用抗cxcr4抗體治療c1013g/cxcr4相關(guān)的華氏巨球蛋白血癥的制作方法
【專利摘要】本公開提供了用于治療患有華氏巨球蛋白血癥(WM)的主體的方法，所述方法包括向所述主體施用治療有效量的特異性結(jié)合表達(dá)于WM細(xì)胞表面上的CXCR4受體的抗體或其抗原結(jié)合部分。本公開還提供用于治療患有C1013G/CXCR4相關(guān)的WM的患者的治療方案。
【專利說明】用抗CXCR4抗體治療C1013G/CXCR4相關(guān)的華氏巨球蛋白血癥
[0001] 在整個(gè)本申請(qǐng)中，多個(gè)出版物在括號(hào)中通過作者姓名和日期或通過專利號(hào)或公開 號(hào)來引用。這些出版物的完整引用可以見于在權(quán)利要求之前緊接的說明書的結(jié)尾。這些出 版物的公開內(nèi)容以其整體通過引用并入本申請(qǐng)中以更完整地描述在本文描述和要求保護(hù) 的本發(fā)明的日期時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的現(xiàn)有技術(shù)。然而，本文參考的引用不應(yīng)解釋為承 認(rèn)此類參考是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本公開涉及特異性結(jié)合人CXCR4的單克隆抗體在治療C1013G/CXCR4相關(guān)的華氏巨 球蛋白血癥的方法中的用途。
[0003] 發(fā)明背景 C-X-C趨化因子受體4型(CXCR4)在胚胎發(fā)生過程中在生理?xiàng)l件中起關(guān)鍵作用，諸如淋 巴細(xì)胞生成和骨髓(BM)髓細(xì)胞生成。在出生后的生命過程中，CXCR4及其配體調(diào)節(jié)⑶341細(xì) 胞返回至BM微環(huán)境(BM niches)以及淋巴細(xì)胞運(yùn)輸。CXCR4已顯示在患有遺傳性雜合常染色 體顯性疾病的患者中被突變，所述疾病特征在于異常功能免疫，已知為疣、低丙球蛋白血 癥、感染和先天性骨髓粒細(xì)胞缺乏癥(WMM)綜合征，這是由于尤其存在由C1013G變體所代 表的CXCR4基因的激活突變(Balabanian等人，2005; Balabanian等人，2008)。近期證 據(jù)支持在華氏巨球蛋白血癥中存在CXCR4體細(xì)胞畸變(WM;淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤）（Hunter等 人，2014; Treon等人，2014)。之前尚未描述該變體在支持淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤的進(jìn)展中 的功能作用以及是否相比于其他B細(xì)胞淋巴組織增生實(shí)體其對(duì)于WM是獨(dú)特的或其在IgM意 義未明的單克隆丙球病(MGUS)階段發(fā)生。
[0004] WM是罕見的B細(xì)胞病癥，在美國每年有每百萬人中約3例的發(fā)病率。在美國每年約 1，000至1，500人被診斷為WM。全基因組測(cè)序近來已揭示可能對(duì)該疾病的發(fā)病機(jī)理起作用的 分子機(jī)制。具體而言，L265P/MYD88已被描述為WM患者中的普遍的體細(xì)胞突變(Treon等人， 2012) 。體外研究已證實(shí)1^265?/1^)88變體可以導(dǎo)致增加的腫瘤細(xì)胞增殖（￥&叫等人， 2013) ;這可以至少部分通過MYD88依賴性核因子κΒ (NF-κΒ)的激活(一種已知的介導(dǎo)腫瘤B 細(xì)胞存活、生長和對(duì)治療抗性的信號(hào)傳導(dǎo)途徑）來解釋（Leleu等人，2008)。這些觀察結(jié) 果還與之前的發(fā)現(xiàn)一致，即在克隆麗細(xì)胞中過表達(dá)致癌的微RNA-155導(dǎo)致原代麗細(xì)胞中NF-κΒ的激活。實(shí)際上，微RNA-155功能缺失研究導(dǎo)致抑制NF-κΒ和體外及體內(nèi)腫瘤生長的減少 (Leleu等人，2008; Roccaro等人，2009)。然而，MYD88突變?cè)谌舾晒_的研究中沒有預(yù) 示進(jìn)展或?qū)χ委煹目剐裕砻髌渌蚋淖兛赡軐?duì)于腫瘤進(jìn)展和向遠(yuǎn)端器官的擴(kuò)散是關(guān)鍵 的。
[0005] 在低級(jí)B細(xì)胞淋巴瘤中，WM代表這樣的淋巴漿細(xì)胞亞型，其特征在于BM浸潤淋巴漿 細(xì)胞和分泌血清單克隆免疫球蛋白M(IgM)蛋白，這可以導(dǎo)致高粘血癥、出血和外周神經(jīng)病 的并發(fā)癥(611〇1^丨&1等人，2003 ;￥。&7和66^2，2007)。在診斷時(shí)81廣泛參與的證據(jù)暗 示克隆B細(xì)胞向BM中的細(xì)胞運(yùn)輸。在該背景下，腫瘤B細(xì)胞返回至BM的主要調(diào)節(jié)物之一由 CXCR4經(jīng)與其相關(guān)的配體間質(zhì)衍生的因子-1 (SDF-1/CXCL12)的相互作用而表現(xiàn)。
[0006] 完整基因組測(cè)序的初步報(bào)道已表明CXCR4可能在29% (16/55)的患有WM的患者中 被突變（Cao等人，2012)<X1013/CXCR4變體的存在和作用因此在患有麗和不同的B細(xì)胞 淋巴增生性障礙的患者中進(jìn)行研究，旨在確定該變體在WM以及對(duì)于用抗CXCR4抗體治療的 C1013/CXCR4相關(guān)的WM患者的應(yīng)答中的體內(nèi)功能作用。
[0007] 在治療癌癥中展示治療效力的抗CXCR4單克隆抗體之前已在PCT公開號(hào)W0 2008/ 060367和W0 2013/071068中描述。這兩個(gè)申請(qǐng)的公開內(nèi)容因此均以其整體通過引用并入本 申請(qǐng)。完全人單克隆抗體ulocuplumab(在W0 2008/060367中命名為F7,之前也稱為BMS-936564或MDX-1338,所有四種命名在本文中可互換使用）在實(shí)體瘤和血液癌癥的臨床前研 究中均展示出出人意料有利的抗腫瘤特性。U1 〇 cup 1 umab目前在患有復(fù)發(fā)性/難治性B細(xì)胞 惡性腫瘤的患者中正進(jìn)行I期臨床研究(NCT01120457;參見Clinical Trials Website, http://www.clinicaltrials.gov)。
[0008] 發(fā)明概述 本公開提供了用于治療患有C1013G/CXCR4相關(guān)的華氏巨球蛋白血癥的主體的方法，所 述方法包括向所述主體施用治療有效量的特異性結(jié)合表達(dá)于WM細(xì)胞表面的CXCR4受體的抗 體或其抗原結(jié)合部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，主體是人并且抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合表 達(dá)于細(xì)胞表面的人CXCR4受體，優(yōu)選攜帶C1013G突變的人CXCR4。在某些實(shí)施方案中，抗體或 其抗原結(jié)合部分是嵌合的、人源化的或人抗體或其抗原結(jié)合部分。優(yōu)選地，抗體或其抗原結(jié) 合部分是人抗體或其抗原結(jié)合部分。
[0009] 本公開還提供了用于治療患有C1013G/CXCR4-相關(guān)的mi的主體的方法，所述方法 包括:（a)選擇作為合適治療候選者的主體，所述選擇包括:（i )任選提供獲自所述主體中的 WM組織的測(cè)試組織樣品；（ii)進(jìn)行測(cè)定以確定WM測(cè)試組織樣品中的細(xì)胞是否攜帶CXCR4基 因中的C1013G突變;和（ii i)基于確定WM細(xì)胞攜帶CXCR4基因中的C1013G突變來選擇主體為 合適的候選者;和(b)向所選的主體施用治療有效量的特異性結(jié)合表達(dá)于C1013G/CXCR4-相 關(guān)的WM細(xì)胞的表面上的CXCR4受體的抗體或其抗原結(jié)合部分。
[0010] 本公開進(jìn)一步提供用于治療患有C1013G/CXCR4-相關(guān)的mi的主體的方法，所述方 法包括向所述主體施用治療有效量的特異性結(jié)合表達(dá)于C1013G/CXCR4-相關(guān)的WM細(xì)胞的表 面上的CXCR4受體的抗體或其抗原結(jié)合部分，所述主體已基于確定主體的WM細(xì)胞攜帶CXCR4 基因中的C1013G突變來進(jìn)行選擇。
[0011] 本公開還提供用于選擇WM患者用于用特異性結(jié)合表達(dá)于WM細(xì)胞的表面上的CXCR4 受體的抗體或其抗原結(jié)合部分治療的方法，所述方法包括:（a)提供獲自患者中的WM組織的 測(cè)試組織樣品；（b)進(jìn)行測(cè)定以確定WM測(cè)試組織樣品中的細(xì)胞是否攜帶CXCR4基因中的 C1013G突變;和(c)基于確定WM細(xì)胞攜帶CXCR4基因中的C1013G突變來選擇患者用于治療。
[0012] 此外，本公開提供了用于確定包括用于治療主體中的C1013G/CXCR4-相關(guān)的mi的 抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分的治療方案的方法，所述方法包括：（a)提供獲自主體中的 WM組織的測(cè)試組織樣品；（b)進(jìn)行測(cè)定以確定WM測(cè)試組織樣品中的細(xì)胞是否攜帶CXCR4基因 中的C1013G突變；和（c)基于確定WM細(xì)胞攜帶CXCR4基因中的C1013G突變來確定包括抗 CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分的治療方案。在一個(gè)方面，本公開還提供了用于治療患有 C1013G/CXCR4-相關(guān)的WM的患者的治療方案，所述方案通過本方法確定。
[0013] 在任何上述方法的某些實(shí)施方案中，麗患者中C1013G/CXCR4-突變細(xì)胞展示對(duì)常 規(guī)使用的抗WM劑(包括雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶標(biāo)(mTOR)、布魯頓氏酪氨酸激酶(BTK)、和/或 磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制劑)的抗性。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，C1013G/CXCR4-突變細(xì) 胞對(duì)BTK抑制劑依魯替尼（IMBRUVICA ? )是抗性的。因此，在某些實(shí)施方案中，在患有 C1013G/CXCR4-相關(guān)的WM的主體用mT0R、BTK和/或PI3K抑制劑治療失敗后，優(yōu)選用依魯替尼 治療失敗后，向所述主體施用治療有效量的抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分。在其他的實(shí)施 方案中，用治療有效量的抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分和治療有效量的mT0R、BTK或PI3K 抑制劑的組合治療主體。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，用抗CXCR4抗體、ulocuplumab和治療有 效量的BTK抑制劑依魯替尼的組合治療主體。
[0014] 在任何上述方法的某些實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分包含:包含 連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可變區(qū)中的⑶R1XDR2和⑶R3結(jié)構(gòu)域，其序列描述于SEQ ID N0: 25;和包含連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可變區(qū)中的CDR1、CDR2和CDR3結(jié)構(gòu)域，其序列描述于 SEQ ID N0:29〇
[0015] 在其他實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分包含:包含連續(xù)連接的氨基 酸的重鏈可變區(qū)，其序列描述于SEQ ID N0:25;和包含連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其 序列描述于SEQ ID N0:29。
[0016] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分包含：包含具有描述于 SEQ ID NO: 1的序列的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可變區(qū)⑶R1，包含具有描述于SEQ ID N0:5 的序列的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可變區(qū)CDR2,包含具有描述于SEQ ID NO:9的序列的連 續(xù)連接的氨基酸的重鏈可變區(qū)CDR3,包含具有描述于SEQ ID NO: 13的序列的連續(xù)連接的氨 基酸的輕鏈可變區(qū)CDR1，包含具有描述于SEQ ID N0:17的序列的連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈 可變區(qū)⑶R2,和包含具有描述于SEQ ID N0:21的序列的連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可變區(qū) ⑶R3。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體是ulocuplumab。
[0017]在另一方面，本公開提供了用于在主體中治療C1013G/CXCR4-相關(guān)的WM的藥劑盒， 所述藥劑盒包含：（a)抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分的劑量;和(b)用于在任一上述方法 中使用抗CXCR4抗體的說明書。用于藥劑盒中的示例性的抗CXCR4抗體包括人單克隆抗體 F7 (ulocuplumab)、F9和D1，其描述于W0 2008/060367。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥劑盒中的 抗 CXCR4 抗體是 ulocuplumab。
[0018] 本公開的其他特征和優(yōu)點(diǎn)從以下詳述和實(shí)施例中將變得顯而易見，其不應(yīng)解釋為 限制性的。整個(gè)本申請(qǐng)中引用的所有參考、GENBANK ?條目、專利和公開的專利申請(qǐng)的內(nèi)容 通過引用明確地并入本文。
[0019] 附圖簡述 圖1顯示F7 (ulocuplumab)人單克隆抗體的重鏈可變區(qū)(A)的核苷酸序列（SEQ ID N0: 33)和氨基酸序列（SEQ ID NO:邪）。重鏈CDR1 (SEQ ID NO: 1)、CDR2 (SEQ ID NO: 5)和 Q)R3 (SEQ ID NO: 9)區(qū)域進(jìn)行描繪并且顯示V、D和J種系來源（germline derivation) 〇F7 的輕鏈可變區(qū)（B)的核苷酸序列（SEQ ID NO: 37)和氨基酸序列（SEQ ID NO: 29)也顯示。 輕鏈CDR1 (SEQ ID NO: 13)、CDR2 (SEQ ID NO: 17)和CDR3 (SEQ ID NO: 21)區(qū)域進(jìn)行描 繪并且顯示V和J種系來源（germline derivation) 〇
[0020] 圖2顯示鑒定WM患者中的體細(xì)胞C1013G/CXCR4變體。攜帶C1013G/CXCR4變體的原 代麗樣品相比于野生型(WT )原代麗樣品以更高的CXCR4表面表達(dá)呈現(xiàn)，如通過對(duì)⑶191 BM 來源的WM細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)所顯示的。
[0021] 圖3顯示W(wǎng)M細(xì)胞中CXCR4過表達(dá)的效力。BCWM.1細(xì)胞用精確LentiORF/CXCR4/GFP (CXCR4+)或用空載體/RFP對(duì)照進(jìn)行感染。人CXCR4表達(dá)水平通過qRT-PCR進(jìn)行評(píng)價(jià)，使用Λ ACt方法，對(duì)GAPDH進(jìn)行均一化。Ρ代表Ρ值。
[0022]圖4顯示過表達(dá)CXCR4的WM細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)散的增強(qiáng)的能力。BCWM.1細(xì)胞用精確 LentiORF/CXCR4/GFP (CXCR4+)或用空載體/RFP(對(duì)照）進(jìn)行感染并靜脈內(nèi)注射到SCID/Bg 小鼠 （η = 5/組）。3周后，將小鼠安樂死并收獲器官。對(duì)股骨BM (A)、肝臟(B)和腎臟(C)進(jìn)行 對(duì)人⑶20和人CXCR4的蘇木精-曙紅免疫組織化學(xué)染色。進(jìn)行⑶20和CXCR4染色的定量，顯示 相比于對(duì)照細(xì)胞注射的小鼠，在CXCR4+細(xì)胞注射的小鼠中CXCR4/CD20+細(xì)胞的更高數(shù)目。Ρ 代表Ρ值。（D)在第三周將小鼠安樂死并收獲血清，通過ELISA測(cè)試人IgM水平。（Ε)通過qRT-PCR (△ ACt方法)對(duì)從BM股骨離體(ex vivo)分離的細(xì)胞進(jìn)行人CXCR4水平的檢測(cè)。未注射 的小鼠(n=3)和合并的對(duì)照細(xì)胞注射的小鼠(n=4)用作對(duì)照。P代表P值。柱代表標(biāo)準(zhǔn)差。 [0023]圖5顯示在WM細(xì)胞中過表達(dá)CXCR4導(dǎo)致體外降低的存活率和增強(qiáng)的黏著特性和生 長。相比于相關(guān)的空載體感染的細(xì)胞，過表達(dá)CXCR4的細(xì)胞(CXCR4+)呈現(xiàn)向BM (A)、肝臟(B) 和腎臟(C)擴(kuò)散更具侵襲性的能力（蘇木精曙紅X10，抗體染色X20和X10，放大率）。人 ⑶20和CXCR4染色的定量顯示于圖4中。（D)卡普蘭-邁耶曲線顯示相比于空載體細(xì)胞注射的 小鼠在CXCR4+細(xì)胞注射的小鼠中降低的存活率(n=7/組）。P代表P值(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。（E、F) CXCR4過表達(dá)導(dǎo)致當(dāng)相比于CXCR4沉默的WM細(xì)胞(CXCR4-K. D.)(其中觀察到對(duì)BM-MSC降低的 黏著和降低的細(xì)胞增殖)時(shí)，對(duì)原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)增加的麗細(xì)胞黏著和增加 的細(xì)胞增殖。柱代表標(biāo)準(zhǔn)差。DAPI，4'，6_二脒基-2-苯基吲哚;NS，不顯著。
[0024] 圖6顯示感染的WM細(xì)胞中CXCR4敲低的效力。BCWM. 1細(xì)胞用CXCR4-shRNA/GFP (CXCR4 K.D.)或作為對(duì)照的混雜探針（scramble probe)/GFP感染。人CXCR4表達(dá)水平通過 qRT-PCR進(jìn)行評(píng)價(jià)，使用Δ ACt方法，對(duì)GAPDH進(jìn)行均一化。P代表P值。
[0025]圖7顯示CXCR4功能喪失和功能獲得對(duì)WM細(xì)胞黏著特性的影響。BCWM. 1細(xì)胞用 LentiORF/CXCR4 (CXCR4+) (A)或CXCR4 shRNA (CXCR4 K.D.) (B)和各自的混雜探針穩(wěn)定 感染。使用BSA包被的（負(fù)對(duì)照）、聚D-賴氨酸包被的（正對(duì)照）和纖連蛋白包被的孔測(cè)試黏 著。柱代表標(biāo)準(zhǔn)差。
[0026] 圖8顯示誘變?cè)诮?jīng)感染的mi細(xì)胞中的效率和在注射有C1013G/CXCR4-突變的mi細(xì) 胞的小鼠中缺乏腦損害。從經(jīng)感染的BCWM. 1細(xì)胞中分離基因組DNA(gDNA; A)和cDNA (B)。 將空/對(duì)照載體感染的細(xì)胞用作對(duì)照（對(duì)照細(xì)胞）。通過使用等位基因特異性的PCR評(píng)價(jià) C1013G等位基因的檢測(cè)。P代表P值。柱代表標(biāo)準(zhǔn)差。（C)使用Sanger測(cè)序評(píng)價(jià)C1013G突變的 檢測(cè)。（D )將SC I D/取小鼠用攜帶C1013G/CXCR4突變的BCWM. 1細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞靜脈內(nèi)注射。 (E)對(duì)腦進(jìn)行人⑶20和人CXCR4的蘇木精-曙紅免疫組織化學(xué)染色(H.E.)，顯示不存在腫瘤 細(xì)胞浸潤。（提供4X放大率）。
[0027] 圖9顯示CXCR4/C1013G突變對(duì)體內(nèi)擴(kuò)散和麗細(xì)胞存活的影響。攜帶CXCR4/C1013G 變體的WM細(xì)胞具有mRNA水平的改變連同增加的細(xì)胞黏著和細(xì)胞增殖。用攜帶CXCR4/C1013G 變體的WM細(xì)胞靜脈內(nèi)注射的SCID/取小鼠具有(A)BM、（B)淋巴結(jié)、（C)肝臟、（D)肺和(E)腎臟 的明顯損害(X4、X10和20X放大率）。人⑶20和CXCR4染色的定量顯示于圖10中。（F)卡普蘭-邁耶曲線顯示相比于對(duì)照載體細(xì)胞注射的小鼠（右圖），C1013G/CXCR4細(xì)胞注射的小鼠（左 圖）中降低的存活率(n=7/組）。對(duì)照載體細(xì)胞注射的小鼠在第37、48和62天觀察到死亡。P代 表P值(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。
[0028] 圖10顯示從注射有C1013G/CXCR4突變的mi細(xì)胞的小鼠收獲的組織中的人⑶20和 CXCR4表達(dá)的定量。將SCID/取小鼠用攜帶C1013G/CXCR4變體的BCWM.1細(xì)胞或空/對(duì)照載體 感染的細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞)靜脈內(nèi)注射。3周后，將小鼠安樂死并收獲器官。對(duì)股骨BM、淋巴結(jié)、 肝臟、肺和腎臟進(jìn)行對(duì)人CD20和人CXCR4的蘇木精-曙紅免疫組織化學(xué)染色（Nikon， Melville, NY)。進(jìn)行CD20和CXCR4染色的定量（NIS Elements軟件，Nikon, Melville, NY) J代表P值。使用T檢驗(yàn)來分析股骨、肝臟、腎臟和肺，并使用Anova檢驗(yàn)來分析淋巴結(jié)。 [0029]圖11顯示CXCR4/C1013G突變對(duì)體內(nèi)WM細(xì)胞的黏著和增殖的影響。在靜脈內(nèi)注射有 C1013G/CXCR4-WM細(xì)胞的SCID/Bg小鼠中，C1013G/CXCR4變體單獨(dú)或在BM-MSC背景下增加 WM 細(xì)胞的黏著(A)和增殖化）。（(：、0)(：10136/^乂0?4變體單獨(dú)或在81-13(：背景中增加11(^1細(xì)胞 的黏著和增殖。將空/對(duì)照載體感染的細(xì)胞用作對(duì)照。柱代表標(biāo)準(zhǔn)差。P代表P值。
[0030] 圖12顯示C1013G/CXCR4突變的細(xì)胞在基因水平上與對(duì)照細(xì)胞不同。（A)在C1013G/ CXCR4突變的細(xì)胞相比于對(duì)照載體感染的細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞）中腫瘤侵襲性、細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞 凋亡和致癌標(biāo)記基因 （oncogenic signature gene)的基因集合富集分析(GSEA)富集曲線。 所繪制的曲線顯示富集評(píng)分并反映每一基因（垂直線)表示在所排列的基因列表的頂部或 底部的程度。熱圖表示在突變細(xì)胞中和相比于對(duì)照細(xì)胞特異性富集的基因的相對(duì)豐度(左 至右）。所有基因集合在C1013G/CXCR4突變細(xì)胞中富集，并且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)始終〈0.25。 分析的每一基因集合顯示標(biāo)準(zhǔn)化的富集評(píng)分(NES)和FDRJC)在C1013G/CXCR4突變細(xì)胞相 比于對(duì)照載體感染的細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞）中，表3中列出的上調(diào)基因的GSEA富集曲線。相比于對(duì) 照細(xì)胞，相同基因在突變細(xì)胞中富集。
[0031] 圖13顯示攜帶C1013G/CXCR4體細(xì)胞變體的WM細(xì)胞呈現(xiàn)藥物抗性。（A)分別在 C1013G/CXCR4突變細(xì)胞和對(duì)照載體感染的細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞）中對(duì)藥物標(biāo)記基因的多藥抗性 和應(yīng)答的GSEA富集曲線。所繪制的曲線顯示富集評(píng)分并反映每一基因（垂直線)表示在所排 列的基因列表的頂部或底部的程度。熱圖表示相比于對(duì)照細(xì)胞在突變細(xì)胞中特異性富集的 基因的相對(duì)豐度（左至右）。認(rèn)為基因集合是富集的，且H)R始終為〈0.25。分析的每一基因 集合顯示標(biāo)準(zhǔn)化的富集評(píng)分(NES)和roRXB-F)將C1013G/CXCR4-WM細(xì)胞系(BCWM1; MWCL1) 或?qū)φ蛰d體感染的細(xì)胞(對(duì)照)暴露于依維莫司、依魯替尼、idelalisib、硼替佐米、和卡非 佐米持續(xù)48小時(shí)。通過3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑來測(cè)定細(xì)胞毒性。 [0032] 圖14顯示BMS-936564體外對(duì)麗細(xì)胞的迀移的影響。使用經(jīng)孔（transwell)迀移測(cè) 定來測(cè)試WM細(xì)胞系(BCWM. 1; MWCL. 1)其迀移特性。將細(xì)胞暴露于漸增濃度的BMS-936564并 在5小時(shí)后測(cè)定迀移。在存在原代麗BM-MSCs (A)的情況下或存在SDF-Ια (B)的情況下進(jìn) 行經(jīng)孔迀移測(cè)定。在兩種情況下，觀察到WM細(xì)胞迀移的BMS-936564依賴性的抑制。
[0033] 圖15顯示BMS-936564體外對(duì)WM細(xì)胞的黏著和增殖的影響。（A)WM細(xì)胞系用BMS- 636564處理4小時(shí)并隨后測(cè)試對(duì)原代麗BM-MSC的黏著。評(píng)價(jià)2小時(shí)后的黏著顯示麗細(xì)胞黏 著的BMS-936564依賴性的抑制。（B、C)麗細(xì)胞系(BCWM. 1; MWCL. 1)在存在或不存在原代WM BMMSC的情況下用對(duì)照培養(yǎng)基和用BMS-936564培養(yǎng)48小時(shí)。使用[3H]-胸苷攝入測(cè)定評(píng)估細(xì) 胞增殖。柱代表標(biāo)準(zhǔn)差。P代表P值。所有數(shù)據(jù)表示三次實(shí)驗(yàn)的平均值（± sd)。將CXCR4拮抗 劑、AMD3110 (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)用作對(duì)照。
[0034] 圖16顯示BMS-936564對(duì)WM細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的影響。將BCWM. 1細(xì)胞在存在或不存在原 代WM BM-MSC的情況下暴露于BMS-936564持續(xù)6小時(shí)。隨后收獲BCWM.1細(xì)胞并將細(xì)胞裂解物 進(jìn)行使用抗磷酸(P) -ERK1/2、抗ERK1/2、抗p-Akt、抗Akt、抗p-SRC和抗SRC抗體的蛋白質(zhì)印 跡分析。將在不存在WM BM-MSC的情況下培養(yǎng)的BCWM. 1細(xì)胞用作對(duì)照。柱代表標(biāo)準(zhǔn)差。
[0035]圖17顯示對(duì)照抗體不影響體外麗細(xì)胞系的黏著(A)或迀移(B)。
[0036] 圖18顯示W(wǎng)M細(xì)胞中BMS-936564對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響。將BCWM. 1細(xì)胞暴露于 BMS-936564持續(xù)14小時(shí)。隨后收獲全細(xì)胞裂解物并進(jìn)行使用抗胱天蛋白酶9、抗PARP、抗ρ-β 連環(huán)蛋白、抗β-連環(huán)蛋白、抗p-GSK30、和抗微管蛋白抗體的蛋白質(zhì)印跡分析。
[0037] 圖19顯示體內(nèi)BMS-936564靶向WM細(xì)胞中的C1013G/CXCR4突變的細(xì)胞。（A-E)BMS- 936564抑制體內(nèi)C1013G/CXCR4突變的mi細(xì)胞的擴(kuò)散。相比于同種型對(duì)照處理的小鼠（未處 理的），人⑶20和CXCR4染色在從用BMS-936564處理的小鼠移植的組織中顯著降低。P代表P 值。
[0038] 圖20顯示體內(nèi)BMS-936564對(duì)WM細(xì)胞中C1013G/CXCR4-突變的細(xì)胞的影響的代表性 組織化學(xué)圖像。將SCID/取小鼠用攜帶C1013G/CXCR4變體的BCWM.1細(xì)胞或空/對(duì)照載體感染 的細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞)靜脈內(nèi)注射。用BMS-936564或?qū)φ湛贵w處理小鼠（10 mg/kg，腹膜內(nèi) 地；x3/4/周；小鼠：5/組）。3周后，將小鼠安樂死并收獲器官。對(duì)股骨BM(A)、肝臟(B)、腎臟 (C)、肺（D)和淋巴結(jié)（E)進(jìn)行人⑶20和CXCR4的蘇木精-曙紅免疫組織化學(xué)染色（Nikon, Melville, NY;顯示4X、10X或20X放大率）。
[0039] 圖21顯示在BM背景下BMS-936564靶向WM細(xì)胞中的C1013G/CXCR4突變的細(xì)胞。使用 經(jīng)孔(廿&118冊(cè)11)迀移測(cè)定來測(cè)試(：10136/^乂〇?4-感染的隊(duì)￥1.1細(xì)胞其迀移特性。將細(xì)胞暴 露于漸增濃度的BMS-936564并在5小時(shí)后測(cè)定迀移。在存在原代WM BM-MSCs (A)或SDF-la (B)的情況下進(jìn)行經(jīng)孔迀移測(cè)定。在兩種情況下，觀察到WM細(xì)胞迀移的BMS-936564依賴性的 抑制。（C)將C1013G/CXCR4-感染的BCWM.1細(xì)胞用BMS-636564處理4小時(shí)并隨后測(cè)試對(duì)原代 麗BM-MSC的黏著。評(píng)價(jià)2小時(shí)后的黏著顯示麗細(xì)胞黏著的BMS-936564依賴性的抑制。（D)將 C1013G/CXCR4-感染的BCWM. 1細(xì)胞在存在或不存在原代麗BM-MSC的情況下用對(duì)照培養(yǎng)基 和用BMS-936564培養(yǎng)48小時(shí)。使用[3H]-胸苷攝入測(cè)定評(píng)估細(xì)胞增殖。柱代表標(biāo)準(zhǔn)差。P代表 P值。所有數(shù)據(jù)表示三次實(shí)驗(yàn)的平均值（土 sd)。柱代表標(biāo)準(zhǔn)差。
[0040] 圖22顯示C1013G/CXCR4-WM細(xì)胞中BMS-936564對(duì)存活和細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)蛋白的 影響。將C1013G/CXCR4-突變的細(xì)胞在存在或不存在BMS-936564的情況下培養(yǎng)6小時(shí)，顯示 抑制磷酸化)4服4狀、？41^^1^、？-3代。類似地，將細(xì)胞暴露于化合物14小時(shí)，并觀察細(xì) 胞凋亡相關(guān)途徑的誘導(dǎo)(p-GSK3i3、p-i3-連環(huán)蛋白、PARP和胱天蛋白酶-9)。
[0041 ] 圖23顯示體內(nèi)BMS-936564抑制WM返回并在體內(nèi)和體外協(xié)同增強(qiáng)對(duì)硼替佐米的WM 化學(xué)敏感性。（A、B)將BCWM. l-mCherry+細(xì)胞靜脈內(nèi)注射到SID/Bg小鼠。將小鼠用對(duì)照抗體 或BMS-936564 (10 mg/kg，腹膜內(nèi)；x3/4/周）；硼替佐米（0.5mg/kg，腹膜內(nèi)x2/周）；或 BMS-936564 +硼替佐米(如上相同劑量，x2/周)處理。在研究結(jié)束時(shí)收獲BM細(xì)胞并使用熒 光板讀數(shù)器評(píng)價(jià)。對(duì)照旨在為從對(duì)照抗體處理的小鼠的BM中鑒定的mCherry+細(xì)胞的數(shù)目。 在研究結(jié)束時(shí)收集血清。使用人IgM ELISA試劑盒評(píng)價(jià)血清IgM分泌。（C、D)單獨(dú)地或在組合 方案中，將WM細(xì)胞系(BWM. 1; MWCL. 1)暴露于BMS-936564或硼替佐米持續(xù)48小時(shí)。通過MTT 進(jìn)行細(xì)胞毒性。通過使用Calcusyn軟件評(píng)價(jià)協(xié)同作用：顯示了BMS-936564和硼替佐米的組 合的等效應(yīng)圖、復(fù)合指數(shù)(c. I.)和受影響的部分(fractions affected，F(xiàn).A.)。柱代表標(biāo)準(zhǔn) 差。
[0042]發(fā)明詳述 本公開涉及使用特異性結(jié)合表達(dá)在細(xì)胞表面上的天然人CXCR4的單克隆抗體來調(diào)節(jié)患 有華氏巨球蛋白血癥的患者中的CXCR4活性或另外治療所述患者的方法。這些方法特別可 用于在CXCR4基因中攜帶激活的C1013G突變的mi患者。在某些實(shí)施方案中，將抗CXCR4抗體 作為單一治療或作為聯(lián)合治療（例如與mT〇R、BTK和/或PI3K抑制劑組合）的部分作為第一 ("前"）線治療例如初始或第一治療來施用。在其他實(shí)施方案中，將抗CXCR4抗體作為第二或 第三線治療施用，例如在用相同或一種或多種不同療法的初始治療后，包括復(fù)發(fā)后和/或其 中第一治療已失敗。因此，在某些實(shí)施方案中，在另一抗WM劑例如mT0R、BTK和/或PI3K抑制 劑治療失敗后施用抗CXCR4抗體。
[0043] 定義 為了使本公開可以更易于理解，首先定義某些術(shù)語。如本申請(qǐng)中所用，除非本文另外明 確提供，以下術(shù)語的每一個(gè)應(yīng)具有下文所示含義。另外的定義描述于整個(gè)本申請(qǐng)。
[0044] "施用"指使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法和遞送系統(tǒng)的任何向主體身體引 入包含治療劑的組合物。施用本發(fā)明的抗體的優(yōu)選途徑包括靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、脊 椎或其他腸胃外施用途徑，例如，通過注射或輸注。如本文所用的短語"腸胃外施用"意指除 了腸內(nèi)和局部施用之外的施用模式。施用還可以例如一次、多次、和/或經(jīng)一個(gè)或多個(gè)延長 的周期來進(jìn)行。
[0045] "抗體"（Ab)應(yīng)包括但不限于特異性結(jié)合抗原并包含通過二硫鍵相互連接的至少 兩個(gè)重(H)鏈和兩個(gè)輕(L)鏈的糖蛋白免疫球蛋白、或其抗原結(jié)合部分。每一Η鏈包含重鏈可 變區(qū)（本文縮寫為Vh)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域C H1、CH2和CH3。每一輕鏈包 含輕鏈可變區(qū)（本文縮寫為I)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域C^Vh和V L區(qū)可以 進(jìn)一步細(xì)分為稱為互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的高變的區(qū)域，其散布于由稱為框架區(qū)(FR)的更 保守的區(qū)域。每一V H和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR構(gòu)成，從氨基端向羧基端按以下順序排列:FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w 的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì) 胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)的結(jié)合。
[0046] 抗體通常以高親和力特異性結(jié)合其同源抗原，通過Κ^-ΠΓ11 ΙΓ1或更低的解離常 數(shù)(KD)來反映。任何大于約10-4 if1的KD通常被認(rèn)為表明非特異性結(jié)合。如本文所用，"特異 性結(jié)合"抗原的抗體指以高親和力結(jié)合抗原和實(shí)質(zhì)上相同的抗原但不以高親和力結(jié)合不相 關(guān)抗原的抗體，所述高親和力意指具有約10- 7 Μ或更低、優(yōu)選約10-8 Μ或更低、更優(yōu)選約5 X 10-9 Μ或更低、甚至更優(yōu)選約5 X 10_1() Μ或更低、且最優(yōu)選約10_9 Μ至約10_η Μ或更低的KD。 如果抗原展示出與給定抗原高度的序列同一性，例如，如果其展示出與給定抗原序列至少 80 %、至少90%、優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少97 %、或甚至更優(yōu)選至少99的序列同一性，則所 述抗原與給定抗原是"實(shí)質(zhì)上相同的"。借助于實(shí)例，特異性結(jié)合人CXCR4的抗體還可以具有 與來自某些靈長類動(dòng)物物種的CXCR4抗原的交叉反應(yīng)性，但不與來自某些嚙齒類動(dòng)物物種 的CXCR4抗原或與CXCR4之外的抗原例如人ro-Ι抗原交叉反應(yīng)。
[0047] 免疫球蛋白可以來源于任何通常已知的同種型，包括但不限于IgA，分泌型IgA、 IgG和IgM。IgG亞類對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是熟知的且包括但不限于人IgGl、IgG2、IgG3和 IgG4Z'同種型"指通過重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別（例如IgM或IgGl)。"抗體"包括例如 天然存在的和非天然存在的抗體;單克隆和多克隆抗體;嵌合和人源化抗體;人或非人抗 體;全合成抗體;和單鏈抗體。非人抗體可以通過重組方法來降低其在人中的免疫原性而人 源化。
[0048] 未明確陳述時(shí)，且除非上下文另外指出，否則術(shù)語"抗體"還包括任何上述免疫球 蛋白的抗原結(jié)合部分。抗體的"抗原結(jié)合部分"或"抗原結(jié)合片段"指保留特異性結(jié)合由完整 抗體結(jié)合的抗原的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。涵蓋在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"中的 結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab、F(at/ )2 Fd、Fv和單鏈可變片段(scFv)、二價(jià)或二價(jià)(divalent or biva 1 ent) scFv、雙抗體或其他抗體多聚體(例如三價(jià)的三抗體或四價(jià)的四抗體）、微抗 體、和甚至分離的CDR，其可以展示抗原結(jié)合功能?？贵w的所有上述蛋白水解和工程化的片 段及相關(guān)變體(進(jìn)一步細(xì)節(jié)參見Hollinger等人，2005; Olafsen等人，2010)均涵蓋在 術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"中。
[0049] 術(shù)語"單克隆抗體"（〃mAb〃)指單一分子組成的抗體分子的制備物，即，其一級(jí)序列 基本上相同且展示出對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力的抗體分子。單克隆抗體可以 通過雜交瘤、重組、轉(zhuǎn)基因或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他技術(shù)來產(chǎn)生。
[0050] "人"抗體(HuMAb)指具有其中框架區(qū)和CDR區(qū)域均來源于人種系免疫球蛋白序列 的可變區(qū)的抗體。此外，如果抗體含有恒定區(qū)，則恒定區(qū)也來源于人種系免疫球蛋白序列。 本發(fā)明的人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外 隨機(jī)或位點(diǎn)定向誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變）。然而，如本文所用，術(shù)語"人抗 體"并不旨在包括這樣的抗體，其中來源于另一哺乳動(dòng)物物種諸如小鼠的種系的CDR序列已 經(jīng)連接至人框架序列上。術(shù)語"人"抗體和"完全人"抗體同義使用。
[0051] "人源化"抗體指這樣的抗體，所述抗體中一些、大部分或所有非人抗體的CDR結(jié)構(gòu) 域外面的氨基酸被來源于人免疫球蛋白的相應(yīng)氨基酸所替代。在抗體的人源化形式的一個(gè) 實(shí)施方案中，CDR結(jié)構(gòu)域外部的一些、大部分或所有氨基酸已被來自人免疫球蛋白的氨基酸 所替代，而一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)的一些、大部分或所有氨基酸沒有改變。氨基酸的小的添加、 缺失、插入、取代或修改是容許的，只要它們沒有消除抗體結(jié)合特定抗原的能力。"人源化" 抗體保留與原始抗體類似的抗原特異性。
[0052] "嵌合抗體"指這樣的抗體，其中可變區(qū)來源于一個(gè)物種且恒定區(qū)來源于另一物 種，諸如其中可變區(qū)來源于小鼠抗體且恒定區(qū)來源于人抗體的抗體。
[0053] "癌癥"指特征在于體內(nèi)異常細(xì)胞不受控的生長的各種疾病的寬范圍的組。不受調(diào) 節(jié)的細(xì)胞分裂和生長分裂和生長導(dǎo)致形成侵入鄰近組織的惡性腫瘤并還可以經(jīng)淋巴系統(tǒng) 或血流轉(zhuǎn)移至身體的遠(yuǎn)端部分。癌癥包括實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤。
[0054]實(shí)體瘤是由血液、BM或淋巴細(xì)胞外的身體組織細(xì)胞的異常生長形成的贅生物(細(xì) 胞的新生長)或損傷(解剖結(jié)構(gòu)的受損或生理機(jī)能紊亂）。其由異常的細(xì)胞團(tuán)塊組成，其可能 來源于不同的組織類型諸如肝、結(jié)腸、乳腺或肺，且其初始在其細(xì)胞起源的器官中生長。然 而，實(shí)體瘤可以經(jīng)在疾病的晚期的轉(zhuǎn)移性腫瘤生長而傳播至其他器官。
[0055]血液惡性腫瘤是影響血液、BM、脾臟和/或淋巴結(jié)的癌癥類型，并包括淋巴瘤、白細(xì) 胞、骨髓瘤和淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤。血液惡性腫瘤可以來源于兩種主要血液細(xì)胞譜系即骨髓 和淋巴樣細(xì)胞系的任一者。骨髓細(xì)胞系一般產(chǎn)生粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大 細(xì)胞，而淋巴樣細(xì)胞系產(chǎn)生B、T、NK和漿細(xì)胞。淋巴瘤(例如，霍奇金氏淋巴瘤）、淋巴細(xì)胞性 白血病和骨髓瘤來源于淋巴樣細(xì)胞系，而急性和慢性髓細(xì)胞性白血病(AML、CML)、骨髓增生 異常綜合征和骨髓增生性疾病是骨髓起源。華氏巨球蛋白血癥(WM)是B細(xì)胞淋巴瘤的實(shí)例， 且在本文顯示為對(duì)用抗CXCR4抗體治療是順從的。
[0056] 術(shù)語"CXCR4"（ "C-X-C"趨化因子受體4)包括變體、同工型、同源物、直向同源物和 側(cè)向同源物。例如，對(duì)于CXCR4特異性的抗體可以在某些情況下與來自人以外的物種的 CXCR4交叉反應(yīng)。在其他實(shí)施方案中，對(duì)于人CXCR4特異性的抗體可以對(duì)于人CXCR4是完全特 異性的且可以不展示物種或其他類型的交叉反應(yīng)性。術(shù)語"人CXCR4"指人序列CXCR4,諸如 具有GENBANK?檢索號(hào)P61073的人CXCR4的完整氨基酸序列（SEQ ID N0:51)<XXCR4還在本 領(lǐng)域已知為例如LESTR、融合素或CD184。人CXCR4序列可以與SEQ ID NO: 51的人CXCR4的不 同之處在于具有例如保守突變或非保守區(qū)域中的突變，且CXCR4具有與SEQ ID N0: 51的人 CXCR4實(shí)質(zhì)上相同的生物功能。
[0057] "表達(dá)CXCR4的癌癥"或"CXCR4+癌癥"是這樣的癌癥，其中表征該癌癥的惡性腫瘤 細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)CXCR4,優(yōu)選表達(dá)高水平的CXCR4XXCR4基因中C1013G突變(其之前 已與WHIM綜合征相關(guān))在本文公開為存在于28%的WM患者中但在其他B細(xì)胞淋巴瘤中不存 在或僅以7%存在。C1013G/CXCR4-相關(guān)的WM指其中存在C1013G突變的WM。
[0058] "主體"包括人或任何非人動(dòng)物諸如非人靈長類動(dòng)物(例如，猴）、犬、兔、嚙齒類動(dòng) 物或雞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，主體是人癌癥患者諸如WM患者。術(shù)語"主體"、"患者"和"個(gè) 體"本文可以互換使用。
[0059] 藥物或治療劑諸如抗CXCR4抗體的"治療有效量"或"治療有效劑量"是這樣的藥物 的任何量，當(dāng)單獨(dú)或與另一治療劑組合使用時(shí)，所述量促進(jìn)由疾病癥狀嚴(yán)重度降低所證明 的疾病消退、無疾病癥狀的時(shí)期的頻率和持續(xù)時(shí)間的增加、或防止由于疾病折磨的損傷或 失能。藥物的治療有效量或劑量包括"預(yù)防有效量"或"預(yù)防有效劑量"，其是藥物的任何量， 當(dāng)單獨(dú)或與另一治療劑組合施用于處于發(fā)生疾病或患有疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)的主體時(shí)，所述量 抑制疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)。治療劑促進(jìn)疾病消退的能力可以使用從業(yè)醫(yī)師已知的多種方法來 評(píng)價(jià)，諸如在臨床試驗(yàn)過程中在人主體中，在預(yù)測(cè)在人中的效力的動(dòng)物模型系統(tǒng)中，或通過 測(cè)定體外測(cè)定中藥劑的活性。
[0060] 此外，關(guān)于治療的術(shù)語"有效的"和"有效性"包括藥理有效性和生理安全性。藥理 有效性指藥物促進(jìn)患者中癌癥消退的能力。生理安全性指由于施用藥物導(dǎo)致的毒性水平、 或其他細(xì)胞、器官和/或生物體水平的不利生理效應(yīng)(不良作用）。
[0061 ]主體的"治療"或"療法"指向主體進(jìn)行的任何類型的干預(yù)或處理，或?qū)χ黧w施用活 性藥劑，目標(biāo)在于逆轉(zhuǎn)、減輕、改善、抑制、減緩或防止與疾病相關(guān)的癥狀、并發(fā)癥、病況或生 物化學(xué)指標(biāo)的起始、進(jìn)展、發(fā)生、嚴(yán)重性或復(fù)發(fā)。
[0062]使用替代物(例如"或"）應(yīng)理解為意指替代物中的任一者、兩者或其任何組合。如 本文所用，不定冠詞"一個(gè)/種(a或an)"應(yīng)理解為指任何記述或列舉組分的"一個(gè)/種或多 個(gè)/種"。
[0063]術(shù)語"約"、"基本上"或"基本上包含"指在如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定的具體值 或組成的可接受的誤差范圍內(nèi)的值或組成，其將部分取決于該值或組成如何測(cè)量或測(cè)定， 即，測(cè)量系統(tǒng)的限制。例如，"約"、"基本上"或"基本上包含"可以意指在1之內(nèi)或在多于1標(biāo) 準(zhǔn)差/本領(lǐng)域?qū)嵺`之內(nèi)?？蛇x地，"約"、"基本上"或"基本上包含"可以意指正負(fù)20%的范圍， 更通常指正負(fù)10%的范圍。此外，具體關(guān)于生物系統(tǒng)或方法，術(shù)語可以意指高至值的一個(gè)數(shù) 量級(jí)或高至值的5倍。當(dāng)在申請(qǐng)和權(quán)利要求中提供具體值或組成時(shí)，除非另有說明，否則 "約"、"基本上"或"基本上包含"的含義應(yīng)假定在具體值或組成的可接受的誤差范圍內(nèi)。 [0064]如本文所述，任何濃度范圍、百分比范圍、比例范圍或整數(shù)范圍應(yīng)理解為包括在所 述范圍內(nèi)的任何整數(shù)的值，且當(dāng)合適時(shí)，其分?jǐn)?shù)(諸如整數(shù)的十分之一和百分之一），除非另 有說明。
[0065] 本公開的各個(gè)方面在以下子部分中進(jìn)一步詳述。
[0066] 治療性抗CXCR4抗體 用于本治療方法的示例性抗CXCR4抗體(包括人單克隆抗體?7(111〇〇卯1咖&13;813-936564; MDX-1338)、F9、D1和E2)的產(chǎn)生詳細(xì)描述于W0 2008/060367。使用這些抗體來治療 血液惡性腫瘤的方法還描述于W0 2008/060367和W0 2013/071068。本公開的抗CXCR4抗體 可以是嵌合的、人源化的或優(yōu)選地全人抗體，且特征在于特定的功能特征或特性。例如，抗 體結(jié)合表達(dá)于細(xì)胞表面上的天然人CXCR4。優(yōu)選地，本公開的抗體以高親和力結(jié)合CXCR4，例 如以1 X 10-8 Μ或更低的KD。本公開的抗CXCR4抗體優(yōu)選展示對(duì)于治療性應(yīng)用是期望的以下 特征的一種或多種： (a) 結(jié)合表達(dá)于細(xì)胞表面上的人CXCR4; (b) 抑制SDF-1與CXCR4的結(jié)合； (c )抑制表達(dá)CXCR4細(xì)胞中的SDF-1誘導(dǎo)的鈣流； (d )抑制表達(dá)CXCR4的細(xì)胞的SDF-1誘導(dǎo)的迀移； (e) 抑制通過人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)管形成； (f) 以1 X 10-8 Μ或更低的KD結(jié)合人CXCR4; (g) 誘導(dǎo)表達(dá)CXCR4的細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡； (h) 抑制體外CXCR4+腫瘤細(xì)胞的增殖； (i )抑制CXCR4+腫瘤細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)體內(nèi)CXCR4+腫瘤細(xì)胞凋亡； (j )抑制CXCR4+腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移;和 (k)增加攜帶CXCR4+腫瘤主體的存活時(shí)間。
[0067] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開的抗CXCR4抗體以1 X 10-8 Μ或更低的KD結(jié)合人 CXCR4，誘導(dǎo)表達(dá)CXCR4細(xì)胞中的凋亡，并展示上文列出的其他特性中的至少五種。在更優(yōu)選 的實(shí)施方案中，本公開的抗CXCR4抗體展示所有上文列出的特性。
[0068] 在某些實(shí)施方案中，用于本公開的方法的抗CXCR4抗體以5 X 10_8 Μ或更低的KD結(jié) 合人CXCR4,以2 X 10-8 Μ或更低、5 X 10-9 Μ或更低、4 X 10-9 Μ或更低、3 X 10-9 Μ或更低、 或2 X 10_9 Μ或更低的KD結(jié)合人CXCR4。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體是ulocuplumab (BMS-936564)。
[0069] 在一方面，本公開的抗CXCR4抗體包含F(xiàn)7、F9、D1或E2的重鏈和輕鏈CDRl's、CDR2's 和CDR3's，或其組合。F7、F9、D1和E2的Vh CDRl's的氨基酸序列分別顯示于SEQIDN0s.l-4。F7、F9、Dl和E2的VHCDR2's的氨基酸序列分別顯示于SEQIDN0s.5-8。F7、F9、Dl和E2的VH CDR3's的氨基酸序列分別顯示于SEQIDN0s.9-12。F7、F9、Dl和E2的VkCDRΓs的氨基酸序 列分別顯示于SEQIDN0s.l3-16。F7、F9、Dl和E2的VkCDR2's的氨基酸序列分別顯示于SEQ IDN0s.l7-20。F7、F9、Dl和E2的VkCDR3's的氨基酸序列分別顯示于SEQIDN0s.21-24。F7 (ulocuplumab)人單克隆抗體的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)和6個(gè)⑶R的氨基酸序列還顯示于 圖1中。整個(gè)本公開中鑒定的⑶R區(qū)使用Kabat系統(tǒng)進(jìn)行描述（Kabat等人，1991)。
[0070]在另一方面，本公開的抗CXCR4抗體包含： (a) 具有SEQ ID N0: 25或41中描述的序列的重鏈可變區(qū)中的CDRUCDR2和CDR3結(jié)構(gòu) 域，和具有SEQ ID N0: 29或45中描述的序列的輕鏈可變區(qū)中的⑶R1、⑶R2和⑶R3結(jié)構(gòu)域； (b) 具有SEQ ID N0: 26或42中描述的序列的重鏈可變區(qū)中的CDRUCDR2和CDR3結(jié)構(gòu) 域，和具有SEQ ID N0: 30或46中描述的序列的輕鏈可變區(qū)中的⑶R1、⑶R2和⑶R3結(jié)構(gòu)域； (c) 具有SEQ ID N0: 27或43中描述的序列的重鏈可變區(qū)中的CDRUCDR2和CDR3結(jié)構(gòu) 域，和具有SEQ ID N0: 31或47中描述的序列的輕鏈可變區(qū)中的⑶R1、CDR2和⑶R3結(jié)構(gòu)域； 或 (d) 具有SEQ ID N0: 28或44中描述的序列的重鏈可變區(qū)中的CDRUCDR2和CDR3結(jié)構(gòu) 域，和具有SEQ ID N0: 32或48中描述的序列的輕鏈可變區(qū)中的⑶R1、⑶R2和⑶R3結(jié)構(gòu)域。 [0071 ]在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開的抗CXCR4抗體包含： (a) 包含具有描述于SEQ ID NO: 1的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可 變區(qū)CDR1;包含具有描述于SEQ ID N0: 5的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈 可變區(qū)CDR2;包含具有描述于SEQ ID N0:9的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的重 鏈可變區(qū)CDR3;包含具有描述于SEQ ID N0:13的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的 輕鏈可變區(qū)CDR1;包含具有描述于SEQ ID N0:17的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸 的輕鏈可變區(qū)⑶R2;和包含具有描述于SEQ ID N0: 21的序列的連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可 變區(qū)CDR3; (b) 包含具有描述于SEQ ID N0: 2的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可 變區(qū)CDR1;包含具有描述于SEQ ID N0:6的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈 可變區(qū)CDR2;包含具有描述于SEQ ID N0:10的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的重 鏈可變區(qū)CDR3;包含具有描述于SEQ ID N0:14的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的 輕鏈可變區(qū)CDR1;包含具有描述于SEQ ID N0:18的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸 的輕鏈可變區(qū)⑶R2;和包含具有描述于SEQ ID N0: 22的序列的連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可 變區(qū)CDR3; (c) 包含具有描述于SEQ ID N0:3的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可 變區(qū)CDR1;包含具有描述于SEQ ID N0:7的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈 可變區(qū)CDR2;包含具有描述于SEQ ID N0:11的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的重 鏈可變區(qū)CDR3;包含具有描述于SEQ ID N0:15的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的 輕鏈可變區(qū)CDR1;包含具有描述于SEQ ID N0:19的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸 的輕鏈可變區(qū)⑶R2;和包含具有描述于SEQ ID N0: 23的序列的連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可 變區(qū)CDR3;或 (d) 包含具有描述于SEQ ID N0:4的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可 變區(qū)CDR1;包含具有描述于SEQ ID N0:8的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈 可變區(qū)CDR2;包含具有描述于SEQ ID N0:12的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的重 鏈可變區(qū)CDR3;包含具有描述于SEQ ID NO: 16的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸的 輕鏈可變區(qū)CDR1;包含具有描述于SEQ ID NO:20的序列或其保守更改的連續(xù)連接的氨基酸 的輕鏈可變區(qū)⑶R2;和包含具有描述于SEQ ID NO: 24的序列的連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可 變區(qū)CDR3。
[0072]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分包含:包含具有描述于SEQ ID NO: 1的序列的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可變區(qū)⑶R1，包含具有描述于SEQ ID N0:5的序 列的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可變區(qū)⑶R2,包含具有描述于SEQ ID NO:9的序列的連續(xù)連 接的氨基酸的重鏈可變區(qū)CDR3,包含具有描述于SEQ ID N0:13的序列的連續(xù)連接的氨基酸 的輕鏈可變區(qū)⑶R1，包含具有描述于SEQ ID N0:17的序列的連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可變 區(qū)⑶R2,和包含具有描述于SEQ ID N0:21的序列的連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可變區(qū)⑶R3。 [0073] F7的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列顯示于圖1A和分別SEQ ID NOs. 33和25 中。F7的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列顯示于圖1B和分別SEQ ID NOs. 37和29中。使 用⑶R區(qū)確定的Kabat系統(tǒng)分析F7 VH序列產(chǎn)生描繪如圖1A和分別SEQ ID N0s:l、5和9中所 述的重鏈CDRl、CDR2和CD3區(qū)，以及如圖lB和分別SEQIDN0s:13、17和21中所示的輕鏈 CDRUCDR2 和 CD3 區(qū)。
[0074] F9的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列顯示于分別SEQ ID NOs. 34和26中，且對(duì) 于F9輕鏈可變區(qū)顯示于分別SEQ ID NOs. 38和30中。序列F9重鏈CDRUCDR2和CD3區(qū)如分別 SEQ ID NOs. 2、6和10中所示，且F9輕鏈CDRUCDR2和CD3序列如分別SEQ ID NOs. 14、18和 22中所示。
[0075] D1的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列顯示于分別SEQ ID N0:35和27中，且對(duì)于 D1輕鏈可變區(qū)顯示于分別SEQ ID NOs. 39和31中。序列D1重鏈CDR1、CDR2和CD3區(qū)如分別 SEQ ID NOs. 3、7和11中所示，且F9輕鏈CDRUCDR2和CD3序列如分別SEQ ID NOs. 15、19和 23中所示。
[0076] E2的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列顯示于分別SEQ ID N0:36和28中，且對(duì)于 E2輕鏈可變區(qū)顯示于分別SEQ ID NOs. 40和32中。序列E2重鏈CDR1、CDR2和CD3區(qū)如分別 SEQ ID NOs. 4、8和12中所示，且F9輕鏈CDRUCDR2和CD3序列如分別SEQ ID NOs. 16、20和 24中所示。
[0077]另外，產(chǎn)生F7、F9、D1和E2的可選形式，其中某些框架殘基被種系殘基所取代，并將 其在本文稱為F7GL、F9GL、D1GL和E2GL。F7GL、F9GL、D1GL和E2GL的VH氨基酸序列顯示于分別 SEQIDN0s.41、42、43、和44。F7GL、F9GL、DlGL和E2GL的VL氨基酸序列顯示于分別SEQID N0s.45、46、47jP48。
[0078]在一方面，用于本公開的方法的抗CXCR4抗體與以下中的任何交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 CXCR4:mAb F7 (ulocuplumab;具有分別如SEQ ID NOs: 25和29中所示的Vh和Vl序列）、mAb F9 (具有分別如SEQ ID NOs: 26和30中所示的Vh和Vl序列）、mAb D1 (具有分別如SEQ ID NOs: 27和31中所示的Vh和Vl序列）、和mAb E2 (具有分別如SEQ ID NOs: 28和32中所示的 VH和VL序列）。交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CXCR4的抗體結(jié)合CXCR4上相同的表位區(qū)域（即相同或重疊的表 位)。
[0079]在某些實(shí)施方案中，交叉競(jìng)爭(zhēng)性抗CXCR4單克隆抗體包含含有具有來源于如SEQ ID N0: 49中所示的人VH 3-48種系序列的序列的連續(xù)連接的氨基酸的VH區(qū)和/或含有具有 來源于如SEQ ID NO: 50中所示的人VK L15種系序列的序列的連續(xù)連接的氨基酸的VL區(qū)。交 叉競(jìng)爭(zhēng)性抗體可以基于其與ulocuplumab $7)、？9、0142或標(biāo)準(zhǔn)0乂0?4結(jié)合測(cè)定中的任何 其他參考抗CXCR4抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)的能力來鑒定，例如用CEM細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)，其中參考抗 體用FITC標(biāo)記并且評(píng)價(jià)測(cè)試抗體抑制FITC標(biāo)記的參考抗體結(jié)合CEM細(xì)胞的能力。
[0080] 藥物組合物 在另一方面，本公開提供組合物，例如藥物組合物，其包含本公開的單克隆抗體或其抗 原結(jié)合部分(連同藥學(xué)上可接受的載體一起配制)之一或組合。如本文所用，"藥學(xué)上可接受 的載體"包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、涂料、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲 劑等，其是生理學(xué)上可接受的。優(yōu)選地，載體適合于靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腸胃外、脊椎或表皮 施用（例如通過注射或輸注）。本發(fā)明的藥物組合物可以包括一種或多種藥學(xué)上可接受的 鹽、抗氧化劑、含水和不含水載體、和/或輔藥諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。
[0081] 給藥方案可以進(jìn)行調(diào)整以提供最佳的期望應(yīng)答(例如，治療性應(yīng)答或最低不良作 用)。
[0082] 對(duì)于施用人抗CXCR4抗體，劑量范圍為約0.0001-100 mg/kg，優(yōu)選約0.01-約20 mg/kg，且更優(yōu)選0.1-10 mg/kg主體體重。例如，劑量可以為0.1、0.3、1、3、5或1〇11^/1^，且 更優(yōu)選地，〇.3、1、3或10 mg/kg體重。通常將給藥時(shí)間表設(shè)計(jì)以實(shí)現(xiàn)基于抗體的典型藥代動(dòng) 力學(xué)特性產(chǎn)生持續(xù)受體占據(jù)的暴露。示例性治療方案包括每周施用一次、每兩周施用一次、 每三周施用一次、每四周施用一次、每月一次、每3個(gè)月一次或每3-6個(gè)月一次。考慮到IgG4 抗體通常具有2-3周的半衰期，因此本公開的抗CXCR4抗體的優(yōu)選劑量方案包括0.3-20 mg/ kg體重，優(yōu)選1-10 mg/kg體重，經(jīng)靜脈內(nèi)施用，且在高至6周、8周或12周的周期中每7天或14 天給予抗體直至完全應(yīng)答或確認(rèn)的進(jìn)行性疾病。
[0083]劑量和時(shí)間安排可以在療程中改變。例如，本公開的抗CXCR4抗體的給藥方案包括 經(jīng)靜脈內(nèi)（IV)施用的1、3或10 mg/kg體重，且使用以下給藥時(shí)間表之一給予抗體：（i)在高 至6周的周期中每7天；（ii)每兩周持續(xù)高至6個(gè)劑量，隨后每三個(gè)月；（iii)每三周；（iv)l-10 mg/kg體重一次隨后為1 mg/kg體重每2-3周。
[0084]在28%的麗患者中發(fā)現(xiàn)的CIO 13G/CXCR4突變?cè)邴惣?xì)胞中起激活作用，如被顯著的 腫瘤增殖和擴(kuò)散至髓外器官導(dǎo)致疾病進(jìn)展和降低的存活所證實(shí)的。施用抗CXCR4抗體BMS-936564導(dǎo)致在C1013G/CXCR4 WM模型中體內(nèi)顯著的腫瘤減小和髓外擴(kuò)散的消除（參見實(shí)施 例6和7)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，患有C1013G/CXCR4-相關(guān)的麗的患者用包括以下的 治療方案進(jìn)行治療：以在治療攜帶野生型CXCR4基因的WM患者中所施用的劑量的至少兩倍、 至少三倍或至少五倍的劑量，和/或以在治療攜帶野生型CXCR4基因的WM患者中所施用的頻 率的至少兩倍、至少三倍或至少五倍的頻率向患者施用抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分。 [0085]本公開的藥物組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平可以改變，從而獲得這樣的活 性成分的量，其有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)特定患者、組合物和施用模式而言的期望的治療應(yīng)答，而無對(duì) 患者的毒性。所選的劑量水平將取決于多種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括所用的本公開的具體組 合物、或其酯、鹽或酰胺的活性，施用途徑、施用時(shí)間、所用的具體化合物的排泄速率、治療 持續(xù)時(shí)間、與所用的具體組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料，被治療的患者的 年齡、性別、體重、病況、一般健康和早期醫(yī)療史，和醫(yī)療領(lǐng)域熟知的其他因素。本發(fā)明的組 合物可以使用本領(lǐng)域熟知的多種方法的一種或多種經(jīng)一種或多種施用途徑來施用。如本領(lǐng) 域技術(shù)人員將理解的，施用途徑和/或模式將根據(jù)期望的結(jié)果而不同。
[0086]本發(fā)明的用途和方法 本公開提供用于治療患有WM的主體的方法，所述方法包括向主體施用治療有效量的特 異性結(jié)合CXCR4受體并展示對(duì)于治療用途期望的某些功能特性的抗體。
[0087]本公開還提供用于治療患有C1013G/CXCR4-相關(guān)的mi的主體的方法，所述方法包 括向主體施用治療有效量的抗CXCR4抗體。
[0088]已知CXCR4表達(dá)在許多種腫瘤細(xì)胞類型上，涉及腫瘤轉(zhuǎn)移、HIV感染、炎癥病況和血 管發(fā)生或新血管形成（參見例如W0 2008/060367和W0 2013/071068)。因此，本文公開的抗 CXCR4抗體可以用于多種臨床情形中，但本公開關(guān)注這些抗體用于治療癌癥尤其是WM的用 途。
[0089] CXCR4在癌癥中的作用 過表達(dá)CXCR4已證實(shí)在約75%的癌癥中，并且在某些情況下在CXCR4表達(dá)和患者預(yù)后或 存活之間已建立起負(fù)相關(guān)。與CXCR4表達(dá)或CXCR4/CXCL12途徑相關(guān)的癌癥類型的非限制性 實(shí)例包括實(shí)體瘤諸如乳腺癌(Muller等人，2001)、卵巢癌（Scotton等人，2001)、前列腺 癌（Taichman等人，2002)、非小細(xì)胞肺癌（Spano等人，2004)、胰腺癌(Koshiba等人， 2000)、結(jié)腸直腸癌（Zeelenberg等人，2003)、腎癌（Schrader等人，2002)和甲狀腺癌 (Hwang等人，2003)、鼻咽癌(Wang等人，2005)、黑素瘤（Scala等人，2005)、腎細(xì)胞癌 (Staller等人，2003)、成神經(jīng)細(xì)胞瘤(Geminder等人，2001)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(Rempel等 人，2000)、橫紋肌肉瘤(Libura等人，2002)和骨肉瘤(Laverdiere等人，2005)以及血 液惡性腫瘤諸如急性成淋巴細(xì)胞性白血病(Crazzolara等人，2001)、急性髓細(xì)胞樣白血 病(AML) (Mohle 等人，1998; Rombouts 等人，2004)、多發(fā)性骨髓瘤(MM) (Alsayed 等 人，2007; Azab等人，2009)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(Mohle等人，1999; Burger等人， 1999)、慢性髓細(xì)胞樣白血病(Jin等人，2008)，WM (Ngo等人，2008)和非霍奇金氏淋巴 瘤(NHL) (Bertolini 等人，2002; Weng 等人，2003)。
[0090] 另外，該途徑涉及刺激多發(fā)性腫瘤中的轉(zhuǎn)移過程(Murphy，2001)。在臨床研究中， CXCR4已與增加的轉(zhuǎn)移傾向和降低的存活相關(guān)且已鑒定為AML、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、非小細(xì) 胞肺癌、卵巢癌和胰腺癌的預(yù)后指標(biāo)，其中更高的CXCR4表達(dá)與疾病嚴(yán)重性相關(guān)（Spoo等 人，2007; Hiller 等人，2011; Ottaiano 等人，2006; Spano 等人，2004; Jiang 等 人；2006; Marechal 等人，2009)。
[0091] BM-MSC分泌CXCL12 (SDF-1)和與CXCR4相互作用對(duì)于在BM微環(huán)境中返回和維持造 血干細(xì)胞是必需的(Mohle等人，1998)。白血病細(xì)胞表達(dá)高水平的CXCR4,且途徑在白血病 細(xì)胞迀移至BM(其繼而支持它們的生長的存活）中起關(guān)鍵作用。CXCR4對(duì)于轉(zhuǎn)移傳播至器官 諸如其中CXCL12表達(dá)的BM是必需的。共同地，CXCR4在BM中造血干細(xì)胞的返回和保留中起重 要作用并且CXCR4拮抗劑動(dòng)員干細(xì)胞進(jìn)入血流中，如用小分子CXCR4拮抗劑AMD3100 (plerixafor; Mozobil)(其由FDA批準(zhǔn)與用于NHL和MM患者中的自體移植物的粒細(xì)胞-集落 刺激因子組合使用）所證實(shí)的。另一 CXCR4抑制劑AMD3465顯示拮抗CXCL12和間質(zhì)誘導(dǎo)的趨 化作用并抑制白細(xì)胞細(xì)胞中促存活（prosurvi va 1)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的CXCL12誘導(dǎo)的激活 (Zeng等人，2009)。此外，證實(shí)AMD3465單獨(dú)或與粒細(xì)胞-集落刺激因子組合可誘導(dǎo)動(dòng)員 AML細(xì)胞和祖細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)和增強(qiáng)的化學(xué)療法和索拉非尼的抗白細(xì)胞效應(yīng)，導(dǎo)致動(dòng)物的顯 著降低的白細(xì)胞負(fù)擔(dān)和延長的存活(Zeng等人，2009)。此類發(fā)現(xiàn)表明CXCR4/CXCL12相互 作用的破壞可以用于通過靶向其保護(hù)性BM微環(huán)境而使白細(xì)胞細(xì)胞對(duì)于化學(xué)療法增敏。
[0092] 如W0 2008/060367和W0 2013/071068中所述，已經(jīng)開發(fā)了針對(duì)CXCR4的新穎的首 創(chuàng)人治療性單克隆抗體。這些單克隆抗體以低納摩爾親和力結(jié)合表達(dá)CXCR4的細(xì)胞，以低納 摩爾EC 5Q值阻斷CXCL12結(jié)合表達(dá)CXCR4的細(xì)胞并抑制CXCL12誘導(dǎo)的迀移和鈣流。因?yàn)镃XCR4 在癌癥的多個(gè)基本方面包括增殖、迀移/侵襲和血管發(fā)生中起作用，因此拮抗劑可能具有多 種方式來干涉其中表達(dá)CXCR4的惡性腫瘤。顯著地，除了阻斷CXCL12誘導(dǎo)的鈣流和迀移，TO 2013/071068還教導(dǎo)了表達(dá)CXCR4的腫瘤細(xì)胞的凋亡的抗體依賴性誘導(dǎo)是這些人抗CXCR4抗 體的作用機(jī)制。抗體誘導(dǎo)的凋亡導(dǎo)致在多個(gè)造血腫瘤異種移植模型中有力的體內(nèi)效力。相 反，小分子CXCR4拮抗劑諸如AMD3100增加 CXCR4+腫瘤細(xì)胞從BM的動(dòng)員并由此增加化學(xué)增 敏，但不直接殺死此類腫瘤細(xì)胞，其表明抗CXCR4抗體相比于小分子CXCR4拮抗劑在殺死癌 癥細(xì)胞中的增強(qiáng)的效力。
[0093] 華氏巨球蛋白血癥 麗，也稱為淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤，是非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的一種無痛的（緩慢生長的） 亞型。該疾病特征在于末端分化的B淋巴細(xì)胞（即，在BM和淋巴結(jié)中形成的白細(xì)胞)的不受控 的克隆性增殖。該疾病的獨(dú)特特征在于B細(xì)胞產(chǎn)生過量的單克隆IgM，其可以導(dǎo)致稱為高粘 血癥的血液變稠。該IgM蛋白可以導(dǎo)致許多癥狀，包括疲勞、無法解釋的體重減輕、增大的淋 巴結(jié)或脾臟、受損的腎功能、系統(tǒng)性淀粉樣變性、虛弱和無法解釋的出血。B細(xì)胞增殖還干擾 紅細(xì)胞的產(chǎn)生，導(dǎo)致貧血。
[0094] WM是罕見病，在美國每年僅約1500例。不存在單一認(rèn)可的WM治療，但包括刺激免疫 系統(tǒng)的生物制劑和化學(xué)療法的組合的治療方案已提供了有希望的結(jié)果(Treon，2009)。目 前用于治療WM患者的組合療法的一些實(shí)例包括BDR:硼替佐米(VELCADE ? )、地塞米松和利 妥昔單抗(1?11'1^4~?)(1'代〇11等人，2009);1^0:環(huán)磷酰胺（0￥1'(^4~? ;陬0341^)、地 塞米松和利妥昔單抗（Dimopoulos等人，2007); R-CH0P:環(huán)磷酰胺、多柔比星 (八01^1^(：1_)、長春新堿((^0^1_)、潑尼松和利妥昔單抗；0?1? :環(huán)磷酰胺、潑尼松和 利安昔單抗；VR:棚替佐米和利安昔單抗;FR:氣達(dá)拉?兵(FLUDARA?)和利安昔單抗；和 TR:沙利度胺（THAL0MID?)和利妥昔單抗。目標(biāo)應(yīng)答率高（> 80%)但完全應(yīng)答率低（Ο-? 5%) 。 正在研究 的療法包括依魯替尼 （MBRUVICA ? ) ， 選擇性的 布魯頓 氏酪氨酸激酶 (ΒΤΚ) 抑制劑;阿侖單抗(CAMPATH? )，其靶向WM細(xì)胞表面上的⑶52;奧法木單抗（ARZERRA? )，其 靶向Β細(xì)胞表面上的CD20分子;苯達(dá)莫司汀(TREANDA ? )，其攻擊癌細(xì)胞的DNA并破壞細(xì)胞分 裂周期;mTOR抑制劑依維莫司（AFINIT0R ?，Z0RTRESS ? )，其抑制細(xì)胞生長和分離;和卡非 佐米（KYPR0LIS?)，一種選擇性蛋白酶體抑制劑。在本文公開的用于治療WM或C1013G/ CXCR4-相關(guān)的WM的方法的某些實(shí)施方案中，任何前述藥劑或其任何組合可以與本公開的抗 CXCR4抗體組合使用。在其他實(shí)施方案中，在麗患者對(duì)用于治療麗的任何這些抗麗療法（已 使用或在開發(fā)中）的進(jìn)展后，使用抗CXCR4抗體。
[0095] CXCR4和C1013G/CXCR4突變?cè)谌A氏巨球蛋白血癥中的作用 之前已顯示W(wǎng)M細(xì)胞表達(dá)高水平的趨化因子和黏著受體，包括CXCR4和VLA-4，以及CXCR4 對(duì)于CXCL12誘導(dǎo)的WM細(xì)胞的迀移和經(jīng)內(nèi)皮迀移是必需的（Ngo等人，2008)。顯示CXCR4敲 低或CXCR4抑制劑AMD3100顯著抑制麗細(xì)胞的迀移以及其黏著纖連蛋白、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì) 胞。由AMD3100誘導(dǎo)的WM細(xì)胞對(duì)基質(zhì)細(xì)胞降低的黏著導(dǎo)致這些細(xì)胞對(duì)由硼替佐米的細(xì)胞毒 性即抑制增殖的敏感性增加。進(jìn)一步證實(shí)CXCR4和VLA-4響應(yīng)于CXCL12直接相互作用。因此， 已顯示CXCR4/CXCL12軸與VLA-4相互作用，調(diào)節(jié)WM細(xì)胞在BM微環(huán)境中的迀移和黏著(Ngo等 人，2008)。
[0096]如本文描述的具有B細(xì)胞淋巴增生性障礙的418位患者的檢查(參見實(shí)施例1;表1) 揭示具有低級(jí)淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤(WM)的患者中28%具有C1013G/CXCR4變體。因此進(jìn)行研 究以分析C1013G/CXCR4變體的功能關(guān)聯(lián)，使用體內(nèi)模型以評(píng)價(jià)其在介導(dǎo)WM細(xì)胞擴(kuò)散和疾 病進(jìn)展中的假定作用，并鑒定可以靶向C1013G/CXCR4-突變的淋巴漿細(xì)胞的新穎的治療方 法。這些研究證實(shí)CXCR4對(duì)支持WM細(xì)胞返回BM以及WM擴(kuò)散至遠(yuǎn)端器官中起關(guān)鍵作用，如使用 CXCR4功能獲得研究體內(nèi)所示(實(shí)施例2)。重要的是，攜帶C1013G/CXCR4變體的mi細(xì)胞相比 于過表達(dá)CXCR4的細(xì)胞產(chǎn)生相似表型(實(shí)施例3)，表明C1013G/CXCR4變體可以代表功能活性 突變。此外，C1013G/CXCR4-突變的細(xì)胞顯示相比于對(duì)照細(xì)胞或CXCR4過表達(dá)的麗細(xì)胞的體 內(nèi)向淋巴結(jié)的擴(kuò)散(實(shí)施例3 )，表明產(chǎn)生的C1013G/CXCR4變體能夠概括在患者中臨床觀察 到的情形。顯著地，C1013G/CXCR4突變的細(xì)胞能夠定殖髓外組織，諸如體內(nèi)肺和腎臟(實(shí)施 例3)，反映出在具有髓外WM的患者中觀察到的表型，其中所述變體已在所有肺和腎臟損害 的情況中均被檢測(cè)到。
[0097]觀察的C1013G/CXCR4變體是WHIM綜合征中原始描述的突變之一。這是罕見的、遺 傳性的、雜合的、常染色體顯性疾病，特征為異常功能的免疫力。這由CXCR4突變引起，這負(fù) 責(zé)削弱其胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)氖荏w的羧基末端尾(talk)(C尾)的截短，導(dǎo)致對(duì)趨化因子配體的增加 的應(yīng)答性和BM中的中性粒細(xì)胞的保留（Balabanian等人，2005; 2008; Hernandez等人， 2003; Taniuchi等人，2005)。近期研究已證實(shí)在WM患者中存在WHIM樣C1013G/CXCR4突 變(Hunter等人，2014)，但該突變?cè)赪M中的體內(nèi)功能后遺癥和是否體細(xì)胞變體存在于其 他B細(xì)胞淋巴組織增殖性疾病(其中CXCR4介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞運(yùn)輸和擴(kuò)散)在本研究之前尚未進(jìn) 行描述。導(dǎo)致疾病進(jìn)展的C1013G/CXCR4突變的細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)散的增加的能力通過涉及細(xì)胞侵 襲性、抗凋亡、細(xì)胞增殖和腫瘤生成的基因的富集而得到支持(實(shí)施例3)。這導(dǎo)致相比于對(duì) 照細(xì)胞在突變細(xì)胞中促存活途徑的上調(diào)。這些效應(yīng)當(dāng)用C1013G/CXCR4突變的細(xì)胞或?qū)φ占?xì) 胞注射的攜帶WM的小鼠時(shí)用抗CXCR4抗體ulocuplumab處理時(shí)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，如下文所述。
[0098]攜帶C1013G/CXCR4-突變的華氏巨球蛋白血癥細(xì)胞對(duì)常規(guī)使用的抗mi劑的改變的 敏感性 通常用于治療WM的藥物包括藥劑諸如利妥昔單抗、苯丁酸氮芥(LEUKERAN ? )、克拉屈 濱(LEUSTATIN? )、氟達(dá)拉濱、硼替佐米、苯達(dá)莫司汀(單獨(dú)地或以各種組合）。用于治療難治 性/復(fù)發(fā)性WM的額外療法包括奧法木單抗(用于對(duì)于利妥昔單抗過敏的患者）、依維莫司、阿 侖單抗和高劑量的化學(xué)療法與自體或同種異體干細(xì)胞移植。若干新型藥物或藥物組合在WM 的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行研究(一些用于難治性/復(fù)發(fā)性疾?。ǚ亲裘?、依魯替尼和帕比司 他（LBH-589)。
[0099]依魯替尼，一種口服施用的酶布魯頓氏酪氨酸激酶的抑制劑，近期由美國食品藥 品監(jiān)管局(FDA)批準(zhǔn)用于治療外套細(xì)胞淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞性白血病，并于2013年2月由 FDA授予作為用于WM患者的單一療法的突破性療法認(rèn)定。依魯替尼已報(bào)道在患有復(fù)發(fā)性或 難治性mi的患者中是高度活性的且良好耐受的（Treon等人，2013)，并于2014年10月補(bǔ)充 新藥申請(qǐng)（sNDA)提交至Π )Α，其基于來自依魯替尼在之前用至少一種全身性WM方案治療治 療的WM患者中的2期臨床試驗(yàn)（臨床試驗(yàn)政府標(biāo)識(shí)號(hào)（ClinicalTrials · gov Identifier): NCT01614821)的數(shù)據(jù)。然而，存在WMM樣CXCR4突變已顯示賦予對(duì)WM細(xì)胞中依魯替尼介導(dǎo)的 生長抑制的降低的敏感性(Cao等人，2013; Treon等人，2013)，并且相比于具有野生型 CXCR4的患者中77%的應(yīng)答率，在具有WHIM樣CXCR4突變的患者中僅30%的主要應(yīng)答率 (Treon 等人，2013)。
[0100] 此外，本文(實(shí)施例4)已顯示C1013G/CXCR4體細(xì)胞變體與對(duì)常規(guī)使用的抗麗小分 子包括BTK抑制劑、依魯替尼、mTOR抑制劑、依維莫司和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI 3K)抑制劑、 idelalisib (ZYDELIG? )的WM細(xì)胞抗性相關(guān)，支持了該變體在介導(dǎo)藥物抗性中的作用。這 一結(jié)果表明mT0R、BTK和PI3K抑制劑可能在治療其WM細(xì)胞攜帶C1013G/CXCR4-突變的患者中 不是有效的。相反，C1013G/CXCR4-突變的WM細(xì)胞和未突變的對(duì)照細(xì)胞對(duì)于蛋白酶體抑制劑 藥物卡非佐米和硼替佐米同樣敏感(實(shí)施例4)，因此說明在攜帶C1013G/CXCR4體細(xì)胞突變 的WM患者中u 1 〇 cup 1 umab和蛋白酶體抑制劑的可能的組合方案。
[0101] 不受任何具體理論的束縛，提出BTK、PI3K和mTOR抑制劑針對(duì)C1013G/CXCR4-突變 的細(xì)胞不是有效的，這是因?yàn)榕c那些特定途徑相關(guān)基因的上調(diào)。此外，證實(shí)突變的CXCR4細(xì) 胞存在RAF以及促分裂原激活的蛋白激酶/促分裂原激活的蛋白激酶激酶和mTOR途徑的富 集，因此進(jìn)一步表明在RAF和促分裂原激活的蛋白激酶激酶/ERK/mTOR途徑之間的存在串音 (crosstalk) (Downward, 2003; Lim 和Counter, 2005)。相反，NF-κΒ 和 NF-κΒ-相關(guān)的凋亡 基因在CXCR4突變的細(xì)胞中相比于對(duì)照細(xì)胞沒有差異調(diào)節(jié)(數(shù)據(jù)未顯示）。這可以（至少部分 地)解釋相比于野生型細(xì)胞在突變的麗細(xì)胞中存在BTK、mT0R和PI3K抑制劑抗性和對(duì)蛋白酶 體抑制劑的敏感性。
[0102] 用抗CXCR4抗體治療華氏巨球蛋白血癥 抗CXCR4抗體BMS-936564本文顯示抑制WM細(xì)胞系朝向原代WM骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(BM-MSC)或CXCR4配體CXCL12的迀移（參見實(shí)施例5)。該抗CXCR4抗體還抑制麗細(xì)胞黏著麗BM-MSC并抑制在存在WM BM-MSC的情況下mi細(xì)胞增殖。此外，還提供抗體可以直接在mi細(xì)胞中 誘導(dǎo)凋亡的證據(jù)(實(shí)施例5)。因此，本公開提供了用于治療患有WM的主體的方法，所述方法 包括向所述主體施用治療有效量的特異性結(jié)合表達(dá)于細(xì)胞(包括WM細(xì)胞)表面的CXCR4受體 的抗體或其抗原結(jié)合部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本方法中所用的抗體為本公開的抗CXCR4 抗體，其特異性結(jié)合CXCR4受體并展示對(duì)于治療用途期望的某些功能特性。此類功能特性包 括對(duì)表達(dá)于細(xì)胞表面上的人CXCR4的高親和力結(jié)合、抑制在細(xì)胞表達(dá)CXCR4的細(xì)胞中SDF-1 誘導(dǎo)的鈣流和細(xì)胞表達(dá)CXCR4的細(xì)胞的迀移、體內(nèi)抑制CXCR4+腫瘤細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo) CXCR4+腫瘤細(xì)胞凋亡、增加攜帶CXCR4+腫瘤的主體的存活時(shí)間、和/或本文描述的其他功能 特性。
[0103] 本公開還提供以下實(shí)驗(yàn)證據(jù)，即CXCR4基因中C1013G突變存在于約28%的mi患者 中和約20%的IgM-MGUS患者中，但在測(cè)試的若干其他B細(xì)胞癌癥中是罕見的或不存在(參見 實(shí)施例1)。因此，在B細(xì)胞淋巴組織增殖性疾病中，WM患者的特征為C1013G/CXCR4突變。還提 供顯示CXCR4過表達(dá)促進(jìn)體內(nèi)WM細(xì)胞生長和擴(kuò)散的數(shù)據(jù)(實(shí)施例2)。顯示存在C1013G/CXCR4 突變?cè)黾釉诖嬖谠鶺M BM-MSC的情況下WM細(xì)胞的黏著和增殖，概述了CXCR4過表達(dá)在WM細(xì) 胞中的作用(實(shí)施例3)。因此，C1013G/CXCR4突變?cè)趍i細(xì)胞中為激活突變，如被顯著的腫瘤 增殖和擴(kuò)散至髓外器官導(dǎo)致疾病進(jìn)展和降低的存活所證實(shí)的。
[0104] 顯著地，ulocuplumab顯示在體外和體內(nèi)在BM微環(huán)境的背景中有效靶向CXCR4突變 的麗細(xì)胞的黏著、迀移和增殖特性(參見實(shí)施例6)。施用ulocuplumab導(dǎo)致在C1013G/CXCR4 麗模型中體內(nèi)顯著的腫瘤減小和髓外擴(kuò)散的消除。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)CXCR4是麗分子致病的關(guān) 鍵調(diào)節(jié)子并且是重要的治療靶點(diǎn)。使用抗CXCR4抗體成功地靶向野生型和C1013G/CXCR4突 變的WM細(xì)胞(如實(shí)施例5-7中所述)提供了將這些觀察結(jié)果翻譯為WM患者的臨床試驗(yàn)的可靠 基礎(chǔ)。
[0105] 因此，本公開提供了用于治療患有麗(包括C1013G/CXCR4-相關(guān)的WM)的主體的方 法，所述方法包括向所述主體施用治療有效量的特異性結(jié)合表達(dá)于細(xì)胞(包括WM細(xì)胞)表面 的CXCR4受體的抗體或其抗原結(jié)合部分。在本方法的某些實(shí)施方案中，主體為人WM患者，優(yōu) 選患有C1013G/CXCR4-相關(guān)的WM的人患者。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部 分結(jié)合表達(dá)于細(xì)胞表面上的人CXCR4受體，諸如表達(dá)于細(xì)胞表面的攜帶C1013G突變的人 CXCR4受體。在某些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分為IgGl、IgG2、IgG3或IgG4同種型 的。在某些其他實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分為IgGl同種型的。在其他實(shí)施方案中， 抗體或其抗原結(jié)合部分為IgG4同種型的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分 是單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。在仍某些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分是嵌合的、 人源化的或人抗體或其抗原結(jié)合部分。優(yōu)選地，抗體或其抗原結(jié)合部分是人抗體或其抗原 結(jié)合部分。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體或其片段是ulocuplumab或其結(jié)合CXCR4的片段。
[0106] 重要的是，本文已公開C1013G/CXCR4突變的mi細(xì)胞對(duì)于用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤 的重要的三類藥物是抗性的，所述三類藥物正在積極地測(cè)試用于治療WM，即，BTK抑制劑（由 依魯替尼示例）、mT0R抑制劑（由依維莫司示例)和PI3K抑制劑（由idelalisib示例）(實(shí)施例 4)。相反，顯示抗CXCR4抗體在抑制C1013G/CXCR4突變的和未突變的麗細(xì)胞兩者的增殖和迀 移中是有效的。這些結(jié)果表明mT0R、BTK和PI3K抑制劑將無法高效治療其WM細(xì)胞攜帶 C1013G/CXCR4突變的患者，并且強(qiáng)調(diào)了抗CXCR4抗體用于治療此類C1013G/CXCR4-WM變體的 效用。
[0107] 本文已顯示Ulocuplumab靶向WM細(xì)胞，而與其突變狀態(tài)無關(guān)，這通過抑制促存活信 號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活、刺激促凋亡級(jí)聯(lián)并抑制體內(nèi)WM細(xì)胞擴(kuò)散(實(shí)施例5和6)。因此，在所公開 的治療方法的某些實(shí)施方案中，篩選WM患者的C1013G/CXCR4突變的存在，從而鑒定對(duì)于 BTK、mT0R、或PI 3K抑制劑藥物治療不合適的患者，其中此類患者適合于用抗CXCR4抗體治 療。此類WM患者可能不是用BTK、mT0R或PI3K抑制劑藥物治療的好的候選者，并且可以取而 代之用本公開的抗CXCR4抗體作為一線單一療法來治療。在本方法的某些優(yōu)選的實(shí)施方案 中，抗CXCR4抗體是ulocuplumab。在其他實(shí)施方案中，患有C1013G/CXCR4-麗的患者用抗 CXCR4抗體諸如ulocuplumab和抗WM劑諸如依魯替尼、依維莫司、idelalisib、卡非佐米和/ 或硼替佐米治療。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，C1013G/CXCR4-WM患者用抗CXCR4抗體單獨(dú)或與 另一抗WM劑的組合來治療，作為患者已對(duì)一種或多種治療失敗后的第二或第三線療法。例 如，抗CXCR4抗體可以在WM患者已對(duì)用依魯替尼的一線治療失敗后施用，或者抗體可以在患 者已對(duì)用化學(xué)治療BDR(硼替佐米、地塞米松和利妥昔單抗)或RCD(環(huán)磷酰胺、地塞米松和利 妥昔單抗)方案的一線治療和用依魯替尼的第二線治療失敗后施用。
[0108] 用于華氏巨球蛋白血癥中單一療法的抗CXCR4抗體 WM細(xì)胞暴露于BMS-936564導(dǎo)致胱天蛋白酶-9和PARP切割的增加（實(shí)施例5)。用BMS-936564中和CXCR4還增加磷酸(p)-GSK3-0和ρ-β-連環(huán)蛋白上調(diào)的水平，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白降 解。BMS-936564類似地增加 C1013G/CXCR4-相關(guān)的WM細(xì)胞中的胱天蛋白酶-9切割和PARP切 割并調(diào)節(jié)GSK3-0/0-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致p-GSK3-0/p-0-連環(huán)蛋白的上調(diào)和β-連環(huán)蛋白 降解(實(shí)施例6XBMS-936564的這些作用與在麗和C1013G/CXCR4相關(guān)的麗細(xì)胞中的凋亡途 徑的激活一致，且反映了在其他Β細(xì)胞惡性腫瘤中證實(shí)的BMS-936564的促凋亡作用（W0 2013/071068; Kuhne等人，2013)。因此，在用于治療WM患者的這些方法的某些實(shí)施方案 中，抗CXCR4抗體或其片段誘導(dǎo)表達(dá)CXCR4或C1013G/CXCR4的細(xì)胞的凋亡。
[0109] 公開的抗CXCR4抗體的凋亡作用（一種由小分子CXCR4拮抗劑例如AMD3100未展現(xiàn) 的特性)表明這些抗體可以單獨(dú)作為單一療法使用來治療患有癌癥的患者。對(duì)于CXCR4拮抗 劑在體內(nèi)AML和MM腫瘤模型中的作用的之前研究已證明這些拮抗劑在增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)于化 學(xué)療法的敏感性中是有效的(Azab等人，2009; Zeng等人，2009)。此外，本文實(shí)施例6中 呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證實(shí)ulocuplumab(作為單一療法施用）抑制在注射有C1013G/CXCR4 WM細(xì)胞的 小鼠中的WM擴(kuò)散，這通過在經(jīng)治療的小鼠中相比于對(duì)照抗體治療的小鼠中的在股骨、肝臟、 腎臟和肺中CXCR4+/CD20+細(xì)胞浸潤的顯著降低所證明。類似地，實(shí)施例7顯示ulocuplumab 抑制體內(nèi)野生型麗細(xì)胞擴(kuò)散。這些結(jié)果與當(dāng)ulocuplumab在各種各樣的AML、NHL、和麗模型 中作為單一療法施用時(shí)取得的顯著的腫瘤生長抑制是一致的(W0 2013/071068; Kuhne等 人，2013)。
[0110]因此，在用于治療野生型WM或C1013G/CXCR4相關(guān)的WM的本治療方法的某些實(shí)施方 案中，抗CXCR4抗體或其片段作為單一療法施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體或其片段誘導(dǎo) 表達(dá)CXCR4或C1013G/CXCR4的細(xì)胞的凋亡。因此，本公開還提供誘導(dǎo)表達(dá)CXCR4或C1013G/ CXCR4的WM細(xì)胞的凋亡的方法，所述方法包括向WM主體施用治療有效量的本公開的抗CXCR4 抗體。
[0111] 用于治療華氏巨球蛋白血癥的抗CXCR4和抗癌療法的組合 如實(shí)施例7中所述，BMS-936564和硼替佐米的每一種顯著降低在BM中的腫瘤細(xì)胞和血 清IgM的水平。然而，BMS-936564和硼替佐米的組合協(xié)同作用以引起腫瘤細(xì)胞和血清IgM水 平中甚至更顯著的降低。這些結(jié)果與之前的證明即CXCR4/CXCL12軸在MM細(xì)胞向BM的返回和 運(yùn)輸中起主要作用并且破壞MM癌細(xì)胞與BM的相互作用使這些細(xì)胞對(duì)治療劑變得敏感是一 致的（Alsayed 等人，2007; Azab 等人，2009; Kuhne 等人，2013; W0 2013/071068)。
[0112] 在本方法的某些實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合CXCR4受體并抑 制受體的活性。這破壞了 WM干細(xì)胞在BM微環(huán)境中的返回和維持和/或增加 WM細(xì)胞從BM向周 圍的動(dòng)員，并由此增加 WM癌細(xì)胞對(duì)一種或多種抗癌治療諸如放射治療或施用化學(xué)治療劑的 敏感性。
[0113] 因此，在某些實(shí)施方案中，本公開的抗CXCR4抗體與其他癌癥治療諸如手術(shù)和/或 放射組合使用，和/或可以與一種或其他多種治療劑例如細(xì)胞毒性劑、放射毒劑或免疫抑制 劑共施用，這增強(qiáng)或增加抗CXCR4抗體的治療作用。抗體可以與藥劑連接(作為免疫綴合物） 或可以與藥劑分開施用。在后一種情況下(分開施用），抗體可以在藥劑之前、之后或與藥劑 同時(shí)施用，或者可以與其他已知的治療劑包括常規(guī)化學(xué)治療藥物和結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原或免 疫調(diào)節(jié)靶標(biāo)的抗體共施用。
[0114] 用于這些方法的抗癌藥物包括，尤其是，硼替佐米、卡非佐米、依魯替尼、 idelalisib、帕比司他、地塞米松、利妥昔單抗、沙利度胺、環(huán)磷酰胺、來那度胺、多柔比星、 長春新堿、潑尼松、氟達(dá)拉濱、苯丁酸氮芥、苯達(dá)莫司汀、克拉屈濱、阿侖單抗、奧法木單抗、 依維莫司、順鉑、硫酸博來霉素、卡莫司汀、米托蒽醌、依托泊苷、阿糖胞苷、異環(huán)磷酰胺、卡 鉑和依托泊苷。本文證實(shí)CIO 13G/CXCR4突變的和未突變的WM細(xì)胞均對(duì)于蛋白酶體抑制劑卡 非佐米和硼替佐米同樣敏感(實(shí)施例4)。此外，ulocuplumab和硼替佐米的組合在降低BM內(nèi) WM腫瘤細(xì)胞和降低體內(nèi)血清I gM水平以及誘導(dǎo)體外WM細(xì)胞中的毒性中協(xié)同作用(實(shí)施例7 )。 總之，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明ulocuplumab與蛋白酶體抑制劑例如硼替佐米或卡非佐米的組合 方案在治療攜帶有野生型CXCR4或C1013G/CXCR4體細(xì)胞變體的WM患者中是高度有效的。共 施用本公開的抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合片段與抗腫瘤劑提供至少兩種抗癌劑，其經(jīng)不同 機(jī)制運(yùn)作以對(duì)人腫瘤實(shí)施細(xì)胞毒性作用。除了抗CXCR4抗體和其他藥劑的可能的協(xié)同相互 作用外，此類共施用可以幫助克服由于發(fā)展出對(duì)藥物的抗性或腫瘤細(xì)胞的抗原性中的改變 (這將使其對(duì)用抗CXCR4抗體無反應(yīng)性)而產(chǎn)生的問題。
[0115] 因此，本公開的抗CXCR4抗體可以通過其從BM的保護(hù)性環(huán)境中釋放惡性腫瘤細(xì)胞 的能力而用于發(fā)揮化學(xué)治療劑的作用。如上所述，除了動(dòng)員WM細(xì)胞和增加其化學(xué)增敏外，這 些抗體已顯示具有通過凋亡而直接殺死MM細(xì)胞的額外作用并因此（當(dāng)作為單一療法施用 時(shí))在治療WM包括C1013G/CXCR4相關(guān)的WM中是有效的。
[0116] 劑量 在所公開的用于治療WM的方法的某些實(shí)施方案中，治療有效量的抗CXCR4抗體或其抗 原結(jié)合部分包含范圍為〇. 1-20 mg/kg體重的劑量。例如，在某些實(shí)施方案，治療有效量的抗 體或其抗原結(jié)合部分包含〇 . 1、〇 . 3、0.5、1、3、5、10或20 mg/kg的劑量。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，劑量為1、3或10 mg/kg。在其他實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分以每周一次、每兩周 一次、每三周一次或每月一次的劑量時(shí)間表施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合 部分以每7-14天一次的劑量時(shí)間表施用。在某些實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體作為單一療法施 用持續(xù)治療的持續(xù)時(shí)間。在其他實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體每周施用，在周期1中作為單一療 法持續(xù)前兩周，并隨后與包括例如硼替佐米、地塞米松和利妥昔單抗(BDR)或環(huán)磷酰胺、地 塞米松和利妥昔單抗(RCD)的化學(xué)療法方案組合。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體或其抗原 結(jié)合部分靜脈內(nèi)施用。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分皮下施用。
[0117] 例如，對(duì)于用ulocuplumab和BDR組合治療WM，示例性劑量方案包括：（1) ulocuplumab (1、3或10 mg/kg)，作為在第1、8、15、22和29天(周期1)和第1、8和15天(周期2 和隨后周期）的單一60分鐘靜脈輸注施用；（2)硼替佐米（1.3 mg/m2)，作為在第15、18、22和 25天(周期1)和第1、4、8、11天(周期2和隨后的周期）的3-5第二靜脈推注施用；（3)地塞米松 (20或40 mg)，在第15、16、18、19、22、23、25和26天（周期1)和在1、2、4、5、8、9、11和12天（周 期2和隨后的周期）施用；和(4)利妥昔單抗(375 mg/m2)，在第25天（周期1)和在第11天（周 期2和隨后的周期)通過緩慢靜脈輸注例如經(jīng)90分鐘施用。
[0118] 當(dāng)抗CXCR4抗體在與其他抗麗劑的組合療法中使用時(shí)，這些藥劑通常以其批準(zhǔn)的 或標(biāo)準(zhǔn)劑量使用。例如，用依魯替尼的示例性劑量方案包含每天一次口服以420 mg(三個(gè) 140-mg膠囊)給藥直至無法接受的毒性或疾病進(jìn)展。
[0119] 在另一實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體的劑量為統(tǒng)一固定劑量(flat-fixed dose)，其 是固定的而與患者體重?zé)o關(guān)。例如，抗CXCR4抗體可以以5、20、35、75、200、350、750或1500 mg的固定劑量施用，而與患者體重?zé)o關(guān)。如本文所用，術(shù)語"固定劑量"、"統(tǒng)一劑量(flat dose)"和"統(tǒng)一固定劑量"可互換使用并指向患者施用的而與患者的體重或體表面積(BSA) 無關(guān)的劑量。因此，固定劑量或統(tǒng)一劑量不作為m g / k g劑量提供，而是作為藥劑（例如抗 CXCR4抗體)的絕對(duì)量提供。
[0120] 包括患者選擇步驟的C1013G/CXCR4相關(guān)的華氏巨球蛋白血癥的治療 本文顯示C1013G/CXCR4突變是WM中的激活突變(實(shí)施例3)。盡管相比于野生型WM細(xì)胞 的C1013G/CXCR4突變的細(xì)胞的更具侵襲性的表型，但發(fā)現(xiàn)BMS-936564在靶向CXCR4突變的 細(xì)胞的黏著、迀移和增殖特性中是同樣有活性的（實(shí)施例5)。因此，本公開的抗CXCR4抗體可 以在治療C1013G/CXCR4相關(guān)的WM中具有特定的可應(yīng)用性，并且治療方案可以包括用于鑒定 攜帶C1013G突變的患者的步驟。因此，在一方面，本公開提供用于治療患有C1013G/CXCR4相 關(guān)的WM的主體的方法，其包括(a)選擇作為治療的合適候選者的主體，所述選擇包括:（i)提 供獲自所述主體中的WM組織的測(cè)試組織樣品；（ii)評(píng)價(jià)WM測(cè)試組織樣品中的細(xì)胞是否攜帶 CXCR4基因中的C1013G突變;和（iii)基于確定麗細(xì)胞攜帶CXCR4基因中的C1013G突變來選 擇主體為合適的候選者;和(b)向所選的主體施用治療有效量的特異性結(jié)合表達(dá)于C1013G/ CXCR4-相關(guān)的WM細(xì)胞的表面上的CXCR4受體的本公開的抗體或其抗原結(jié)合部分。在本方法 的某些實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體與抗WM劑例如硼替佐米或卡非佐米（其對(duì)于治療攜帶 C1013G/CXCR4體細(xì)胞變體的WM患者也是有效的）組合施用。在本方法的任一種中，測(cè)試組織 樣品包含腫瘤組織的活檢樣品或發(fā)現(xiàn)于周圍的腫瘤細(xì)胞樣品。
[0121] 本公開還提供用于治療患有C1013G/CXCR4-相關(guān)的mi的主體的方法，所述方法包 括向所述主體施用治療有效量的特異性結(jié)合表達(dá)于C1013G/CXCR4-相關(guān)的WM細(xì)胞的表面上 的CXCR4受體的本公開的抗體或其抗原結(jié)合部分，所述主體已基于確定主體的WM細(xì)胞攜帶 CXCR4基因中的C1013G突變來進(jìn)行選擇。
[0122] 本公開進(jìn)一步提供用于選擇WM患者用于用特異性結(jié)合表達(dá)于WM細(xì)胞的表面上的 CXCR4受體的本公開的抗體或其抗原結(jié)合部分治療的方法，所述方法包括：（a)任選地提供 獲自患者中的WM組織的測(cè)試組織樣品；（b)評(píng)價(jià)WM測(cè)試組織樣品中的細(xì)胞是否攜帶CXCR4基 因中的C1013G突變;和(c)基于確定WM細(xì)胞攜帶CXCR4基因中的C1013G突變來選擇患者用于 治療。
[0123] 在另一方面，本公開提供了用于確定包括用于治療主體中C1013G/CXCR4-相關(guān)的 WM的本公開的抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分的治療方案的方法，所述方法包括：（a)任選 地提供獲自主體中的mi組織的測(cè)試組織樣品；（b)評(píng)價(jià)mi測(cè)試組織樣品中的細(xì)胞是否攜帶 CXCR4基因中的C1013G突變;和(c)基于確定WM細(xì)胞攜帶C1013G突變來確定治療方案。
[0124] 在本方法的某些實(shí)施方案中，C1013G突變通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定、逆轉(zhuǎn)錄 酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定、核酸雜交測(cè)定或通過DNA測(cè)序來檢測(cè)。在進(jìn)一步的實(shí)施方 案中，PCR測(cè)定為實(shí)時(shí)等位基因特異性PCR (AS-PCR)測(cè)定。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，DNA測(cè)序 為全基因組DNA測(cè)序。
[0125] 在包括篩選測(cè)試組織樣品中的C1013G/CXCR4突變的任何所公開的方法中，應(yīng)理解 包括提供來自患者的測(cè)試組織樣品的步驟為任選步驟。即，在某些實(shí)施方案中所述方法包 括該步驟，而在其他實(shí)施方案中，該步驟不包括在所述方法中。還應(yīng)理解在某些實(shí)施方案 中，確定WM測(cè)試組織樣品中的細(xì)胞是否攜帶C1013G突變的"評(píng)價(jià)"步驟通過測(cè)定突變的存在 的變化的方法來進(jìn)行，例如通過進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定。在其他實(shí)施方案中，不涉及 變化的方法并且突變的存在通過例如參閱來自實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試結(jié)果的報(bào)告來評(píng)價(jià)。在某些實(shí) 施方案中，直至且包括評(píng)價(jià)細(xì)胞是否攜帶C1013G/CXCR4突變的方法的步驟提供中間結(jié)果， 所述中間結(jié)果可以提供給醫(yī)師或其他醫(yī)療從業(yè)人員用于選擇治療的合適候選者和/或向患 者施用治療劑。在某些實(shí)施方案中，提供中間結(jié)果的步驟可以由醫(yī)療從業(yè)人員或在醫(yī)療從 業(yè)人員指導(dǎo)下工作的某些人來進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，這些步驟通過獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室或通過 獨(dú)立的人諸如實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員來進(jìn)行。
[0126] 本公開的另一方面涉及用于治療患有C1013G/CXCR4相關(guān)的WM的患者的治療方案， 所述方案通過上述方法來確定，所述方法包括(a)任選提供獲自主體的WM組織的測(cè)試組織 樣品；（b)評(píng)價(jià)所述WM測(cè)試組織樣品中的細(xì)胞是否攜帶CXCR4基因中的C1013G突變;和(c)基 于確定WM細(xì)胞攜帶C1013G突變來確定治療方案。在某些實(shí)施方案中，治療方案包括向患者 以以下劑量和頻率施用本公開的抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分：（a)在治療攜帶野生型 CXCR4基因的mi患者中施用的劑量的至少兩倍、至少三倍、或至少五倍的劑量;和/或(b )在 治療攜帶野生型CXCR4基因的WM患者中施用的頻率的至少兩倍、至少三倍、或至少五倍的頻 率。
[0127] 用于治療華氏巨球蛋白血癥的優(yōu)選的抗CXCR4抗體 本文公開的治療方法包括向WM患者施用本公開的抗CXCR4抗體。該抗體特異性結(jié)合表 達(dá)于麗細(xì)胞表面上的野生型CXCR4或C1013G/CXCR4變體，并展示對(duì)于治療效力有利的某些 結(jié)構(gòu)和功能特性。例如，期望的結(jié)構(gòu)特征是抗體包含F(xiàn)7 (ulocuplumab)、F9、D1或E2 (如W0 2008/060367中標(biāo)識(shí)的）的CDR或可變區(qū)，或與這些抗體的任何交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CXCR4的相同表 位區(qū)。期望的功能特征包括與表達(dá)于細(xì)胞表面上的人CXCR4高親和力結(jié)合，體內(nèi)抑制CXCR4+ 腫瘤細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)CXCR4+腫瘤細(xì)胞凋亡。在所公開的治療方法的某些優(yōu)選的實(shí)施方 案中，抗CXCR4抗體或其部分包含:包含連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可變區(qū)中的CDR1、CDR2和 ⑶R3結(jié)構(gòu)域，其序列描述于SEQ ID N0: 25;和包含連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可變區(qū)中的 CDRUCDR2和CDR3結(jié)構(gòu)域，其序列描述于SEQ ID N0:29。
[0128] 在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體或其部分包含:包含連續(xù)連接的氨基酸 的重鏈可變區(qū)，其序列描述于SEQ ID N0:25;和包含連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其序 列描述于SEQ ID N0:29。
[0129] 在仍其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)由Kabat系統(tǒng)的CDR序列的描述(Kabat等人， 1991; Johnson和Wu，2000)，抗CXCR4抗體或其部分包含：包含具有描述于SEQ ID NO: 1的 序列的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可變區(qū)⑶R1，包含具有描述于SEQ ID NO:5的序列的連續(xù) 連接的氨基酸的重鏈可變區(qū)CDR2,包含具有描述于SEQ ID NO:9的序列的連續(xù)連接的氨基 酸的重鏈可變區(qū)⑶R3,包含具有描述于SEQ ID N0:13的序列的連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可 變區(qū)⑶R1，包含具有描述于SEQ ID N0:17的序列的連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可變區(qū)⑶R2， 和包含具有描述于SEQ ID N0:21的序列的連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可變區(qū)CDR3。在更優(yōu)選 的實(shí)施方案中，抗體或其片段是ulocuplumab或其結(jié)合CXCR4的片段。
[0130]所公開的本發(fā)明的一個(gè)方面為本公開的抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分用于制備 用于治療患有WM或C1013 G / C X C R 4相關(guān)的WM的主體的藥物的用途。這公開了本公開的抗 CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分，其用于治療患有WM或Cl 013G/CXCR4相關(guān)的WM的主體。
[0131] 治療藥劑盒 還在本公開范圍內(nèi)的是包含抗CXCR4抗體或抗原結(jié)合片段或其組合物以及使用說明書 (例如包括允許醫(yī)療從業(yè)人員或患者向WM患者施用抗體或其組合物的施用時(shí)間表的說明 書)的藥劑盒。因此，本公開提供用于治療主體中C1013G/CXCR4-相關(guān)的麗的藥劑盒，所述藥 劑盒包含(a)-種或多種劑量的本公開的任何的抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分和(b)用于 在任何本文所述的治療方法中使用抗CXCR4抗體或其片段的說明書。例如，在某些實(shí)施方案 中，藥劑盒中的抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分包含具有SEQ ID NO: 25中所示的氨基酸序 列的重鏈可變區(qū)中的⑶R1、CDR2和⑶R3結(jié)構(gòu)域，和具有SEQIDN0:29中所示的氨基酸序列 的輕鏈可變區(qū)中的CDR1、CDR2和CDR3結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體是 ulocuplumab。任選地，藥劑盒包括單一劑量的藥物組合物的多個(gè)包裝，每個(gè)包含有效量的 用于根據(jù)本文所述方法單次施用的抗CXCR4抗體。藥劑盒可以進(jìn)一步包含一種或多種額外 的本文所述的治療劑，諸如化學(xué)治療劑或放射性毒劑，或一種或多種額外的靶向不同抗原 的抗體。在某些實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體與一種或多種其他治療劑以單位劑型共同包裝。
[0132] 用于施用藥物組合物所需的儀器或設(shè)備也可以包含在藥劑盒中。例如，藥劑盒可 以包含一個(gè)或多個(gè)注射器。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)注射器預(yù)先填充有抗CXCR4抗體 的量。藥劑盒還通常包括連同使用說明書的標(biāo)明藥劑盒的內(nèi)含物的預(yù)期用途的標(biāo)簽。術(shù)語 標(biāo)簽包括任何提供于藥劑盒上或連同藥劑盒提供的或以其他方式伴隨藥劑盒提供的任何 書寫的或記錄的材料。
[0133] 本發(fā)明進(jìn)一步通過以下實(shí)施例來說明，所述實(shí)施例僅為說明性的且不應(yīng)解釋為以 任何方式限制本公開的范圍，因?yàn)樵S多改變和等同方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言在閱讀本 公開后將變得顯而易見。整個(gè)本申請(qǐng)中引用的所有附圖和所有參考、GenBank條目、專利和 公開的專利申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用明確地并入本文。
[0134] 實(shí)施例1 篩選患有B細(xì)胞淋巴組織增殖性疾病患者的C1013/CXCR4突變 篩選患有不同的B細(xì)胞淋巴組織增殖性疾病的患者的C1013/CXCR4變體的存在。
[0135]臨床樣品 從患有不同的B細(xì)胞淋巴組織增殖性疾病(B-Lro)的418位患者收集腫瘤樣品，所述患 者分布如下:WM (η = 131); IgM MGUS (η = 40);彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤(η = 75);脾邊 緣區(qū)淋巴瘤(η = 14); Β細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(η = 37，包括具有Μ組分的16位）； 毛細(xì)胞性白血病(η = 35); MM (η = 36，IgM同種型中的3位）；IgA/IgG MGUS (η = 22); 不具有WM標(biāo)準(zhǔn)的淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤(η = 13);淀粉樣變(η = 6);和沒有另外具體說明的 B-LHKn = 9)。根據(jù)造血和淋巴組織腫瘤的最新WHO分類進(jìn)行診斷(Campo等人，2011)。研 究中還包括32位健康志愿者作為對(duì)照。
[0136]診斷組織中的免疫表型分析和克隆細(xì)胞定量 使用之前描述的單克隆抗體組(Paiva等人，2013)并按照EuroFlow組用于血液惡性 腫瘤的免疫表型評(píng)價(jià)的一般推薦(van Dongen等人，2012)來常規(guī)完成免疫表型評(píng)價(jià)。這 些病例使用包括除表面IgM(sIgM)和胞質(zhì)IgA和K(CyIgA和cylgK)外高至20種不同抗原的4 色組合來進(jìn)行免疫表型分析。克隆細(xì)胞的百分比用包括slgM/⑶25/⑶19/⑶38 MoAb的試管 來計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)米集在FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson Biosciences [BDB] San Jose，CA)使用FACSDiva軟價(jià)(版本6.1; BDB)和用于所有事件和僅CD19+-事件的兩步驟 采集程序來進(jìn)行。使用Infinicyt軟件(Cytognos; Salamanca, Spain)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。診斷 組織中的免疫表型分析和克隆細(xì)胞定量后，使用實(shí)時(shí)等位基因特異性PCR(AS-PCR)進(jìn)行 C1013G/CXCR4變體的檢測(cè)。十例髓外WM也包括在這些研究中。對(duì)于這些研究從Dana-Farber Cancer Institute和University Hospital of Salamanca Institutional Review Boards獲得許可。根據(jù)赫爾辛基宣言提供知情同意。
[0137] 用于鑒定CXCR4 C1013G突變的實(shí)時(shí)AS-PCR 基于使用兩條反向引物（區(qū)別在于最后兩個(gè)核苷酸(在3'位)從而每一引物對(duì)于野生型 或突變的等位基因是特異性的)開發(fā)實(shí)時(shí)AS-PCR測(cè)定，如所述的(Paiva等人，2013)。為了 防止未匹配引物的擴(kuò)增（由此提高特異性），向緊鄰?fù)蛔兒塑账崽幰腩~外的核苷酸錯(cuò)配(C > G)。引物的具體長度和位置用Oligo 6.0軟件(Molecular Biology Insights, Cascade, CO)進(jìn)行計(jì)算。反向引物為： 5 ' -GACTCAGACTCAGTGGAAACAGATG-3 '（反向野生型引物)和 5'-GACTCAGACTCAGTGGAAACAGAAC-3'（反向突變引物）。通用正向引物為5'-TTTCTTCCACTGTTGTCTGAACC-3'，用于產(chǎn)生 165 bp的PCR產(chǎn)物。此外，使用Primer Express? Software ν3·0·1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)設(shè)計(jì)特異性TaqMan? 探針，其產(chǎn)生以下報(bào)道分子、序列和猝滅劑:6FAM: 5 ' -TATGCTTTCCTTGGAGCCA-3 ' ： NFQ-MGB。
[0138] 對(duì)于實(shí)時(shí)AS-PCR開發(fā)，每一實(shí)驗(yàn)需要兩種不同的PCR反應(yīng)：一種用于檢測(cè)CXCR4 C1013G突變（用突變的反向引物）和另一種作為DNA質(zhì)量的對(duì)照（使用野生型反向引物）。每 一反應(yīng)在20 μL的終體積中進(jìn)行，其包含300 nM的每一引物、200 nM的探針、lx的TaqMan? Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)和20 ng的 基因組DNA。實(shí)驗(yàn)在StepOnePlus? Real-Time PCR System (Applied Biosystems)中進(jìn)行 并由以下組成:95°C下10 min的起始變性步驟;隨后為95°C15 s和60°C60 s，50個(gè)循環(huán)。用 StepOne? Software ν2·1 (Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)，其提供CT值，所述CT值被認(rèn) 為是其中熒光開始區(qū)別于背景的循環(huán)。
[0139] 結(jié)果 在患有WM的患者中存在C1013G/CXCR4變體 C1013G/CXCR4 突變?cè)?28.2% 的WM患者（37/131)和在 20% 的 IgM-MGUS 患者（8/40)中檢 測(cè)到。參見表1。此外，變體在7%的患有脾邊緣區(qū)淋巴瘤的患者（1/14)和1.3%的患有彌散 性大B細(xì)胞淋巴瘤的患者（1/75)中被檢測(cè)到，而它在B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病、毛細(xì)胞 性白血病、麗和IgG/IgA MGUS中不存在（表1)，表明該變體在支持WM的分子致病以及IgM-MGUS前體階段中的潛在作用。C1013G/CXCR4變體引起CXCR4中單一核苷酸改變C-G，導(dǎo)致預(yù) 測(cè)的終止密碼子替代了氨基酸位置338處的絲氨酸(S338X)。這已經(jīng)之前聯(lián)系到CXCR4的C末 端結(jié)構(gòu)域的截短(Alapi K等人，2007)，導(dǎo)致其削弱的胞內(nèi)易位。
[0140] 為了進(jìn)一步證實(shí)觀察到的變體可能的確誘導(dǎo)mi細(xì)胞表面上的CXCR4改變，評(píng)價(jià)了 獨(dú)立的原代麗患者BM衍生的⑶191細(xì)胞上的CXCR4表面表達(dá)(其攜帶變體(n=3 )或不攜帶變 體(n=8))，并且相比于野生型/CXCR4患者，在攜帶C1013G/CXCR4變體的患者中發(fā)現(xiàn)更高的 表面表達(dá)（圖2)。此外，證實(shí)髓外WM組織學(xué)診斷的10位患者也評(píng)價(jià)了體細(xì)胞變體的存在:肺 損害(3/3)和腎臟損害（1/1)的患者存在突變的C1013G/CXCR4,但該突變?cè)谛∧c(2/2)和軟 組織(4/4)中不存在，如通過AS-PCR對(duì)基因組DNA所檢測(cè)的（表2)，表明該突變可能在涉及髓 外損害的患者中是更普遍的。
[0141] 表1:華氏巨球蛋白血癥患者存在C1013G/CXCR4體細(xì)胞突變
[0142] C1013G/CXCR4變體存在于28%的具有麗的患者中，在患有B細(xì)胞淋巴組織增殖性 疾病的少數(shù)患者中不存在或者存在。
[0143] B-CLL，B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病;MGUS，意義未明的單克隆丙種球蛋白?。?N0S，未另外說明。
[0144] 表2: C1013G/CXCR4變體存在于患有髓外麗疾病的患者的肺和腎臟組織中
[0145] 實(shí)施例2 CXCR4過表達(dá)對(duì)WM細(xì)胞生長和擴(kuò)散的作用 為了解析CIO 13G/CXCR4變體在支持WM生物學(xué)的體內(nèi)功能關(guān)聯(lián)性，過表達(dá)CXCR4 (GFP+) 的WM細(xì)胞(CXCR4+)首先提供對(duì)CXCR4在體內(nèi)WM中的作用的探究。
[0146] 免疫組織化學(xué) 分析鼠組織(BM、肝臟、腎臟、肺和淋巴結(jié))并定量人⑶20和人CXCR4的表達(dá)。這些組織用 福爾馬林10%固定，將乙醇70%用作儲(chǔ)存溶液；并包埋于石蠟。將石蠟切片與抗人CXCR4 (Abeam, Cambridge, MA)和抗人CD20 (Dako, Carpinteria, CA)單克隆抗體孵育，使用 Leica Bond III 自動(dòng)染色平臺(tái)（Leica Biosystems，Buffalo Grove, IL)。二級(jí)抗體作為 Bond III Refine Detection Kit (Leica Biosystems)的部分提供并且切片與提供于 Bond III Refine Detection Kit中的二氨基聯(lián)苯(DAB)-過氧化物酶底物孵育，用蘇木精-曙紅復(fù)染，脫水，封固并數(shù)字照相(Nikon Eclipse 80i，Nikon, Melville, NY)。使用NIS Elements軟件(Nikon, Melville, NY)進(jìn)行CD20和CXCR4染色的定量。
[0147] 組織免疫熒光 進(jìn)行組織免疫熒光成像用于評(píng)價(jià)收獲自小鼠的股骨、肝臟和腎臟的過表達(dá)GFP+/CXCR4 的WM細(xì)胞或RFP+/混雜（scramble)WM細(xì)胞，如所述的（Hsieh等人，2012)。目標(biāo)細(xì)胞為 BCWM. 1-GFP+或BCWM. 1-RFP+。核染料DAPI加入每一載玻片。使用熒光顯微鏡（Nikon Eclipse 80i;物鏡40X plan fluor 0.75NA)分析載玻片。從4個(gè)分開區(qū)域/載玻片計(jì)數(shù) MM. 1S-GFP+細(xì)胞。使用Hamamatsu OrcaER照相機(jī)和NISElement軟件獲取圖像。使用Image J 合并兩個(gè)不同的通道。
[0148] ELISA 通過使用人IgM ELISA測(cè)定(ZeptoMetrix, Buffalo, NY)根據(jù)制造商方案測(cè)定人血清 IgM水平。
[0149 ]體外細(xì)胞黏著、迀移和增殖研究 WM細(xì)胞黏著至原代WM BM-MSC通過使用鈣黃綠素 AM標(biāo)記的MM細(xì)胞的體外黏著測(cè)定來評(píng) 價(jià)。使用分光光度計(jì)(485-520)如之前所述測(cè)量熒光程度(Roccaro等人，2010)。麗細(xì)胞黏 著至纖連蛋白通過使用與纖連蛋白的體外黏著測(cè)定按照制造商推薦(EMD Biosciences， San Diego, CA)來評(píng)價(jià)，如所述的（Roccaro等人，2013)<^Μ細(xì)胞系向SDF-la或原代WM BM-MSCs的迀移使用經(jīng)孔迀移板（Corning Life Sciences, Tewksbury, ΜΑ)來評(píng)價(jià)，如之 前所述的（Roccaro等人，2010; Sacco等人，2011; Azab等人，2012)?！?細(xì)胞增殖通 過在與原代BM-MSC共培養(yǎng)48小時(shí)后評(píng)價(jià)DNA合成來評(píng)估，通過[3H]-胸苷（[ 3H]-TdR; Perkin Elmer, Boston, ΜΑ)攝入來測(cè)量，如之前所述的（Roccaro等人，2010; Sacco等 人，2011; Azab等人，2012)。細(xì)胞毒性通過測(cè)量3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基 溴化四唑來評(píng)價(jià)（Chemicon International, Temecula, CA)，如所述的（Roccaro 等人， 2010; Sacco 等人，2011; Azab 等人，2012)。
[0150]功能喪失和功能獲得研究 CXCR4功能獲得或功能喪失研究已使用WM細(xì)胞系(BOVM. 1; MWCL1)(單獨(dú)地或在原代WM BM-MSC背景下)進(jìn)行，如之前所述的(Roccarro等人，2010; Sacco等人，2011)。簡言之， 使用短發(fā)夾RNA(shRNA);克隆171、649)和慢病毒介導(dǎo)的感染在麗細(xì)胞中敲低0乂〇?4;將混 雜探針用作包含靶序列(克隆171、649)的對(duì)照或混雜對(duì)照，這根據(jù)制造商的說明書(Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ)。轉(zhuǎn)導(dǎo)效率通過定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)并通過使用熒光顯微 鏡(Nikon Eclipse 80i, Nikon, Melville, NY)評(píng)價(jià)表達(dá)GFP的細(xì)胞的檢測(cè)來驗(yàn)證。
[0151] WM細(xì)胞中的CXCR4過表達(dá)使用精密LentiORF/CXCR4/GFP (CXCR4+)或用作對(duì)照的 混雜探針/RFP (Thermo Scientific)來獲得。過表達(dá)效率通過qRT-PCR并通過用熒光顯微 鏡(Nikon Eclipse 80i, Nikon, Melville, NY)檢測(cè)表達(dá)GFP和RFP的細(xì)胞來證實(shí)。
[0152] 統(tǒng)計(jì)學(xué) 描述的某些統(tǒng)計(jì)學(xué)方法還用于其他實(shí)施例中。體外測(cè)定提供的P值基于T檢驗(yàn)(雙尾的； α 0.05)或AN0VA。每一圖片提供Ρ值。使用CalcuSyn軟件程序（Biosoft, Ferguson, Μ0)通 過等效應(yīng)圖分析來分析藥物協(xié)同作用，如25-27所述?？ㄆ仗m-邁耶曲線使用GraphPad Prism獲得并且P值基于對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)來計(jì)算（Roccaro等人，2010; Sacco等人，2011; Roccaro 等人，2008)。
[0153] 結(jié)果 體內(nèi)CXCR4在WM中的功能關(guān)聯(lián) 將CXCR4+/GFP+細(xì)胞和空載體/RFP+細(xì)胞注射入SCID/取小鼠中。注射效率通過qRT-PCR (圖3)和免疫熒光成像(數(shù)據(jù)未顯示;Roccaro等人，2014)來驗(yàn)證。將CXCR4+/GFP+細(xì)胞和空 載體/RFP+細(xì)胞注射入SCID/取小鼠中。由于疾病進(jìn)展，3周后將小鼠安樂死，證明mi細(xì)胞中 CXCR4的過表達(dá)導(dǎo)致更具侵襲性的表型，如相比于空載體細(xì)胞注射的小鼠在CXCR4+細(xì)胞注 射的小鼠中器官的顯著更高的損害（P〈 0.01;圖4A-C)。
[0154] 先體外后體內(nèi)研究證實(shí)CXCR4+ WM細(xì)胞在BM和包括肝臟和腎臟在內(nèi)的其他器官中 擴(kuò)散和增殖更快（圖4;圖5A-C)。這些發(fā)現(xiàn)還被免疫熒光成像所證實(shí)，其顯示相比于RFP+細(xì) 胞，GFP+更高的浸潤，RFP+細(xì)胞和GFP+細(xì)胞分別代表空載體感染的細(xì)胞和CXCR4+感染的細(xì)胞 (數(shù)據(jù)未顯示;Roccaro等人，2014)。重要的是，在攜帶CXCR4+細(xì)胞的小鼠中（相比于空載 體細(xì)胞注射的小鼠）觀察到降低的存活(P = 0.02;圖5D)。此外，相比于未注射的或空載體 細(xì)胞注射的小鼠，注射CXCR4+細(xì)胞的小鼠具有增加的血清IgM分泌(P = 0.02;圖4D)。先體 外后體內(nèi)CXCR4+細(xì)胞的存在還通過對(duì)收獲自CXCR4+細(xì)胞或空載體注射的小鼠的股骨的BM細(xì) 胞進(jìn)行qRTPCR來證實(shí)（圖4E)。
[0155] 由于麗細(xì)胞中CXCR4功能獲得的體外后遺癥也通過比較CXCR4+細(xì)胞與CXCR4敲低 細(xì)胞而描述。感染效率在mRNA水平（圖6)和通過免疫熒光成像(數(shù)據(jù)未顯示;Roccaro等人， 2014 )來證實(shí)。當(dāng)在BM-MSC背景下時(shí)WM細(xì)胞黏著原代WM BM基質(zhì)細(xì)胞(BM-MSC)和增殖的能力 顯示在CXCR4+ WM細(xì)胞中增強(qiáng)，并在CXCR4敲低的WM細(xì)胞的情況下被抑制（圖5E、F)。類似地， CXCR4過表達(dá)導(dǎo)致WM細(xì)胞與纖連蛋白增加的黏著能力，這與CXCR4沉默的細(xì)胞相反，所述 CXCR4沉默的細(xì)胞存在受抑制的WM細(xì)胞與纖連蛋白的黏著（圖7A、B)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明 CXCR4對(duì)于促進(jìn)體內(nèi)WM細(xì)胞生長和擴(kuò)散是關(guān)鍵的。
[0156] 實(shí)施例3 C1013G/CXCR4突變對(duì)于WM致病的作用 解釋了 C1013G/CXCR4變體是否積極支持WM致病導(dǎo)致疾病進(jìn)展的問題。
[0157] C1013G/CXCR4 誘變 使用QuickChange XL基因定點(diǎn)誘變?cè)噭┖校⊿tratagene, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)根據(jù)制造商說明書通過基因定點(diǎn)誘變?cè)赪M細(xì)胞系(BCWM.l; MWCL1)中產(chǎn) 生C1013G/CXCR4變體。用對(duì)照載體感染的細(xì)胞考慮為對(duì)照并在本文描述為"對(duì)照細(xì)胞"。WM 感染的細(xì)胞中C1013G/CXCR4的檢測(cè)通過進(jìn)行對(duì)分離自感染的細(xì)胞的基因組DNA或cDNA的等 位基因特異性PCR來評(píng)價(jià)。（正向引物： 5 ' -TTTCTTCCACTGTTGTCTGAACC-3 ' ；反向野生型引物： 5 ' -GACTCAGACTCAGTGGAAACAGATG-3 ' ；反向突變引物： 5 ' - GACTCAGACTCAGTGGAAACAGAAC-3 '）。通過DNA測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)數(shù)據(jù)。
[0158] 基因表達(dá)研究 使用HG-U133加2測(cè)定(GSE50683)對(duì)C1013G/CXCR4-突變的BCWM.1細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)概 況分析。使用RNeasy試劑盒(Qiagen)分離RNA。使用d-Chip軟件將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。使用Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)如之前所報(bào)道的分析差異表達(dá)的基因標(biāo)簽 (Subramanian等人，2005)。從公開可得的來源下載數(shù)據(jù)集（Broad Institute, Cambridge, ΜΑ)〇
[0159] 結(jié)果 產(chǎn)生穩(wěn)定的C1013G突變的WM細(xì)胞(C1013G/CXCR4-WM)并將對(duì)照載體感染的WM細(xì)胞用作 對(duì)照。分別通過定量PCR(qPCR)和qRT-PCR在基因組DNA和互補(bǔ)DNA(cDNA)水平證實(shí)誘變效 率，并進(jìn)一步通過Sanger DNA測(cè)序驗(yàn)證（圖8A-C)。
[0160] 由攜帶突變的mi細(xì)胞誘導(dǎo)的體內(nèi)表型隨后檢查。注射有C1013G/CXCR41M細(xì)胞的 小鼠存在向遠(yuǎn)端器官的顯著的腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和增加的血清IgM分泌（圖8D)，因此概括了 在注射有過表達(dá)CXCR4+的麗細(xì)胞的小鼠中觀察到的作用。除了已證實(shí)的肝臟、腎臟和BM的 損害之外，C1013G/CXCR4-WM細(xì)胞注射的小鼠還存在增大的淋巴結(jié)和肺損害。未觀察到向中 樞神經(jīng)系統(tǒng)的擴(kuò)散。組織病理學(xué)分析顯示在檢查的所有組織中均存在CXCR4和⑶20陽性細(xì) 胞，例外是腦（圖8E ;圖9A-E)，并且CXCR4和CD20陽性率相比于對(duì)照細(xì)胞注射的小鼠在 C1013G/CXCR4-WM細(xì)胞注射的小鼠中更高（P〈 0.05;圖10)。重要的是，C1013G/CXCR4-WM 細(xì)胞注射的小鼠存在降低的總體存活(P = 0.003;圖9F)。
[0161] 體外對(duì)C1013G/CXCR4-WM細(xì)胞(BCWM.1)進(jìn)一步表征，顯示在存在原代WM BM-MSC的 情況下增加的黏著和細(xì)胞增殖，因此證實(shí)C1013G/CXCR4變體能夠在麗細(xì)胞中再現(xiàn)CXCR4過 表達(dá)的作用（圖11A、B)。使用不同的WM細(xì)胞系證實(shí)了相似的發(fā)現(xiàn)(MWCL1;圖11C、D)。
[0162] 表3:C1013G/CXCR4-麗患者中基因的上調(diào)
[0163] 攜帶C1013G/CXCR4突變的麗患者(n=10)中基因的上調(diào)與CXCR4/野生型麗患者相 比(n=30)〇
[0164] 為了更好地解釋C1013G/CXCR4變體促進(jìn)體內(nèi)WM細(xì)胞擴(kuò)散的能力，將突變的細(xì)胞在 mRNA水平上表征。使用GSEA，證明涉及侵襲性、細(xì)胞增殖、抗凋亡和致腫瘤性的基因 （Rizki A等人，2008; Wang等人，2007)相比于麗對(duì)照載體感染的細(xì)胞，在C1013G/CXCR4-麗細(xì) 胞中均被富集，這與突變的細(xì)胞相比于對(duì)照細(xì)胞更具侵襲性的表型（圖12A)是一致的。這些 體內(nèi)觀察結(jié)果連同在mRNA水平上觀察到的改變表明CIO 13G/CXCR4-WM變體作為WM細(xì)胞中的 激活突變而起作用。
[0165] 使用qRT-PCR在mRNA水平上對(duì)mi患者進(jìn)行概況分析，并且若干涉及促分裂素激活 的蛋白激酶BTK和PI3K途徑的基因（其已知支持麗生物學(xué)（Chng等人，2008; Gutierrez 等人，2007))被發(fā)現(xiàn)相比于CXCR4/野生型WM患者(n=30)在C1013G/CXCR4突變的WM患者(n= 10)中顯著上調(diào)(表3)。重要的是，相比于對(duì)照載體感染的細(xì)胞，那些改變?cè)贑1013G/CXCR4突 變的BCWM1細(xì)胞中同樣富集，因此進(jìn)一步證實(shí)C1013G/CXCR4工程化的BCWM.1細(xì)胞對(duì)于在原 代WM腫瘤細(xì)胞中所觀察到的結(jié)果是代表性的（圖12B)。
[0166] 實(shí)施例4 C1013G/CXCR4-WM變體對(duì)于常規(guī)抗WM劑的抗性 研究了攜帶C1013G/CXCR4變體的WM細(xì)胞對(duì)于常規(guī)使用的抗WM小分子的敏感性。
[0167] 材料和方法 試劑 依維莫司、idelalisib、依魯替尼、硼替佐米和卡非佐米購自Selleck Chemicals (Houston，TX)。將藥物溶解于二甲亞砜并隨后馬上使用前稀釋于細(xì)胞培養(yǎng)基（10%胎牛血 清）。二甲亞砜(0.1%)的最大終濃度不影響細(xì)胞增殖并且不誘導(dǎo)對(duì)所測(cè)試的細(xì)胞系的細(xì)胞 毒性。
[0168] BMS936564/MDX-1338和對(duì)照人IgG4同種型獲自Bristol-Myers Squibb (Redwood City, CA)〇
[0169] 基因集合富集分析 GSEA如實(shí)施例3中所述進(jìn)行。
[0170] 結(jié)果 GSEA研究顯示涉及藥物抗性的基因在攜帶突變的WM細(xì)胞系中富集，而涉及藥物應(yīng)答性 的基因在WM對(duì)照細(xì)胞中富集(圖13A)。這促進(jìn)對(duì)于新穎的抗WM劑是否可以改變其在CXCR4突 變的WM細(xì)胞背景下的抗腫瘤效力的研究。發(fā)現(xiàn)攜帶C1013G/CXCR4體細(xì)胞突變的WM細(xì)胞存在 對(duì)BTK以及PI3K和mTOR抑制劑的抗性（圖12B-D)。這些數(shù)據(jù)支持表明具有WHIM樣突變的 CXCR4的mi患者存在對(duì)基于依魯替尼療法的抗性的近期數(shù)據(jù)(Cao等人，2013; Treon等 人，2013)。重要的是，蛋白酶體抑制劑在施加針對(duì)C1013G/CXCR4突變的WM細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞 的毒性中同樣有效(圖13E-F)。
[0171] 實(shí)施例5 通過抗CXCR4抗體BMS-936564靶向WM細(xì)胞 基于CXCR4支持WM進(jìn)展的生物關(guān)聯(lián)，測(cè)試了抗CXCR4人單克隆抗體BMS-936564 (在TO 2008/060367中命名為F7;也稱為ulocuplumab或MDK-1338)的靶向WM細(xì)胞的活性。如實(shí)施例 2中所述進(jìn)行測(cè)量WM細(xì)胞的黏著、迀移和增殖的測(cè)定，并且如實(shí)施例3中所述進(jìn)行基因表達(dá) 研究。
[0172] 免疫印跡 蛋白裂解物通過在非變性條件下在補(bǔ)充有5 mM NaF、2 mM Na3V〇4、l mM PMSF (苯甲 基橫酰氣(polymethilsulfonyl fluoride))、5 yg/mL亮抑酶肽（leupeptine)和5 yg/mL抑 酞酶的裂解緩沖液中勻漿化從WM細(xì)胞獲得。將全細(xì)胞裂解物進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯 酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF)膜（Bio-Rad Laboratories, Hercu 1 es，CA)上。用于免疫印跡的抗體包括:抗磷酸(p) -ERK、抗ERK、抗p-Akt、抗Akt、抗p-Src、抗Src、抗胱天蛋白酶-9、抗PARP、抗ρ-β-連環(huán)蛋白、抗β-連環(huán)蛋白、抗p-GSK3、抗GAFOH 和抗α-微管蛋白抗體(Cell Signaling, Danvers, MA)〇
[0173] 結(jié)果 BMS-936564顯示抑制WM細(xì)胞系向原代WM BM-MSC或SDF-1的迀移（圖14A、B)。
[0174] 類似地，在WM BM-MSC存在的情況下WM細(xì)胞向WM BM-MSC黏著的BMS-936564-依賴 性抑制和WM細(xì)胞增殖的抑制也被證實(shí)（圖15A-C)。
[0175] 為了解析BMS-936564在影響麗信號(hào)傳導(dǎo)中的可能作用，將麗細(xì)胞在不存在或存在 原代WM BM-MSC的情況下并具有漸增濃度的抗CXCR4抗體下培養(yǎng)。在BM-MSC背景下培養(yǎng)的WM 細(xì)胞中觀察到P-Akt、p-ERK、和p-Src的藥物依賴性的抑制，表明BMS-936564即使在BM環(huán)境 的背景下靶向WM細(xì)胞的能力（圖16)。
[0176] 同種型對(duì)照沒有對(duì)WM細(xì)胞體外的黏著和迀移施加任何作用（圖17A、B)。
[0177] BMS-936564可以在B細(xì)胞惡性腫瘤中施加促凋亡作用（W0 2013/071068; Kuhne 等人，2013)。因此，將WM細(xì)胞暴露于BMS-936564，這導(dǎo)致胱天蛋白酶-9和PARP切割的增加 (圖 18)。
[0178] 之前已在轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤的模型中顯示了 SDF1/CXCR4和β-連環(huán)蛋白之間的相互作 用(Wang等人，2011)。此外，已知磷酸化的GSK30促進(jìn)β-連環(huán)蛋白降解(Wang等人，2011; Polakis，2001) AMS-936564對(duì)β-連環(huán)蛋白的作用因此進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)通過用BMS-936564 中和CXCR4，WM細(xì)胞存在增加的磷酸(p)-GSK3-f3和ρ-β-連環(huán)蛋白上調(diào)，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白降解 (圖19)。這些發(fā)現(xiàn)可以（至少部分地)解釋W(xué)M細(xì)胞中BMS-936564誘導(dǎo)的凋亡的可能機(jī)制。
[0179] 實(shí)施例6 體外和體內(nèi)BMS-936564對(duì)C1013G/CXCR4-WM細(xì)胞的作用 體內(nèi)研究 將SCID/^g小鼠 （η = 5/組）注射感染有精密LentiORF/CXCR4/GFP (CXCR4+)的BCWM.1 或空載體探針/RFP(對(duì)照)感染的BCWM.1細(xì)胞。3周后，將小鼠安樂死并收獲器官。對(duì)移植的 器官進(jìn)行人⑶20和CXCR4的蘇木精-曙紅染色、免疫組織化學(xué)。進(jìn)行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)存活差 異(SCID/Bg小鼠 ，η = 7/組）。使用C1013G/CXCR4突變的細(xì)胞和對(duì)照載體感染的細(xì)胞(對(duì)照 細(xì)胞)進(jìn)行類似研究。使用BCWM. 1-mCherry+細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)返回研究:將細(xì)胞靜脈內(nèi)注射入 SID/Bg小鼠并用BMS-936564或?qū)φ湛贵w處理（10mg/kg，腹膜內(nèi)；每周3-4次持續(xù)3周XBMS-936564調(diào)節(jié)WM返回BM、脾和淋巴結(jié)的能力在第三周對(duì)移植的組織通過使用熒光顯微鏡 (Nikon Eclipse 80i, Melville, NY)進(jìn)行離體（ex vivo)評(píng)價(jià)(Roccaro 等人，2013)。
[0180] 在注射有C1013G/CXCR4突變細(xì)胞的SCID/^g小鼠中測(cè)試BMS-936564的活性。將小 鼠對(duì)照用同種型對(duì)照抗體(η = 5小鼠/組;BMS-936564或?qū)φ湛贵w（10mg/kg，腹膜內(nèi)；每 周3-4次持續(xù)3周)處理。
[0181] 結(jié)果 體內(nèi)檢查BMS-936564對(duì)CXCR4-突變的麗細(xì)胞的作用。如由相比于對(duì)照抗體處理的小鼠 在處理小鼠中的股骨、肝臟、腎臟和肺中CXCR4+/CD20+細(xì)胞浸潤的顯著降低所示，BMS- 936564抑制注射有C1013G/CXCR4麗細(xì)胞的小鼠中的麗擴(kuò)散（圖19A-E;圖20A-D)。重要的 是，淋巴結(jié)損害在用BMS-936564處理的小鼠中不存在（圖20E)。
[0182] 這些發(fā)現(xiàn)在體外進(jìn)一步證實(shí)。發(fā)現(xiàn)BMS-936564在BM微環(huán)境的背景下在靶向CXCR4 突變的細(xì)胞的黏著、迀移和增殖特性中同樣有活性(圖21A-D)。
[0183] 重要的是，BMS-936564增加 CXCR4-突變的WM細(xì)胞中的胱天蛋白酶-9切割和PARP切 害;并還調(diào)節(jié)GSK3-0/0-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致p-GSK3-0/p-0-連環(huán)蛋白的上調(diào)和β-連環(huán) 蛋白降解（圖22)。此外，BMS-936564誘導(dǎo)攜帶C1013G/CXCR4突變的WM細(xì)胞中p-ERK、p-Akt和 P-Src的劑量依賴性抑制（圖22)。
[0184] 實(shí)施例7 體內(nèi)BMS-936564對(duì)野生型WM細(xì)胞的作用 BMS-936564的抗麗活性還使用野生型麗細(xì)胞體內(nèi)測(cè)試。將BCWM. l-mCherry+細(xì)胞靜脈 內(nèi)注射入SCID/Bg小鼠并用BMS-936564或?qū)φ湛贵w處理小鼠。收獲的BM、脾和淋巴結(jié)的免疫 熒光成像證實(shí)BMS-936564離體抑制WM細(xì)胞擴(kuò)散的能力（數(shù)據(jù)未顯示；Roccaro等人， 2014)。
[0185] 由于認(rèn)為CXCR4抑制誘導(dǎo)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞動(dòng)員，因此假設(shè)BMS-936564還可能誘 導(dǎo)WM細(xì)胞的動(dòng)員，導(dǎo)致對(duì)抗WM劑增加的化學(xué)敏感性。因此，對(duì)BMS-936564作為單一療法或與 硼替佐米的組合在體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展和WM細(xì)胞向遠(yuǎn)端BM環(huán)境的擴(kuò)散中的作用進(jìn)行評(píng)估。 (硼替佐米獲自Hospital Pharmacy，在DMS0中稀釋并儲(chǔ)存于-20°C直至使用，隨后臨使用前 在培養(yǎng)基中稀釋。DMS0的最大終濃度(〈0.1 % )不影響細(xì)胞增殖并且不誘導(dǎo)對(duì)所測(cè)試的細(xì) 胞系的細(xì)胞毒性(數(shù)據(jù)未顯示）。） BMS-936564處理的小鼠存在BM中腫瘤細(xì)胞的顯著降低，并且具有在硼替佐米處理的小 鼠中觀察到的相似作用，且在用BMS-936564和硼替佐米的組合處理的小鼠中具有更顯著的 抑制(P〈 0.05;圖23A)。類似地，血清IgM水平當(dāng)小鼠用BMS-936564或硼替佐米處理時(shí)顯 著降低，但在暴露于BMS-936564和硼替佐米兩者的小鼠中甚至更為顯著地降低(P〈 0.05; 圖23BKBMS-936564和硼替佐米在誘導(dǎo)在WM細(xì)胞中的毒性中的組合效應(yīng)的進(jìn)一步檢查證實(shí) 體外的協(xié)同相互作用（圖23C、D)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于治療患有C1013G/CXCR4相關(guān)的華氏巨球蛋白血癥的主體的方法，所述方法包括 向所述主體施用治療有效量的特異性結(jié)合表達(dá)于華氏巨球蛋白血癥細(xì)胞表面上的C-X-C趨 化因子受體4型(CXCR4)受體的抗體或其抗原結(jié)合部分。2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分作為單一療法施用。3. 權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括施用組合有所述抗體或其抗原結(jié)合部分的至少一 種抗癌劑。4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述至少一種抗癌劑是利妥昔單抗、硼替佐米、卡非佐米、依 魯替尼、idelalisib、帕比司他、沙利度胺、來那度胺、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、多柔比星、長 春新堿、潑尼松、氟達(dá)拉濱、苯達(dá)莫司汀、地塞米松和/或克拉屈濱。5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分在華氏巨球蛋白血癥的前期治 療失敗后施用于所述主體。6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述治療有效量的抗體或其抗原結(jié)合部分包含以每周一次、 每兩周一次、每三周一次、或每月一次的給藥時(shí)間表施用的0.1、〇.3、0.5、1、3、5、10或20 mg/kg體重的劑量。7. 用于治療患有C1013G/CXCR4相關(guān)的華氏巨球蛋白血癥的主體的方法，所述方法包 括： (a) 選擇作為合適治療候選者的主體，所述選擇包括： (i )任選地提供獲自所述主體中華氏巨球蛋白血癥組織的測(cè)試組織樣品； (ii)評(píng)估所述華氏巨球蛋白血癥測(cè)試組織樣品中的細(xì)胞是否攜帶C-X-C趨化因子受體 4型(CXCR4)基因中的C1013G突變;和 (i i i )基于確定所述華氏巨球蛋白血癥細(xì)胞攜帶CXCR4基因中的C1013G突變而選擇所 述主體為合適的候選者;和 (b) 向所選擇的主體施用治療有效量的特異性結(jié)合表達(dá)于C1013G/CXCR4相關(guān)的華氏巨 球蛋白血癥細(xì)胞的表面上的CXCR4受體的抗體或其抗原結(jié)合部分。8. 用于治療患有C1013G/CXCR4相關(guān)的華氏巨球蛋白血癥的主體的方法，所述方法包括 向所述主體施用治療有效量的特異性結(jié)合表達(dá)于C1013G/CXCR4相關(guān)的華氏巨球蛋白血癥 細(xì)胞的表面上的CXCR4受體的抗體或其抗原結(jié)合部分，所述主體已基于確定主體的華氏巨 球蛋白血癥細(xì)胞攜帶C-X-C趨化因子受體4型(CXCR4)基因中的Cl 013G突變來進(jìn)行選擇。9. 用于選擇華氏巨球蛋白血癥患者用于用特異性結(jié)合表達(dá)于華氏巨球蛋白血癥細(xì)胞 的表面上的C-X-C趨化因子受體4型(CXCR4)受體的抗體或其抗原結(jié)合部分治療的方法，所 述方法包括： (a) 任選地提供獲自所述患者中華氏巨球蛋白血癥組織的測(cè)試組織樣品； (b) 評(píng)估所述華氏巨球蛋白血癥測(cè)試組織樣品中的細(xì)胞是否攜帶CXCR4基因中的 C1013G突變;和 (c) 基于確定所述華氏巨球蛋白血癥細(xì)胞攜帶CXCR4基因中的C1013G突變而選擇所述 患者用于治療。10. 權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗CXCR4抗體或其部分包含:具有SEQ ID NO: 25中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)中的⑶Rl、⑶R2和⑶R3結(jié)構(gòu)域、和具有SEQ ID NO: 29中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)中的⑶Rl、⑶R2和⑶R3結(jié)構(gòu)域。11. 權(quán)利要求19中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗CXCR4抗體或其部分包含:包含具有描述 于SEQ ID NO: 25的序列的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可變區(qū)、和包含具有描述于SEQ ID NO: 29的序列的連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。12. 權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗CXCR4抗體或其部分包含:包含具有描述 于SEQ ID NO: 1的序列的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可變區(qū)⑶Rl、包含具有描述于SEQ ID N0:5的序列的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可變區(qū)⑶R2、包含具有描述于SEQ ID N0:9的序列 的連續(xù)連接的氨基酸的重鏈可變區(qū)⑶R3、包含具有描述于SEQ ID NO: 13的序列的連續(xù)連接 的氨基酸的輕鏈可變區(qū)CDRl、包含具有描述于SEQ ID NO: 17的序列的連續(xù)連接的氨基酸的 輕鏈可變區(qū)⑶R2、和包含具有描述于SEQ ID NO:21的序列的連續(xù)連接的氨基酸的輕鏈可變 區(qū)CDR3〇13. 用于治療主體中的C1013G/CXCR4相關(guān)的華氏巨球蛋白血癥的藥劑盒，所述藥劑盒 包含： (a)-個(gè)或多個(gè)劑量的抗C-X-C趨化因子受體4型(CXCR4)抗體或其抗原結(jié)合部分;和 (b )用于在權(quán)利要求1 -9中任一項(xiàng)的方法中使用抗CXCR4抗體的說明書。14. 權(quán)利要求13的藥劑盒，其中所述抗CXCR4抗體或其抗原結(jié)合部分包含:具有SEQ ID NO: 25中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)中的⑶Rl、⑶R2和⑶R3結(jié)構(gòu)域、和具有SEQ ID NO: 29中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)中的⑶Rl、⑶R2和⑶R3結(jié)構(gòu)域。
【文檔編號(hào)】C07K16/28GK105899536SQ201480072308
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年11月6日
【發(fā)明人】I.M.霍布里亞爾, A.M.羅卡羅, J.M.卡達(dá)雷利, A.薩科
【申請(qǐng)人】百時(shí)美施貴寶公司, 達(dá)納－法伯癌癥研究所公司