稻瘟病抗性基因Pb1功能特異性分子標記及其專用引物、檢測方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種稻瘟病抗性基因Pb1功能特異性分子標記及其專用引物、檢測方法和應用。本發(fā)明分子標記為包含Pb1基因編碼區(qū)上游926bp～1085bp的DNA片段。所述引物中，正向引物的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的堿基序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明還公開了該分子標記的檢測方法及在輔助選擇育種中的應用。本發(fā)明分子標記檢測特異性好，可以應用于水稻稻瘟病抗性育種中Pb1基因分子標記輔助選擇，以提高分子標記輔助選擇的效率和新品種培育的效率。
【專利說明】
稻瘟病抗性基因 Pb1功能特異性分子標記及其專用引物、檢測 方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，尤其涉及檢測水稻抗稻瘟病抗性基因的分子標記及 其專用引物、檢測方法和應用。
【背景技術】
[0002] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由稻 痕病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻痕病是對水稻生產(chǎn)危害最嚴重的病害之一，每年都 造成嚴重的糧食損失?？共∑贩N的選育和推廣是防治稻瘟病最環(huán)保、最經(jīng)濟和最有效的辦 法。傳統(tǒng)的抗稻瘟病育種依賴于抗性表型鑒定，易受到環(huán)境條件和人為誤差的影響，目標基 因的選擇效率低。隨著分子標記技術的應用，抗病基因型的選擇越來越容易。
[0003] 稻瘟病分為葉瘟和穗瘟，穗瘟危害最為嚴重，直接影響水稻穗實粒數(shù)、粒重及品 質。到目前為止，國內外利用分子標記技術已鑒定和定位80多個水稻稻瘟病抗性基因，克隆 了葉痕抗性基因：Pia，Pib，Pid2，Pik，Pik_h/Pi54，Pik_m，Pik-p，Pish，Pit，Pita，Piz_t， ?11，？12，？15，？19，？121，？136，？137，？156，？163，卩1(：039等22個，2個穗瘟抗性基因：？125/ Pid3和Pbl基因，并開發(fā)了針對？^&、？訃、？丨1^丨1〇11、？丨1^、？丨1、？^、？丨5和？丨25等基因的功 能特異性標記（國家水稻數(shù)據(jù)中心:http://www.ricedata. cn/gene/) 〇
[0004] 其中，抗性基因 Pbl所介導的抗性是持久抗性，且是成株期抗性(抗穗瘟），Pbl是一 個來自秈稻品種Modan的抗性基因，其編碼CC-NBS-LRR蛋白，這種蛋白與之前報道的抗病蛋 白有所不同，它沒有P-loop結構，而且一些其他基序也退化了。Pbl位于一個以60-kb為單位 的串聯(lián)重復序列中。Pbl的轉錄水平隨著含Pbl基因品種的發(fā)育過程而增加，這種表達模式 也與它的成株期抗性或抗穗瘟相符合。日本研究者已經(jīng)開發(fā)了與Pbl連鎖的RFLP標記。但存 在三個不足:①實驗操作繁瑣，檢測效率低。由于RFLP標記需要用限制性內切酶酶切DNA、凝 膠電泳分開DNA片段、轉移濾膜及用放射性標記的探針雜交顯示特定的DNA片段等步驟，實 驗操作繁瑣，檢測周期長，成本高昂，不適于大規(guī)模的分子育種。②選擇有誤差，準確率不 高。由于此標記位于抗性基因 Pbl的側翼，與目標基因存在著一定的物理距離，在減數(shù)分裂 過程中選擇標記與目標基因可能發(fā)生交換，容易出現(xiàn)錯選的情況，選擇準確率不高。③連鎖 標記應用有局限性。連鎖標記可能受到遺傳背景的限制，在不同的群體中選擇，需對親本的 多態(tài)性進行檢測；限制了標記在非多態(tài)群體的使用。在隨后利用抗性基因 Pbl的研究，也有 報道SSR標記RM26998作為連鎖標記，雖實驗操作簡便，但選擇效率不高和應用局限性仍未 得到解決。為了能更準確有效的將抗穗瘟基因 Pbl應用到水稻抗性育種工作中，有必要開發(fā) 抗性基因 Pbl的新型的功能標記。

【發(fā)明內容】

[0005] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種基于基因內部特異性 差異而開發(fā)設計的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特異性分子標記，檢測準確性高。本發(fā)明的另一 個目的是提供了該分子標記的引物、檢測方法和應用。
[0006] -種稻瘟病抗性基因 Pbl功能特異性分子標記，它為包含Pbl基因編碼區(qū)上游 926bp ~1085bp 的 DNA 片段。
[0007] 因 Pbl基因位于一個以60kb為單位的串聯(lián)重復序列中，Pbl與P5基因緊密連鎖，且 Pbl基因與P5基因編碼的蛋白只有一個谷氨酸的差異，而Pbl發(fā)揮功能取決于基因編碼區(qū)上 游l-2056bp序列，
【申請人】發(fā)現(xiàn)P5和Pbl含l-1016bp序列，Nip無;Pbl和Nip含1017-2056bp序 列，而P5無，因此包含Pbl基因編碼區(qū)上游926bp~1085bp的DNA片段可作為稻瘟病抗性基因 Pb 1特異性的分子標記。
[0008] 進一步的，本發(fā)明的分子標記的核苷酸序列如SEQ ID N0: 3所示，也可以為含有 SEQ ID從):3所示核苷酸序列的0嫩片段。
[0009] SEQ ID N0:3為本發(fā)明引物擴增出的159bp片段，擴增區(qū)域為Pbl基因編碼區(qū)上游 926bp~1085bp。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種擴增稻瘟病抗性基因 Pbl功能特異性分子標記的引物，正向 引物的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的堿基序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種所述的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特異性分子標記的檢測方 法，包括：
[0012] ⑴根據(jù)所述的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特異性分子標記的核苷酸序列設計引物；
[0013] (2)以被檢測水稻的基因組DNA作為模板進行PCR擴增；
[0014] (3)判斷PCR擴增產(chǎn)物中是否存在所述的分子標記。
[0015] 步驟⑴，所述引物中，正向引物的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示，反向引物的堿基 序列如SEQ ID N0.2所示。
[0016] 步驟(2)，PCR擴增的體系為：1·5μ1基因組DNA，0.5yl 2mM上游引物，0·5μ1 2mM下 游引物，1·2μ1 lOXTaq Buffer，0.3yl ImM dNTP，0.1yl 1000U Taq DNA聚合酶，ddH20補 足至10μ1。
[0017] PCR擴增的程序為:95 °C預變性5min; 94°C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸40s，運 行33個循環(huán);最后72°C延伸10min。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特異性分子標記在輔助選擇育種 中的應用。
[0019] 本發(fā)明的分子標記可用于今后的分子標記輔助選擇育種中，本領域技術人員可以 理解，比如通過檢測水稻基因組中是否存在本發(fā)明的分子標記來篩選水稻是否具有以Pbl 基因主導的穗瘟抗性。檢測是否含本發(fā)明的分子標記可以是PCR的方法，具體的，可以采用 上述的檢測方法，也可以通過測序方法進行。
[0020] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果包括：
[0021] (1)本發(fā)明中Pbl分子標記位于基因啟動子區(qū)，彌補了連鎖標記容易錯選的不足， 準確率高，不受遺傳背景的限制，在不同的群體中選擇，不需對親本的多態(tài)性進行檢測。另 外，可采用PCR的方法進行分子標記的檢測，操作簡單，檢測效率高。
[0022] (2)本發(fā)明分子標記可特異性檢測Pbl基因。因 Pbl基因位于一個以60-kb為單位的 串聯(lián)重復序列中，Pbl與P5基因緊密連鎖，且Pbl基因與P5基因編碼的蛋白只有一個谷氨酸 的差異，而Pbl發(fā)揮功能取決于基因編碼區(qū)上游l_2056bp序列，
【申請人】發(fā)現(xiàn)P5和Pbl含1- 1016bp序列，Nip無;Pbl和Nip含1017-2056bp序列，而P5無，因此在Nip和P5序列的邊界處設 計引物，可特異擴增Pb 1片段，檢測的準確性高。
[0023] (3)本發(fā)明設計的引物特異性好，采用該引物擴增出的SEQ ID N0:3所示分子標記 片段大小為159bp，可直接用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測目標條帶，成本低，操作簡便，適 合于大規(guī)模的分子育種。
【附圖說明】
[0024] 圖1為Pbl與P5基因編碼區(qū)上游l-1016bp序列比對(框代表后引物位置）；
[0025] 圖2為Pbl基因編碼區(qū)上游1017-2056bp與對應的Nip基因組序列比對(框代表前引 物位置）；
[0026]圖3為鎮(zhèn)稻88系譜圖；
[0027]圖4為鎮(zhèn)稻11號、15號、18號系譜圖；
[0028]圖5為江蘇省審定品種中Pbl基因檢測電泳圖；
[0029]圖6為2015年江蘇省28份預試材料檢測Pb 1基因的電泳圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。
[0031] 本發(fā)明分子標記Pbl-Ι的具體應用包含純實驗室技術部分和對含有Pbl基因的育 種群體水稻材料的檢測。它的應用不限于以下實施例。
[0032] 實施例1分子標記的開發(fā)及引物設計
[0033] Pbl 基因：genebank 登錄號為 AB570371 · 1 ;P5 基因：genebank 登錄號 AB570370.1。 [0034] Pbl位于一個以60kb為單位的串聯(lián)重復序列中，且Pbl位于第二個重復序列中，與 第一個重復序列中的P5相對應。P5編碼的蛋白只比Pbl多了一個谷氨酸，Pbl與P5都具有穗 瘟抗性，但Pbl抗穗瘟能力顯著高于P5,兩個基因抗穗瘟的差異并不是這個谷氨酸的差異造 成的，而是Pbl的基因表達水平明顯高于P5。通過比對Pbl與P5基因編碼區(qū)上游啟動子區(qū)發(fā) 現(xiàn)，基因編碼區(qū)上游l〇16bp的啟動子序列完全匹配（圖1)，而感病品種（以Nip即日本晴為 例）不含這段序列；基因編碼區(qū)上游l〇17bp-2056bp處，Pbl與Nip序列大部分匹配（圖2)，而 P5不含這段序列。l-1016bp和1017-2056bp序列同時存在，Pbl才能發(fā)揮功能。因此，我們將 前引物SEQ ID N0:1設計在1017-2056bp之間，后引物SEQ ID N0:2設計在l-1016bp之間，能 夠特異檢測Pbl基因。
[0035] 設計引物時，考慮引物退火溫度處于50°C_55°C，擴增片段大小為100_200bp。
[0036] 正向引物（即前引物）：ATCAACGCTACCTTCCC
[0037] 反向引物（即后引物）：GTGCCATCACAATTTCTTC [0038]實施例2 Pbl檢測的實驗流程
[0039]對江蘇省審定品種中鎮(zhèn)稻88、鎮(zhèn)稻11號、武育粳23、鎮(zhèn)稻15號、寧9108、鎮(zhèn)稻19號、 鎮(zhèn)稻18號、鎮(zhèn)稻14號進行檢測。
[0040]步驟一、DNA 提取(SDS法）：
[00411 1、將2cm長的葉片剪碎置2ml的離心管中，加上鋼珠，然后放入裝液氮的保溫瓶中 速凍，快速撈取放在48孔模具上，蓋好蓋子置于磨樣機上震動30s，取下離心管，倒出鋼珠。
[0042] 2、在含有液氮磨碎的葉片的2ml離心管中，加入SDS(0.1M Tris-Hcl，PH 8.0; 0.025M EDTA，PH 8.0;29.25g/l Nacl;12g/1 SDS)600yl，放置65°C水浴鍋中，30min。
[0043] 3、加入 150μ1 KAc(PH 4.8)，放置-2(TC冰箱，30min。
[0044] 4、加入與SDS等體積的氯仿:異戊醇(體積比為24:1)溶液，放置振蕩器充分搖勻， 20min〇
[0045] 5、離心，12000rpm，4min，轉移200μ1上清液置1.5ml離心管中。
[0046] 6、在上清液中加入2倍體積-20 °C預冷的無水乙醇，置于-20 °C冰箱，20min。
[0047] 7、離心，12000rpm，4min，棄上清，風干，加入200μ1 ddH2〇溶解，此為DNA母液。
[0048] 8、將母液稀釋10倍即為DNA工作液。
[0049] 9、取1.5μ1用于PCR擴增反應。
[0050] 步驟二、PCR擴增：
[0051 ] PCR擴增反應在PCR擴增儀上進行。
[0052] 1、反應體系如下：
[0053] 總體積：10μl。DNAl·5μl;2mMSEQIDN0:l上游引物0·5μl ;2mMSEQIDN0:2下 游引物0.5yl;10XTaq Buffer(GENERAY，捷瑞公司）1·2μ1，1πιΜ dNTP 0·3μ1，100〇υ Taq DNA聚合酶(GENERAY)O. ΙμL，加 ddH20補足至 10μ1。
[0054] 2、PCR的擴增程序如下：
[0056] 步驟三、PCR產(chǎn)物檢測：
[0057]用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，取擴增好的PCR產(chǎn)物2μl，以DNAMarker (100bp-I DNAladder)作為分子量對照，在240V恒壓下電泳1小時。銀染顯示DNA條帶，通過 比對DNA Marker找到目標條帶，根據(jù)片段大小判斷抗感基因：用引物對SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2檢測，159bp為含Pbl，不含Pbl則擴增不出條帶。
[0058]結果如圖5,樣品順序（從左到右）為：鎮(zhèn)稻88、鎮(zhèn)稻11號、武育粳23、鎮(zhèn)稻15號、寧 9108、鎮(zhèn)稻19號、鎮(zhèn)稻18號、鎮(zhèn)稻14號，Μ代表Marker。在這8個水稻品種中，鎮(zhèn)稻88、鎮(zhèn)稻11 號、鎮(zhèn)稻15號和鎮(zhèn)稻18號檢測到Pbl基因，其余水稻品種未檢測到Pbl基因。
[0059] 實施例3江蘇省審定品種Pbl基因檢測
[0060] Pb 1基因來自秈稻品種Modan，而鎮(zhèn)稻88由Modan衍生而來（圖3)，鎮(zhèn)稻88田間穗瘟 抗性好，通過Pbl基因的功能標記檢測發(fā)現(xiàn)其含有Pbl。而鎮(zhèn)稻11號、15號、18號皆由鎮(zhèn)稻88 衍生而來(圖4)，這三個品種也檢測到了Pbl基因，與其田間抗穗瘟表型相一致。
[0061]實施例4稻瘟病抗性基因 Pbl功能特異性分子標記在輔助選擇育種的用途。
[0062]從江蘇省2015年預試材料中選取了 28份材料(來源詳見表1 )，其中17份田間鑒定 表現(xiàn)出穗瘟抗性，經(jīng)Pbl分子標記檢測發(fā)現(xiàn)，這17份材料中含有Pbl基因（圖6)。
[0063] 圖6中，Μ代表Marker，R代表抗病，S代表感病。品種順序(從左到右)為南粳44008、 儀糯1073、鹽稻13448、皖墾粳157、泰粳1413、武4844、中江粳15-145、蘇3087、蘇2110、鎮(zhèn)稻 548、鎮(zhèn)稻448、JF004、揚粳4336、華稻1603、揚農(nóng)粳14-105、中江粳K5、福粳1508、振稻24315、 98-26、蘇秀867 (國審稻2011029 )、華豐1503、蘇1267、武粳135、泗稻14-58、瑞誠稻1號、金稻 14-153、武粳004、靖豐 4313。
[0064]表1預試水稻材料來源
[0067]以上列舉的僅限于本發(fā)明具體實施例，事實上還應有許多變形，若本領域的相關 人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或引申出的所有變形，均應為本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種稻瘟病抗性基因 Pbl功能特異性分子標記，其特征在于，它為包含Pbl基因編碼 區(qū)上游926bp~1085bp的DNA片段。2. 根據(jù)權利要求1所述的稻瘟病抗性基因 Pb 1功能特異性分子標記，其特征在于，其核 苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;或者其為含有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA片段。3. -種擴增稻瘟病抗性基因 Pbl功能特異性分子標記的引物，其特征在于，正向引物的 喊基序列如SEQ ID NO. 1所不，反向引物的喊基序列如SEQ ID NO.2所不。4. 一種根據(jù)權利要求1或2所述的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特異性分子標記的檢測方 法，其特征在于，包括： (1) 根據(jù)權利要求1或2所述的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特異性分子標記的核苷酸序列 設計引物； (2) 以被檢測水稻的基因組DNA作為模板進行PCR擴增； (3) 判斷PCR擴增產(chǎn)物中是否存在所述的分子標記。5. 根據(jù)權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述引物中，正向引物的堿基序列如 SEQ ID NO.1所示，反向引物的堿基序列如SEQ ID NO.2所示。6. 根據(jù)權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，PCR擴增的體系為：1.5μ1基因組DNA， 0·5μ1 2mM上游引物，0·5μ1 2mM下游引物，1·2μ1 IOXTaq Buffer，0.3yl ImM (1ΝΤΡ，0·1μ1 1000U Taq DNA聚合酶，CldH2O補足至 10μ1。7. 根據(jù)權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，PCR擴增的程序為:95°C預變性5min; 94 °C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸40s，運行33個循環(huán)；最后72 °C延伸IOmin。8. 根據(jù)權利要求1或2所述的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特異性分子標記在輔助選擇育種 中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK105886631SQ201610305124
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】孫立亭, 林添資, 龔紅兵, 景德道, 余波, 錢華飛, 曾生元, 李闖, 姚維成, 盛生蘭, 周義文
【申請人】江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所