵: 將制備好的發(fā)酵工作種子液以5-15%的接種量接種于含發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速為150-500rpm，通氣量為10_80L/min，罐壓為0.2-0.4par，維持溶氧水平在20-60%，發(fā)酵溫度為35-37 °C，加入25-28% (v/v)氨水控制發(fā)酵pH在6.8-7.2 ； 3)誘導(dǎo)前補(bǔ)料: 紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度OD_為1.0-1.5時(shí)，開始以2.5mL/L.h的流速補(bǔ)加碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中每隔Ih進(jìn)行離線檢測(cè)葡萄糖濃度，根據(jù)葡萄糖濃度反饋補(bǔ)料，控制葡萄糖濃度在0.8-1.2g/L ;紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度OD_為30-35時(shí)，以5_7mL/L.h的流速開始補(bǔ)加有機(jī)氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基；其中所述的碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基為50%葡糖糖溶液，所述的有機(jī)氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基為200%胰蛋白胨與酵母粉(I: 3)混合溶液； 4)誘導(dǎo)表達(dá): 紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度OD_為70-90時(shí)，向發(fā)酵罐中加入含異丙基硫代半乳酸糖苷(IPTG)的水溶液，至IPTG終濃度為0.5-0.7mM，1min后開始以12_14mL/L-h的流速補(bǔ)加碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基，同時(shí)以12-14mL/L.h的流速補(bǔ)加有機(jī)氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基，同時(shí)將發(fā)酵溫度調(diào)為30°C，開始進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)4-5h。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于高密度發(fā)酵規(guī)?？蛇_(dá)55L。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在發(fā)酵過程中誘導(dǎo)表達(dá)階段，碳源補(bǔ)料培養(yǎng)基與有機(jī)氮源補(bǔ)料培養(yǎng)基的流加速度相等。
【文檔編號(hào)】C12P21/02GK105886581SQ201510168946
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2015年4月3日
【發(fā)明人】聶李亞, 許松山, 馬素永, 梁明征
【申請(qǐng)人】北京諾思蘭德生物技術(shù)股份有限公司