Kras基因突變檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒，包括：（1）用于擴(kuò)增樣本中KRAS基因Exon2、3和4三個(gè)外顯子的特異性引物，引物序列分別是SEQ ID Nos：1?6；（2）用于測(cè)序PCR的測(cè)序引物，分別用于對(duì)KRAS基因Exon2、3和4三個(gè)外顯子進(jìn)行測(cè)序分析，引物序列分別是SEQ ID Nos：7?9；（3）3個(gè)裝有KRAS野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒按1:1質(zhì)量比例混合的陽(yáng)性質(zhì)控品管和1個(gè)裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管。本試劑盒可直接利用含人體某組織部位的石蠟包埋樣本通過(guò)Sanger測(cè)序法檢測(cè)出樣本中KRAS基因主要突變位點(diǎn)型別。
【專利說(shuō)明】
KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及一種腫瘤相關(guān)基因 KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] KRAS基因是ras基因家族中三種癌基因的一種，為表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游基因。KRAS基因位于12號(hào)染色體上， 編碼具有GTP酶活性、分子量為21kD的蛋白，又稱為p21蛋白。在ras基因中，KRAS對(duì)人類癌 癥影響最大，它好像分子開(kāi)關(guān)：當(dāng)正常時(shí)能控制調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的路徑;發(fā)生異常時(shí)，則導(dǎo)致 細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)，并阻止細(xì)胞自我毀滅。她參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，當(dāng)KRAS基因突變時(shí)，該基 因永久活化，不能產(chǎn)生正常的ras蛋白，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)紊亂，細(xì)胞增殖失控而癌變。
[0003] KRAS基因的點(diǎn)突變主要集中在特定的氨基酸密碼子(第12、13、61、146密碼子)上， 占所有突變的90%以上。KRAS基因突變可以導(dǎo)致細(xì)胞逃逸凋亡，這種在胰腺癌、大腸癌、肺 癌中的發(fā)生率較高。在胰腺癌中，KRAS基因點(diǎn)突變發(fā)生率高達(dá)90%以上;而在大腸癌患者 KRAS突變率為30% -35%;肺癌患者KRAS突變率為10-20%。檢測(cè)KRAS基因突變，對(duì)判斷 這些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、預(yù)后以及了解腫瘤的治療效果具有一定意義。（1)正常人血檢中出 現(xiàn)KRAS基因異常，提示屬于腫瘤高危人群；（2)良性腫瘤患者若是檢出KRAS基因突變，提 示有惡變的可能；（3)大量研究表明，KRAS基因突變陽(yáng)性，即使病理組織學(xué)診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陰性，癌癥復(fù)發(fā)的可能性也很高；（4)無(wú) KRAS基因突變的肺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤患者，經(jīng)抗 EGFR靶向藥物治療療效明顯，因此，通過(guò)檢測(cè)KRAS基因突變狀態(tài)可以篩選用藥人群，實(shí)現(xiàn)腫 瘤患者的個(gè)體化治療，延長(zhǎng)患者生存期。
[0004] 臨床上革E1向新藥愛(ài)必妥（Erbitux，西妥昔單抗）和帕尼單抗（Panitumumab)僅 適用于無(wú)突變的KRAS基因野生型患者，而對(duì)KRAS突變患者無(wú)效。《美國(guó)國(guó)立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò) (NCCN)結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》明確指出：一是所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測(cè)KRAS 基因狀態(tài)；二是只有KRAS野生型患者才建議接受EGFR抑制劑如西妥昔單抗(Cetuximab)和 帕尼單抗(panitumumab)的治療；《09年NCCN非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》明確指出：當(dāng) KRAS基因如果發(fā)生了突變，則不建議病人使用特羅凱（Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib) 進(jìn)行分子靶向治療。KRAS基因檢測(cè)是目前醫(yī)生篩選出抗EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體）靶向藥 物治療有效的大腸癌患者，實(shí)現(xiàn)腫瘤病人的個(gè)體化治療，從而達(dá)到良好的預(yù)后，延長(zhǎng)患者生 存期。我國(guó)目前對(duì)于KRAS基因檢測(cè)最新的調(diào)研數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，國(guó)內(nèi)近40家檢測(cè)中心已完成 檢測(cè)近1000例，其中65.9%為野生型。此時(shí)如果做了 KRAS基因檢測(cè)，通過(guò)個(gè)體化的綜合治療 方案，在化療基礎(chǔ)上加靶向藥物，如愛(ài)必妥，有效率可以達(dá)到60 %左右。因此，大腸癌患者不 但要進(jìn)行KRAS基因檢測(cè)，而且越早越好，這樣六成左右的KRAS野生型患者就有希望抓住 最佳的治療時(shí)期，獲得良好的治療效果。
[0005] KRAS基因突變的檢測(cè)主要有Sanger測(cè)序法、ARMS、FISH等。其中FISH技術(shù)主要適用 于拷貝數(shù)變異的檢測(cè)，同時(shí)由于操作過(guò)程繁瑣，該方法以逐漸顯現(xiàn)其局限性;ARMS技術(shù)是目 前國(guó)內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，但只能檢測(cè)已知的位點(diǎn)，且要將樣本分成多個(gè)管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)才 能實(shí)現(xiàn)分型，對(duì)樣本量要求高；而Sanger測(cè)序法是DNA序列分析的經(jīng)典方法，最直接的、可檢 測(cè)已知和未知突變的一種方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認(rèn)為是基因分型 的金標(biāo)準(zhǔn)，其主要優(yōu)點(diǎn)是測(cè)序長(zhǎng)度較長(zhǎng)，可發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)，包括一些新的少見(jiàn)的突變形 式及突變的確切類型，如點(diǎn)突變、片段缺失。所以探索一種Sanger測(cè)序法檢測(cè)KRAS基因的技 術(shù)具有重要的臨床意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了解決上述問(wèn)題，提供一種KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒，可直接 利用含人體某組織部位的石蠟包埋樣本通過(guò)Sanger測(cè)序法檢測(cè)出樣本中KRAS基因主要突 變位點(diǎn)型別，檢測(cè)位點(diǎn)包括KRAS基因2、3和4三個(gè)外顯子的主要突變位點(diǎn)，包括但不限于2號(hào) 外顯子上c. 35G>A，p.G12D突變位點(diǎn)；3號(hào)外顯子上c. 183A>C，p. Q61H突變位點(diǎn)；4號(hào)外顯子 上c.436G>A，ρ·Α146Τ突變位點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明的KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒具體包括： (1) 用于擴(kuò)增樣本中KRAS基因 Exon2、3和4三個(gè)外顯子的特異性引物，具體序列如下：
(2) 用于測(cè)序PCR的測(cè)序引物，分別用于對(duì)KRAS基因 Exon2、3和4三個(gè)外顯子進(jìn)行測(cè)序分 析，具體序列如下：
(3) 3個(gè)裝有KRAS野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒按1:1質(zhì)量比例混合的陽(yáng)性質(zhì)控品管和1個(gè) 裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管;其中突變型質(zhì)粒包括2號(hào)外顯子上c.35G>A，p.G12D突變位點(diǎn)； 3號(hào)外顯子上c.183A>C，p.Q61H突變位點(diǎn)；4號(hào)外顯子上c.436G>A，P.A146T突變位點(diǎn)；PCR 反應(yīng)預(yù)混液由以下組份組成：
其中 10x PCR buffer中含有500 mM KC1，100 mM Tris-HCl (pH 8·3)，100 mM (NH4) 2SO4,和 15 mM MgCl2;25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和25mM dGTPs〇
[0008] 本試劑盒主是根據(jù)KRAS基因的Exon2、3和4三個(gè)外顯子的保守序列分別設(shè)計(jì)KRAS 基因三個(gè)外顯子的特異性引物，分別將Exon2、3和4三個(gè)外顯子使用PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，純 化回收擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明的各種引物長(zhǎng)度在20-25個(gè)堿基之間，無(wú)特殊修飾。反應(yīng)液預(yù)混液 采用獨(dú)特的配方及比例。不同外顯子的PCR擴(kuò)增條件一致，且能在樣本濃度較低時(shí)檢測(cè)到目 的基因，結(jié)果無(wú)非特異性擴(kuò)增。具體操作流程包括： (1)引物設(shè)計(jì):利用引物設(shè)計(jì)軟件，如Primer Premier 5，從KRAS基因 DNA序列中挑選特 定的序列，然后根據(jù)堿基互補(bǔ)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)KRAS基因 Exon2、3和4三個(gè)外顯子的特異性引物，用 于擴(kuò)增樣本中DNA,引物序列分別是SEQ ID NOs: 1-6。測(cè)序引物的設(shè)計(jì)與用于擴(kuò)增樣本中 DNA的特異性引物的設(shè)計(jì)類似，不過(guò)測(cè)序引物只需要一段即可，引物序列分別是SEQ ID N0s：7-9〇
[0009] (2 )PCR擴(kuò)增:利用試劑盒中含特定序列的引物PCR擴(kuò)增臨床樣本中的DNA。
[0010] (3)瓊脂糖凝膠電泳及膠回收:將擴(kuò)增得到的目的基因 KRAS的Exon2、3和4三個(gè)外 顯子片段回收用于測(cè)序。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 以下是附圖的說(shuō)明，以便于理解上述發(fā)明的目的和具體特征。
[0012] 圖1為KRAS基因的Exon2、3和4三個(gè)外顯子的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。 [0013]附圖1中各標(biāo)號(hào)的具體表不如下： 1:1號(hào)樣本;2:2號(hào)樣本;3:3號(hào)樣本;K4: KRAS基因第4號(hào)外顯子;K3: KRAS基因第3號(hào)外顯 子;K2:KRAS基因第2號(hào)外顯子；M:DNA maker，從上到下大小依次為2000、1000、750、500、 250和100。
[0014]圖2-1為KRAS基因的Exon2外顯子的測(cè)序結(jié)果截圖，測(cè)序結(jié)果為野生型。
[0015]圖2-2為KRAS基因的Exon2外顯子的測(cè)序結(jié)果截圖，測(cè)序結(jié)果為突變體。
[0016]圖2-3為KRAS基因的Exon3外顯子的測(cè)序結(jié)果截圖，測(cè)序結(jié)果為野生型。
[0017] 圖2-4為KRAS基因的Exon3外顯子的測(cè)序結(jié)果截圖，測(cè)序結(jié)果為突變體。
[0018] 圖2-5為KRAS基因的Exon4外顯子的測(cè)序結(jié)果截圖，測(cè)序結(jié)果為野生型。
[0019]圖2-6為KRAS基因的Exon4外顯子的測(cè)序結(jié)果截圖，測(cè)序結(jié)果為突變體。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 1、引物設(shè)計(jì) 根據(jù)KRAS基因在肺癌等疾病中的突變情況及個(gè)體化治療后產(chǎn)生的耐藥機(jī)制，利用引物 設(shè)計(jì)軟件，如Primer Premier 5,從KRAS基因 DNA序列中挑選特定的序列，然后根據(jù)堿基互 補(bǔ)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)KRAS基因 Exon2、3和4三個(gè)外顯子的特異性引物，用于擴(kuò)增樣本中DNA。引物序 列分別是SEQ ID Nos: 1-6。
[0021] 測(cè)序引物的設(shè)計(jì)與用于擴(kuò)增樣本中DNA的特異性引物的設(shè)計(jì)類似，不過(guò)測(cè)序引物 只需要一段即可，引物序列分別是SEQ ID Nos:7-9。
[0022] 2、PCR 擴(kuò)增 2.1、質(zhì)控品準(zhǔn)備 陽(yáng)性質(zhì)控品為KRAS野生型和突變型質(zhì)?；旌衔?，陰性質(zhì)控品為無(wú)菌水。使用前室溫融 化，旋渦振蕩10秒，瞬時(shí)離心10秒。
[0023] 2.2、試劑配制 提前將試劑取出，室溫融化，旋渦振蕩10秒，瞬時(shí)離心10秒。
[0024]確定反應(yīng)數(shù)N，N=待檢樣本數(shù)(η) X 4+質(zhì)控品數(shù)+1。計(jì)算加到反映混合物中的各個(gè) 試劑的量，計(jì)算如下：
取一個(gè)滅菌離心管配制上述反應(yīng)體系，試劑全部加入后旋渦振蕩10秒，瞬時(shí)離心。然后 將上述混合液按20μ1/管分裝至PCR反應(yīng)管中。
[0025] 2.3、加樣 將KRAS陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和樣本DNA分別取2.5 μL加入至IjPCR反應(yīng)管中，其中樣 本要稀釋至20ng/yl;然后再將相應(yīng)的引物加入到對(duì)應(yīng)的PCR反應(yīng)管中，每個(gè)樣本需要引物 各加2.5μ1(引物用之前先稀釋1/10至ΙΟμΜ)，同時(shí)作好標(biāo)記，蓋緊管蓋后，瞬時(shí)離心15秒，將 管壁上的液體全部甩至管底，消除氣泡，可重復(fù)離心至氣泡完全消除。然后立即進(jìn)行PCR擴(kuò) 增反應(yīng)。
[0026] 2.4、PCR 擴(kuò)增 配置完成后，將PCR管放入PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序如下：
3、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳及回收 由于PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度較短，配制2%(w/w)的瓊脂糖凝膠；電泳條件為120V，20min。電泳完成 后，取出凝膠，使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，并記錄擴(kuò)增條帶情況。如果PCR產(chǎn)物電泳結(jié) 果良好，即可回收目的片段用于測(cè)序。本試劑盒不包含核酸回收成分，請(qǐng)采用商品化的瓊脂 糖凝膠回收試劑盒?；厥盏玫降漠a(chǎn)物即可用于測(cè)序。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測(cè)KRAS基因突變的Exon2、3和4三個(gè)外顯子的引物，包括特異性引物和測(cè)序引 物，特異性引物序列分別是SEQ ID Nos: 1-6,測(cè)序引物序列分別是SEQ ID Nos: 7-9。 2. KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒，包括： (1) 用于擴(kuò)增樣本中KRAS基因 Exon2、3和4三個(gè)外顯子的特異性引物，引物序列分別是 SEQ ID Nos：1-6； (2) 用于測(cè)序PCR的測(cè)序引物，分別用于對(duì)KRAS基因 Exon2、3和4三個(gè)外顯子進(jìn)行測(cè)序分 析，引物序列分別是SEQ ID Nos: 7-9; (3) 3個(gè)裝有KRAS野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒按1:1質(zhì)量比例混合的陽(yáng)性質(zhì)控品管和1個(gè) 裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管，其中突變型質(zhì)粒包括2號(hào)外顯子上c.35G>A，p.G12D突變位點(diǎn)； 3號(hào)外顯子上c.183A>C，p.Q61H突變位點(diǎn)；4號(hào)外顯子上c.436G>A，P.A146T突變位點(diǎn)。 1擬未Il惡所祙試劑合.蛙征亦千.P「R應(yīng)領(lǐng)淚液由W下丟鉑成.其中 10* PCR buffer中含有500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH4) 2SO4,和 15 mM MgCl2;25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和25mM dGTPs〇
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105886650SQ201610402439
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】陳俊飛, 鄭焱, 謝龍旭
【申請(qǐng)人】廣州凱普醫(yī)藥科技有限公司