糖修飾的核酸分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用綴合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該綴合物包含至少一個(gè)糖殘基和至少一個(gè)選自核酸、核苷和核苷酸的核苷組分。該綴合物適于以高效率轉(zhuǎn)染原核和真核細(xì)胞，例如植物細(xì)胞或包括人細(xì)胞在內(nèi)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。因此,為治療分子提供了新的遞送載體，所述治療分子包括反義分子、siRNA分子、miRNA分子、antagomirs或這樣的分子的前體以及所述的治療性的核苷或核苷酸。進(jìn)一步提供了用于發(fā)展展示特定性狀的新的植物品系的方便的策略。
【專利說明】糖修飾的核酸分子
[0001] 本發(fā)明涉及使用包含至少一個(gè)糖殘基和至少一種選自核酸、核苷和核苷酸的核苷 組分的綴合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞。該綴合物適用于高效轉(zhuǎn)染原核和真核細(xì)胞，例如植物細(xì)胞或哺乳 動(dòng)物細(xì)胞，包括人細(xì)胞。因此，為治療分子提供了新的遞送載體，所述治療分子包括轉(zhuǎn)錄物、 信使RNA、反義分子、siRNA分子、miRNA分子、antagomirs或這樣的分子的前體以及所述的治 療性的核苷或核苷酸。進(jìn)一步提供了用于發(fā)展展示特殊的性狀的新的植物品系的方便的策 略。
[0002] RNA干擾是強(qiáng)有力的工具，其利用短的RNA雙鏈來抑制特定的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的形 成（1-3)。本質(zhì)上，所述的沉默RNA分子是通過切酶復(fù)合體切割，由較大的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生的(4)。 然而對(duì)于生物技術(shù)應(yīng)用，所述的RNA分子（siRNA)是以化學(xué)方法制備和施用的。在最近的十 年，使用siRNA作為治療劑的思想（5)受到強(qiáng)烈地追求，但是所述的主要障礙:RNA雙鏈體的 差的細(xì)胞攝取不能被克服(6)。目前，不同的RNA遞送系統(tǒng)例如納米顆粒(7,8)、脂質(zhì)體(9， 10)或聚陽(yáng)離子聚合物（11)處于密集的研究之下。盡管在所述領(lǐng)域有實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，然而，所 述的經(jīng)常還很高的毒性(12-14)和低的細(xì)胞的特異性代表了還沒有被解決的問題。
[0003] 最近，受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用已經(jīng)逐漸成為備選的遞送策略（16-25)，其允許把 所述的siRNA靶向特殊細(xì)胞類型。所述的方法要求把所述的siRNA連接到與細(xì)胞類型特異性 的受體結(jié)合的配體。這引發(fā)內(nèi)化作用加工，導(dǎo)致RNA-配體綴合物的攝取。目前，采用膽固醇 修飾的RNA最成功地實(shí)施了所述的策略(24)。
[0004] PCT/EP2013/064610(通過引文把它的公開內(nèi)容并入本文中）描述了綴合物，其中 使多不飽和脂肪酸殘基(例如花生四烯酸殘基)與核苷組分共價(jià)結(jié)合。這些綴合物特別地可 用于與其中存在大麻素受體的細(xì)胞接觸。特別是，可以使用該綴合物轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞和免 疫細(xì)胞。然而，仍然需要轉(zhuǎn)染敏感細(xì)胞以及特別到目前為止難以轉(zhuǎn)染的那些細(xì)胞的方便的 策略。
[0005] 在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，采用糖修飾的寡核苷酸可以使存在于原核和真核細(xì)胞兩者的細(xì) 胞膜中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被有效地靶向。相應(yīng)的受體介導(dǎo)的策略可以被成功地用于轉(zhuǎn)染多種敏 感細(xì)胞。
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是包含糖殘基和至少一種核苷組分的綴合物在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 的用途。
[0007] 術(shù)語(yǔ)"綴合物"也包括鹽，特別是藥學(xué)上可接受的鹽，例如與無機(jī)的或有機(jī)的酸或 堿的加成鹽，正如本領(lǐng)域公知的那樣。.
[0008] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，所述的綴合物包含糖殘基和與其共價(jià)結(jié)合的至少一種核 苷組分。根據(jù)另一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明使用的綴合物可以包含至少一種核苷組分和與其非 共價(jià)結(jié)合的糖修飾的化合物。術(shù)語(yǔ)"糖修飾的化合物"是指包含至少一個(gè)糖殘基并且能夠與 核苷組分非共價(jià)結(jié)合(例如經(jīng)由靜電相互作用）的任何化合物。糖修飾的化合物的實(shí)例是聚 陽(yáng)離子物質(zhì)，例如包含至少一個(gè)糖殘基的陽(yáng)離子型聚合物或陽(yáng)離子型脂質(zhì)體，其可以與聚 陰離子核酸分子形成離子型綴合物。所述的糖殘基可以與所述的化合物共價(jià)或非共價(jià)連 接。
[0009] 用于本發(fā)明中的綴合物包含至少一個(gè)糖殘基，特別地1-10個(gè)，更特別地1-5個(gè)糖殘 基。甚至更特別地，所述的綴合物包含1或2個(gè)糖殘基。最特別地，所述的綴合物包含1個(gè)糖殘 基。如果所述的綴合物包含超過一個(gè)糖殘基，則所述的糖殘基可能是相同的或不同的。
[0010] 與所述的糖殘基相連的所述的核苷組分可以選自核酸、核苷和核苷酸。
[0011] 在更具體的實(shí)施方式中，與所述的糖殘基相連的所述的核苷組分是核酸分子，更 特別地是RNA分子。
[0012] 所述的綴合物包含至少一個(gè)核苷組分，特別地包含1-25,更特別地包含2-20或2-10，并且甚至更特別地包含2-8，即2、3、4、5、6、7或8個(gè)核苷組分。如果所述的綴合物包含超 過一個(gè)核苷組分，則所述的核苷組分可以是相同的或不同的。
[0013] 在一種實(shí)施方式中，所述的綴合物可以包含：
[0014] (i) -個(gè)糖殘基和一個(gè)核苷組分，例如一個(gè)核酸分子，
[0015] (i i)多個(gè)糖基和一個(gè)核苷組分，例如一個(gè)核酸分子，
[0016] (i i i) -個(gè)糖殘基和多個(gè)核苷組分，例如多個(gè)核酸分子，或
[0017] (iv)多個(gè)糖殘基和多個(gè)核苷組分，例如多個(gè)核酸分子。
[0018] 在更具體的實(shí)施方式中，所述的綴合物包含1個(gè)糖殘基和2-20,特別是2-8,即2、3、 4、5、6、7或8個(gè)核苷組分。
[0019] 在一種實(shí)施方式中，所述的綴合物可以具有線型結(jié)構(gòu)。因此，核苷組分可以被連接 成直鏈，其中糖殘基可以存在于所述的鏈之內(nèi)、在所述的鏈的一端或在所述的鏈的兩端。
[0020] 在另一種實(shí)施方式中，所述的綴合物具有分支結(jié)構(gòu)，其中核苷組分經(jīng)由分枝的接 頭(例如樹枝狀的接頭)與糖殘基結(jié)合。
[0021 ]術(shù)語(yǔ)"糖殘基"包括單糖、二糖和寡糖。單糖殘基的實(shí)例是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、 核糖、阿拉伯糖、果糖、巖藻糖和唾液酸。二糖包括例如蔗糖、乳糖、海藻糖和麥芽糖。按照本 發(fā)明，能被作為糖殘基使用的寡糖包括線性的、分枝的或環(huán)狀的寡糖。所述的寡糖典型地包 含小數(shù)目（三至九）的單糖單元。環(huán)狀的寡糖的特別優(yōu)選的實(shí)例是環(huán)糊精。
[0022]可以使所述的糖殘基與至少一種核苷組分共價(jià)結(jié)合。優(yōu)選地，使所述的糖殘基經(jīng) 由接頭與所述的至少一種核苷組分結(jié)合。所述的接頭可以是線性的或分枝的接頭并且通常 具有2-50個(gè)原子的鏈長(zhǎng)，包括碳原子以及特別是雜原子(例如S、N和/或0-原子)在內(nèi)。
[0023]例如，所述的接頭可以是線性的接頭，例如包含至少一個(gè)(例如1 -10個(gè)，特別地2-5 個(gè)以及更特別地3個(gè))C1-C3稀化氧基團(tuán)(特別地氧化乙烯基團(tuán)）的接頭。
[0024]備選地，所述的接頭可以是分枝的，例如樹枝狀的接頭。
[0025]可以經(jīng)由已知的接頭技術(shù)，把所述的糖殘基連接到所述的至少一種核苷組分。然 而優(yōu)選地，所述的連接涉及Click反應(yīng)，例如在疊氮化物和炔基團(tuán)之間、在受限的鏈烯(例如 降冰片烯)和腈亞胺、腈氧化物或四嗪之間，從而導(dǎo)致由所述的Click反應(yīng)形成的環(huán)狀基團(tuán)， 特別地1，2,3_三唑基團(tuán)。
[0026]在一種具體的實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明使用的所述的綴合物由通式（la)或（lb)表 示：
[0027 ] Fn一(Lm_N)r (la)
[0028] Fn-(Lm_N)r-Lm_Fn ( lb)
[0029] 其中F是糖殘基，
[0030] L是接頭，
[0031 ] N是核苷組分，其選自核酸、核苷和核苷酸，
[0032] η是1-10,優(yōu)選地1-5,更優(yōu)選地為1的整數(shù)，，
[0033] m是 0或 1，
[0034] r是1 -25，優(yōu)選地2-20以及更優(yōu)選地2-8的整數(shù)。
[0035] 在這個(gè)實(shí)施方式中，所述的綴合物可以由結(jié)構(gòu)例如下列的結(jié)構(gòu)代表：
[0036] F-L-N [0037 ] F一(L一N)r
[0038] 其中F、L、N和r如上文定義，
[0039] F-L*-(N)r
[0040] 其中L*是分枝的接頭，并且F、N和r如上文定義，
[0041] F-(L-N)r-L-F
[0042] 其中F、L、N和r如上文定義。
[0043] 在另一種實(shí)施方式中，所述的綴合物可以包含與所述的至少一種核苷組分共價(jià)結(jié) 合的另一受體配體。所述的另一受體配體是不同于糖殘基的化合物，例如葉酸、膽固醇、激 素或多不飽和脂肪酸殘基，特別是花生四烯酸殘基，例如花生四烯酸乙醇胺。
[0044] 在這個(gè)實(shí)施方式，所述的綴合物可以由具有所述的通式(II)的結(jié)構(gòu)代表：
[0045] Fn一(Lm一N)r一Lm一Zs (II)
[0046] 其中
[0047] F是糖殘基，
[0048] L是接頭，
[0049 ] η是1 -10，優(yōu)選地1 -5，更加優(yōu)選地為1的整數(shù)，
[0050] m是 0或，
[0051 ] N是核苷組分，其選自核酸、核苷和核苷酸，
[0052] r是1 -25，優(yōu)選地2-20以及更優(yōu)選地2-8的整數(shù)，
[0053] Z是另一受體配體，并且
[0054] s是1 -10，優(yōu)選地1 -5，更加優(yōu)選地為1的整數(shù)。
[0055] 在這個(gè)實(shí)施方式中，所述的綴合物可以由結(jié)構(gòu)例如下列的結(jié)構(gòu)代表：
[0056] F-L-N-Z
[0057] F-(L-N)r-L-Z
[0058] 其中F、L、N、Z和r如上文定義，
[0059] F-L*-(N)r-L-Z
[0060] L*是分枝的接頭，并且F、L、N、Z和r如上文定義。
[0061] 用于本發(fā)明中的所述的綴合物包含至少一種選自核酸、核苷和核苷酸的核苷組 分。
[0062] 術(shù)語(yǔ)"核酸"包括單鏈的和雙鏈的核酸分子，例如DNA分子或RNA分子以及其類似 物。核酸的類似物是包含至少一個(gè)如下所述的修飾的結(jié)構(gòu)單元的核酸分子。
[0063]在一種實(shí)施方式中，所述的核酸分子是可以包含至少一個(gè)修飾的結(jié)構(gòu)單元的DNA 分子。術(shù)語(yǔ)"DNA分子"包括單鏈或雙鏈DNA分子。在雙鏈DNA分子中，所述的單條鏈可以以分 開的分子存在或經(jīng)由單鏈環(huán)或經(jīng)由異質(zhì)的接頭被共價(jià)連接。
[0064] 術(shù)語(yǔ)"DNA分子"包括由天然的DNA結(jié)構(gòu)單元（即2'-脫氧核糖核苷酸結(jié)構(gòu)單元)組成 的分子以及包含至少一個(gè)修飾的結(jié)構(gòu)單元的分子。
[0065] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述的核酸分子是RNA分子，其可以包含至少一個(gè)修飾的 結(jié)構(gòu)單元。術(shù)語(yǔ)"RNA分子"包括單鏈或雙鏈RNA分子，其中雙鏈RNA分子可以具有至少一個(gè)突 出端，例如至少一個(gè)3'-突出端。在雙鏈RNA分子中，所述的單條鏈可以以分開的分子形式存 在或經(jīng)由單鏈環(huán)或經(jīng)由異質(zhì)的接頭被共價(jià)連接。
[0066] 術(shù)語(yǔ)"RNA分子"包括由天然的RNA結(jié)構(gòu)單元（即2'-核糖核苷酸結(jié)構(gòu)單元)組成的分 子以及包含至少一個(gè)修飾的結(jié)構(gòu)單元的分子。
[0067] 修飾的結(jié)構(gòu)單元可以選自糖_、主鏈-和/或核堿基-修飾的結(jié)構(gòu)單元。糖-修飾的脫 氧核糖核苷酸包含不同于脫氧核糖的糖基團(tuán)，例如修飾的脫氧核糖基團(tuán)，其中所述的2'_氫 基團(tuán)被選自下列的基團(tuán)替代:〇!1、1?、(《、鹵素、3!1、31?、順 2、順1?、冊(cè)2或〇1其中1?是(：1-(：6烷基或 烷氧基或(： 2-〇5烯基或炔基，并且鹵素是？、(：1』^1。2'-!1修飾的具體實(shí)例是2'4和2'-0甲 基。糖-修飾的核糖核苷酸包含不同于核糖的糖基團(tuán)，例如修飾的核糖基團(tuán)，其中所述的2'-OH基團(tuán)被選自下列的基團(tuán)替代:!1、1?、01?、鹵素、3!1、31?、順 2、腦?、冊(cè)2或〇1其中1?是(：1-(：6烷基 或烷氧基或C 2_C6烯基或炔基，并且鹵素是F、Cl、Br、I。2 ' -OH修飾的具體實(shí)例是2 ' -F和2 ' -0 甲基。在主鏈-修飾的結(jié)構(gòu)單元中，所述的連接相鄰結(jié)構(gòu)單元的磷酸酯基團(tuán)可以被修飾的連 接基團(tuán)（例如硫代磷酸酯基團(tuán)）替代。在核堿基-修飾的結(jié)構(gòu)單元中，可以存在非天然發(fā)生的 核堿基代替天然發(fā)生的核堿基。嘌呤或嘧啶核堿基的相應(yīng)的類似物是本領(lǐng)域熟知的。應(yīng)該 注意到以上所述修飾可以組合。
[0068] 所述的核酸分子優(yōu)選地選自適于藥物應(yīng)用的核酸分子，特別地選自反義分子或能 夠介導(dǎo)RNA干擾的RNA分子，例如s i RNA分子或其前體。更多的合適的RNA分子包括mi RNA分 子、antagomirs、核酶以及其前體。也優(yōu)選RNA-轉(zhuǎn)錄物，例如特別是mRNA。
[0069] 術(shù)語(yǔ)"核苷組分"也包括核苷或核苷酸以及其類似物。核苷是包含核堿基和糖基團(tuán) 的化合物。核苷酸化合物是包含核堿基、糖基團(tuán)和磷酸酯基的化合物。本發(fā)明也包括糖_、磷 酸酯-和核堿基-修飾的化合物，特別是適于治療癌癥和/或病毒感染的核苷或核苷酸類似 物治療劑，例如AZT、阿昔洛韋、更昔洛韋、伐昔洛韋、吉西他濱、阿糖胞苷等等。
[0070] 可以經(jīng)由所述的分子的核堿基、糖或磷酸基，使所述的核苷組分與所述的糖殘基 相連。如果所述的化合物是核酸，可以經(jīng)由存在于所述的核酸分子中的結(jié)構(gòu)單元，特別地經(jīng) 由末端結(jié)構(gòu)單元，即位于核酸鏈的5'_或3'-端的結(jié)構(gòu)單元，使所述的核苷組分連接。在優(yōu)選 的實(shí)施方案中，所述的連接經(jīng)由存在于核酸分子(特別是RNA分子）中的修飾的末端核堿基 發(fā)生。根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述的糖殘基與所述的RNA轉(zhuǎn)錄物（例如特別是mRNA)的 5或3末端結(jié)構(gòu)單元共價(jià)結(jié)合。這些綴合物被證明是尤其適于轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞并且賦予目 的植物任何期望的性狀。
[0071] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的與所述的糖殘基的共價(jià)連接可以被連接到存在于所 述的核苷組分中的核堿基，例如DNA或RNA分子的結(jié)構(gòu)單元的核堿基，例如連接到嘌呤堿基 的位置8或嘧啶堿基的位置5。
[0072] 核酸分子，例如DNA或RNA分子通常具有從5、10、12、15或18個(gè)結(jié)構(gòu)單元到多達(dá)25、 30、50或100個(gè)結(jié)構(gòu)單元或更多的長(zhǎng)度?？梢酝ㄟ^化學(xué)合成或通過酶促法，從核酸模板(例如 通過轉(zhuǎn)錄、通過RNA聚合酶催化的（例如通過T3、T7或SP6RNA聚合酶），或通過DNA復(fù)制或通過 反轉(zhuǎn)錄)制備所述的核酸分子。優(yōu)選地，在化學(xué)合成或酶催化合成期間摻入結(jié)構(gòu)單元，其包 含官能團(tuán)，例如Click官能團(tuán)，例如末端炔基團(tuán)或置氣基、受限的稀經(jīng)基團(tuán)（例如降冰片烯基 團(tuán)）、腈氧化物基團(tuán)、腈亞胺基團(tuán)或四嗪基團(tuán)。在具體的實(shí)施方式中，摻入了通過包括末端炔 基團(tuán)（任選地經(jīng)由接頭)而被修飾的結(jié)構(gòu)單元。把Cl i ck修飾的結(jié)構(gòu)單元引入核酸分子中的 方法被描述在W02006/117161和W02008/052775中，通過引文把它們的內(nèi)容摻入本文中。可 以按照已知的方法，使所述的核苷組分上的所述官能團(tuán)和與所述的多不飽和脂肪酸殘基相 連的互補(bǔ)的官能團(tuán)偶聯(lián)。優(yōu)選地，通過例如Click反應(yīng)，采用互補(bǔ)的Click功能性反應(yīng)基(例 如疊氮基)進(jìn)行所述的偶聯(lián)。
[0073] 備選地，可以在固相合成期間，按照標(biāo)準(zhǔn)方法，例如使用亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元，把與 所述的糖殘基相連的修飾的核酸結(jié)構(gòu)單元引入核酸(例如RNA)分子中。
[0074] 可以從具有通式(V)的試劑制備根據(jù)本發(fā)明使用的綴合物：
[0075] Fn-(L，）m_(RGl)r (V)
[0076] 其中F、n、m和r如上文定義，
[0077] L'是接頭，并且
[0078] RG1是反應(yīng)基，特別是Click-反應(yīng)基，例如疊氮基(或炔基團(tuán)）。
[0079] 用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明使用的核酸綴合物的另一試劑由通式(VI)表示：
[0080] BB-(L)m-Fn (VI)
[0081 ] 其中F、L、n和m如上文定義，并且
[0082] BB是用于合成核酸分子的結(jié)構(gòu)單元，例如三磷酸核苷，或適于固相合成的結(jié)構(gòu)單 元，例如亞磷酰胺。
[0083]本發(fā)明的進(jìn)一個(gè)的方面是生產(chǎn)綴合物的方法，其中使糖殘基與RNA轉(zhuǎn)錄物（例如 mRNA)的3 ' -或5 ' -端共價(jià)結(jié)合，所說的方法包括：
[0084] (i)使所述的試劑(V)與至少一種修飾的核苷組分(VII)偶聯(lián)
[0085] (N'）r-(L"）m_RG2 (VII)
[0086] 其中Ν'是RNA分子，例如mRNA分子，
[0087] L"是接頭，
[0088] r和m如上文定義，
[0089] RG2是能夠與RG1起反應(yīng)的反應(yīng)基，特別是Click反應(yīng)基，例如炔基團(tuán)（或疊氮基）， 從而形成所述的綴合物，或
[0090] (i i)使所述的試劑(V)與至少一種修飾的核酸結(jié)構(gòu)單元(VIII)偶聯(lián)
[0091] BB-(Dm-RG2 (VIII)
[0092] 其中BB是用于合成RNA分子的結(jié)構(gòu)單元，
[0093] L"是接頭，
[0094] m是0或1，并且
[0095] RG2如上文定義，
[0096] 從而形成所述的試劑(VI)，并且把所述的試劑(VI)摻入RNA分子中，例如通過化學(xué) 合成或酶促合成，從而形成所述的綴合物。
[0097] 本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及在細(xì)胞或有機(jī)體中介導(dǎo)靶特異性的核酸修飾的方法， 其包括下列所述的步驟：
[0098] (a)使細(xì)胞或有機(jī)體與本發(fā)明所述的綴合物在其中可以發(fā)生靶特異性的核酸修飾 的條件下接觸，并且
[0099] (b)介導(dǎo)靶特異性的核酸修飾，它是通過所述的綴合物的所述的核苷組分朝向靶 核酸進(jìn)行的。
[0100] 接觸步驟(a)可以包括把所述的綴合物引入靶細(xì)胞(例如分離的靶細(xì)胞）中，該細(xì) 胞可以存在于細(xì)胞培養(yǎng)物、單細(xì)胞的微生物或靶細(xì)胞或在多細(xì)胞生物之內(nèi)的許多靶細(xì)胞 中。所述的祀細(xì)胞優(yōu)選地是真核細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人細(xì)胞或植物細(xì)胞。所述 的靶有機(jī)體優(yōu)選地是植物或哺乳動(dòng)物有機(jī)體，例如人有機(jī)體。所述的引入到有機(jī)體可以包 括腸胃外施用，例如通過注射或輸注、跨粘膜施用或透皮施用。在轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞情況下，意 外地發(fā)現(xiàn):如果所述的綴合物被添加到所述的植物的根上，包含糖殘基以及與其共價(jià)結(jié)合 的核苷組分的所述的綴合物被植物攝取。因此，把綴合物引入植物中可以包括向所述的根 施用所述的綴合物。
[0101] 介導(dǎo)步驟(b)優(yōu)選地包括抑制靶核酸，例如當(dāng)使用s iRNA綴合物時(shí)，通過RNA干擾， 或者當(dāng)使用反義分子綴合物時(shí)，通過抑制mRNA轉(zhuǎn)錄，或者通過使用治療性的核苷/核苷酸綴 合物來抑制病毒或腫瘤細(xì)胞的復(fù)制。
[0102] 優(yōu)選地通過受體介導(dǎo)的胞吞作用，更優(yōu)選地通過糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作 用，向靶細(xì)胞中引入所述的綴合物。因此，可以在缺乏遞送載體和/或轉(zhuǎn)染試劑的情況下，把 所述的綴合物引入所述的靶中。
[0103] 在一種實(shí)施方式中，所述的綴合物被用于在體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞，特別是用于轉(zhuǎn)染植物 細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包含在體外轉(zhuǎn)染人細(xì)胞。
[0104] 在另一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的綴合物被用于在體外或者在體內(nèi)轉(zhuǎn)染植物細(xì) 胞。
[0105] 已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn):本發(fā)明所述的綴合物特別適于轉(zhuǎn)染表達(dá)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白綴合物 的植物細(xì)胞?？梢猿晒Φ匕丫Y合物引入植物細(xì)胞中，所述綴合物中糖殘基與單鏈或雙鏈RNA 分子(例如mRNA或反義RNA)的5 或3 端共價(jià)結(jié)合。
[0106] 進(jìn)一步，其中在上文中描述的，糖修飾的化合物與單鏈或雙鏈RNA分子非共價(jià)結(jié)合 的綴合物已經(jīng)顯示特別適于轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞。例如，可以使用包含單鏈或雙鏈RNA分子和糖修 飾的化合物的非共價(jià)的綴合物，優(yōu)選離子型綴合物。
[0107] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的綴合物用于醫(yī)學(xué)，特別是人醫(yī)學(xué)，但是也用 于獸醫(yī)學(xué)。因此，本發(fā)明也提供包含如上所述綴合物作為活性成分以及合適的載體的藥物 組合物。為了診斷性的或治療性的應(yīng)用，所述的藥物組合物可以呈溶液的形式，例如用于輸 注或注射的溶液、乳膏、油膏、片劑、混懸劑等等。可以以任何合適的方式，例如通過腸胃外 施用，例如注射或輸注，通過跨粘膜應(yīng)用，或通過透皮應(yīng)用，或通過口服、局部、鼻、直腸用藥 等等，來施用所述的組合物。
[0108] 所述的藥物組合物可以包含非微囊劑型(例如無遞送載體，例如脂質(zhì)體和/或無轉(zhuǎn) 染試劑)的所述的綴合物作為活化劑。
[0109] 所述的綴合物可以被用來在細(xì)胞或有機(jī)體中下調(diào)基因，例如病毒的基因或與細(xì)胞 的疾病相關(guān)聯(lián)的基因，例如致癌基因，或與自身免疫或變態(tài)反應(yīng)病相關(guān)聯(lián)的基因。優(yōu)選的細(xì) 胞靶基因是例如所述的syk基因，它是編碼脾酪氨酸激酶(SYK)的與自身免疫或變態(tài)反應(yīng)病 相關(guān)聯(lián)的基因，它參與IgE依賴性的炎性信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)。所述的人SYK直向同源物被描述在 UniProt P 43405中，所述的鼠 SYK直向同源物被描述在UniProt P 48025中。進(jìn)一步優(yōu)選的 靶基因是所述的APP基因，其編碼所述的淀粉狀蛋白前體蛋白（APP)。所述的人APP直向同源 物被描述在UniProt P 05067中。APP被β-或γ分泌酶切割成與阿爾茨海默氏病的發(fā)展相關(guān) 聯(lián)的神經(jīng)毒性的片段。優(yōu)選病毒靶基因是編碼所述的單負(fù)病毒目的病毒例如埃博拉病毒、 麻疹病毒和狂犬病病毒的所述Ν或Ρ蛋白質(zhì)的基因。
[0110] 本發(fā)明的進(jìn)一步的方面是轉(zhuǎn)染細(xì)胞(優(yōu)選地植物細(xì)胞)的方法，包括使細(xì)胞暴露于 如在上文中描述的綴合物。所述的使植物細(xì)胞暴露于在本文中定義的綴合物的步驟優(yōu)選地 包括把所述的綴合物添加到植物的根部。能夠觀察到所述的綴合物然后被所述的植物攝取 并且被所述的根轉(zhuǎn)運(yùn)。特別是，使用本發(fā)明所述的方法，可以成功地把其中糖殘基與單鏈或 雙鏈RNA分子(例如mRNA或反義RNA)的所述的3 ' -或5 ' -端共價(jià)結(jié)合的綴合物引入植物細(xì)胞 中。
[0111] 進(jìn)一步，在上文中描述的其中糖修飾的化合物與單鏈或雙鏈RNA分子非共價(jià)結(jié)合 的綴合物已經(jīng)顯示特別適于轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞。例如，可以使用單鏈或雙鏈RNA分子和糖修飾的 化合物的非共價(jià)的（例如離子型)綴合物。因此本發(fā)明提供用于發(fā)展展示特定的性狀的新的 植物系的方便的策略。
[0112] 將會(huì)通過下列附圖和實(shí)施例更詳細(xì)地描繪本發(fā)明。
【附圖說明】
[0113] 圖 1
[0114]糖修飾的siRNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)和序列。作為比較實(shí)施例，顯示了花生四烯酸乙醇胺修 飾的siRNA。
[0115] 圖2
[0116] 葡萄糖修飾的siRNA向植物細(xì)胞的遞送。添加到擬南芥的根上的葡萄糖修飾的 siRNA被所述的植物攝取并且被沿著所述的根轉(zhuǎn)運(yùn)（AleXa = AleXaFlu〇r?647，Life Technologies)〇
[0117] 圖3
[0118] 糖修飾的試劑的合成。所述的反應(yīng)方案顯示葡萄糖疊氮化物(Α)和三葡萄糖疊氮 化物的制備。
[0119] 圖4
[0120] 通過銅（I)-催化的疊氮化物-炔環(huán)加成作用(CuAAC)合成葡萄糖修飾的siRNA。
[0121] 圖5
[0122] 在采用針對(duì)海腎螢光素酶的葡萄糖修飾的siRNA雙鏈體處理后，與具有花生四烯 酸乙醇胺修飾的相同的siRNA(AEA-siRA)相比，在RBL-2H3細(xì)胞中海腎螢光素酶的相對(duì)表 達(dá)。在具有11. ImM葡萄糖的培養(yǎng)基中（黑色)或在無葡萄糖的培養(yǎng)基中（綠色)培養(yǎng)所述的細(xì) 胞。
[0123] 圖6
[0124] 使用T7RNA聚合酶和γ -葡萄糖標(biāo)記的GTP的體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的原理。
[0125] 圖7
[0126] 使用T4RNA連接酶的RNA的區(qū)域選擇性的化學(xué)-酶促標(biāo)記。 實(shí)施例
[0127] 1.RNA-糖綴合物的合成
[0128] 如在圖4中描述的那樣，進(jìn)行所述的糖修飾的RNA鏈的合成。所述的合成的中心要 素是所述的在炔修飾的RNA鏈和所述相應(yīng)的葡萄糖疊氮化物1之間的Cu-催化的炔-疊氮化 物click反應(yīng)(34-39)。為了比較葡萄糖修飾的RNA與其他系統(tǒng)，click方法也用于制備使用 三葡萄糖單疊氮化物2制備三葡萄糖-RNA綴合物以及采用所述的β-環(huán)糊精單疊氮化物3制 備β-環(huán)糊精修飾的RNA鏈。進(jìn)一步，作為比較實(shí)施例，通過使用花生四稀酸乙醇胺單疊氮化 物(ΑΕΑ)4,制備了花生四烯酸乙醇胺修飾的RNA鏈。各自的糖殘基以及花生四烯酸乙醇胺單 疊氮化物被顯示在圖1中。在所有的情形中，在所述的RNA鏈和所述的各自的配體之間引入 短的乙二醇間隔區(qū)。在所有的情形中，在RNA鏈和各自的配體之間引入短的乙二醇間隔基。 所述的Click技術(shù)確保所述的糖或花生四烯酸乙醇胺分子與RNA的有效連接。另外，所述的 方法確保在更難以靠近所述的siRNA雙鏈體的3 ' -端處有效率的綴合。3 ' -修飾的siRNA鏈典 型地被所述的RNAi機(jī)器(41)更好地容忍。為了實(shí)現(xiàn)所述的3'-端連接，在RNA合成期間使用 了在C5具有辛二英(octadiine)柄的脫氧尿苷亞磷酰胺。
[0129] 所述的葡萄糖疊氮化物和三葡萄糖疊氮化物的合成被顯示在圖3中。在第一步中， 為了制備所述的葡萄糖疊氮化物1，使用2'-溴乙醇把乙二醇間隔區(qū)引入被保護(hù)的葡萄糖衍 生物中。在隨后的步驟中，在將所述的葡萄糖衍生物去保護(hù)而得到葡萄糖疊氮化物1以前， 引入疊氮化物官能度。為了合成所述的三葡萄糖疊氮化物，首先從季戊四醇和炔丙基溴制 備分枝的接頭。隨后，在保護(hù)所述的剩余醇官能度之后，把三份葡萄糖疊氮化物添加到 Click反應(yīng)在中。將所述的醇官能度去保護(hù)并且引入另一種疊氮化物官能度，最后得到所述 的三葡萄糖疊氮化物2。
[0130] 隨后使所述的疊氮化物以優(yōu)良的產(chǎn)率發(fā)生click反應(yīng)而得到包含炔的RNA有義鏈， 如圖4中所示。在HPLC提純之后，使所述的糖修飾的RNA與所述的反義反鏈雜交而獲得在圖1 中描述的siRNA雙鏈體。
[0131] 2. RNA-糖綴合物向細(xì)胞中的遞送
[0132] 為了顯現(xiàn)所述的RNA雙鏈體向活細(xì)胞中的遞送，最初使所述的糖修飾的RNA有義鏈 與包含焚光素標(biāo)記(Alexa=Alexa_JTl||.O.r?647，Life Technologies)的反義鏈雜交。
[0133] 采用擬南芥細(xì)胞研究了所述的葡萄糖修飾的RNA雙鏈體的攝取。把葡萄糖修飾的 siRNA添加到擬南芥的根上。在圖2中描述的共焦顯微術(shù)研究顯示未修飾的siRNA像期望的 那樣不能進(jìn)入所述的細(xì)胞。然而，在各自的細(xì)胞內(nèi)容易檢測(cè)到葡萄糖修飾的siRNA，這證明 了攝取和沿著所述的根的轉(zhuǎn)運(yùn)。用修飾的dsDNA也觀察到相同的結(jié)果(沒有顯示）。
[0134] 為了證明所述的遞送的siRNA分子展示所期望的RNAi效果，使用市場(chǎng)上可獲得的 雙螢光素酶報(bào)道基因測(cè)定法。把包含兩種螢光素酶(海腎和螢火蟲）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到所述的細(xì) 胞中。通過靶向所述的海腎螢光素酶的表達(dá)評(píng)價(jià)了 RNAi，而所述的熒光蟲螢光素酶充當(dāng)內(nèi) 標(biāo)。為了這些研究，使用了無進(jìn)一步熒光素修飾的葡萄糖修飾的siRNA。采用未修飾的RNAI 鏈體(沒有葡萄糖，沒有熒光素）的起始控制實(shí)驗(yàn)顯示所述的海腎表達(dá)不受影響。相比之下， 在兩種細(xì)胞系中都觀察到在配體修飾的SiRNA存在時(shí)海腎表達(dá)的劑量依賴性沉默(圖5)。最 主要的，即使相對(duì)低數(shù)量的siRNA-配體綴合物也已經(jīng)顯示相當(dāng)大的效果。
[0135] 其次評(píng)價(jià)了與所述的花生四烯酸乙醇胺-siRNA綴合物相比，所述的葡萄糖修飾的 siRNA的沉默效力。這個(gè)比較的結(jié)果被描述在圖5中。令人驚奇地，所述的新的葡萄糖修飾的 siRNA總是比所述的花生四烯酸乙醇胺體系顯著更有效，其確立葡萄糖和其它糖殘基作為 強(qiáng)大的新的遞送工具。
[0136] 3.使用γ -標(biāo)記的核苷酸的5 ' -RNA標(biāo)記
[0137] 為了在所述的5'-端標(biāo)記RNA-轉(zhuǎn)錄物，首先在39聚體處制備了帶有所述的Τ7啟動(dòng) 子序列的DNA模板，隨后制備了短的編碼的轉(zhuǎn)錄物。這允許不依賴引物的RNA聚合反應(yīng)，其產(chǎn) 生21聚體RNA轉(zhuǎn)錄物。由于所述的聚合酶的從頭初始化，所述的第一次使用的RNA核苷酸在 所述的轉(zhuǎn)錄物中仍然充當(dāng)三磷酸酯，提供了獨(dú)特的5'-糖標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。因?yàn)樗龅?T7RNA聚合酶通常開始于CCn-序列，其產(chǎn)生G-啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄物，采用葡萄糖-標(biāo)記的GTP進(jìn)行所述 的實(shí)驗(yàn)。盡管存在所述的葡萄糖殘基，但是所述的T7-RNA聚合酶接受所述的標(biāo)記的三磷酸 酯并且繼續(xù)所述的轉(zhuǎn)錄加工，以提供所述的期望的葡萄糖標(biāo)記的產(chǎn)物。
[0138] 下列編碼T7啟動(dòng)子序列和21聚體轉(zhuǎn)錄物的編碼和模板鏈?zhǔn)菑腗e tabion購(gòu)買的。
[0139] 編碼：5 ' -dATAATACGACTCACTATAGGC
[0140] 模板：3，-dTATTATGCTGAGTGATATCCGGAAAGTGATGAGGATGGA-5 '
[0141 ] 在轉(zhuǎn)錄之前，在熱循環(huán)儀(來自Eppendorf的Mastercycler Personal)中把所述的 鏈退火。因此，在緩沖液（100mm NaCl，25mm Tris-HCl，pH=7.6,在25°C)中，施加下列溫度 梯度:95°C持續(xù)4分鐘，隨后以2°C/分鐘冷卻到4°C，把20μπι的編碼鏈與20μπι的模板鏈退火。
[0142] 在0.2mL PCR管中以20yL設(shè)置進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)錄緩沖液（40mM HEPES ρΗ = 7.4,6mM MgCl2,2mM，10mM DTT)中，向 40pmol 的所述的雜交的 DNA 模板中添加 400μΜ ATP、 CTP、UTP、20-80yM GTP(對(duì)于所述的對(duì)照，400μΜ)和400μΜ葡萄糖標(biāo)記的GTP 7d。通過添加一 個(gè)單位T7RNA聚合酶(New England Bio labs)啟動(dòng)所述的反應(yīng)，小心地混合，然后在37 °C溫 育。在5個(gè)小時(shí)之后，通過添加一個(gè)體積RNA負(fù)荷染料(47.5 %甲酰胺，0.01 % SDS，0.01 %溴 酚藍(lán)，0.005%二甲苯藍(lán)，0.5mM EDTA)停止所述的轉(zhuǎn)錄，并且在20%變性聚丙烯酰胺凝膠 (7M尿素，3511^，1000￥)上分析2(^1^的每個(gè)樣品，并且使用1^3-3000成像系統(tǒng)（1^7七68〇顯 現(xiàn)。為了顯現(xiàn)RNA轉(zhuǎn)錄物，施加 SYBR綠II染色。
[0143] 4 ·使用T4RNA連接酶的3 ' -RNA標(biāo)記
[0144] 在ATP的存在下，T4RNA連接酶催化胞嘧啶核苷3 '，5 ' -二磷酸向單鏈RNA的3 ' -OH的 轉(zhuǎn)移。
[0145]因此，可以使單鏈RNA分子在T4RNA連接酶和ATP存在下與在磷酸基處攜帶炔部分 的標(biāo)記的胞嘧啶核苷3'，5'_二磷酸反應(yīng)。隨后與疊氮化物修飾的糖殘基的click反應(yīng)(正如 在圖1中顯示的那樣)允許制備3'-修飾的單鏈RNA分子，如圖7中顯示的那樣。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 包含至少一個(gè)糖殘基和至少一個(gè)核苷組分的綴合物在轉(zhuǎn)染細(xì)胞，特別是植物細(xì)胞或 哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人細(xì)胞中的用途。2. 權(quán)利要求1所述的用途，其中在所述的綴合物中，至少一個(gè)糖殘基與至少一個(gè)核苷組 分共價(jià)結(jié)合，或其中所述的綴合物包含至少一個(gè)核苷組分和與其非共價(jià)結(jié)合的糖修飾的部 分。3. 權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述的核苷組分選自核酸、核苷和核苷酸。4. 權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的核苷組分是核酸分子，特別是RNA 分子，例如任選地具有至少一個(gè)3 突出端的單鏈RNA分子或雙鏈RNA分子，更特別地是 siRNA分子。5. 權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的核苷組分是包含至少一個(gè)修飾的 結(jié)構(gòu)單元的核酸分子。6. 權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的核苷組分經(jīng)由核堿基、糖或磷酸 基，特別是存在于核酸分子中的結(jié)構(gòu)單元的核堿基、糖或磷酸基，特別是經(jīng)由存在于核酸分 子中的末端結(jié)構(gòu)單元，與所述的糖殘基相連。7. 權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的糖殘基選自單糖，例如葡萄糖、甘 露糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、巖藻糖或唾液酸，二糖，例如蔗糖、乳糖、海藻糖或麥芽 糖，和線性的、分枝的或環(huán)狀的寡糖，例如環(huán)糊精。8. 權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的綴合物包含： (i) 一個(gè)糖殘基和一個(gè)核苷組分，例如一個(gè)核酸分子， (i i)多個(gè)糖基和一個(gè)核苷組分，例如一個(gè)核酸分子， (i i i) 一個(gè)糖殘基和多個(gè)核苷組分，例如多個(gè)核酸分子，或 (iv)多個(gè)糖殘基和多個(gè)核苷組分，例如多個(gè)核酸分子。9. 權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的綴合物包含糖殘基，其與RNA轉(zhuǎn)錄 物例如mRNA的3 ' -或5 ' -端共價(jià)結(jié)合。10. 權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的糖殘基經(jīng)由接頭與所述的至少一 個(gè)核苷組分或所述的部分共價(jià)結(jié)合。11. 權(quán)利要求10所述的用途，其中所述的接頭包含由Click反應(yīng)形成的環(huán)狀基團(tuán)，特別 是由炔和疊氮化物之間的Click反應(yīng)形成的1，2,3_三唑基團(tuán)，或由降冰片烯和腈亞胺、腈氧 化物或四嗪之間的Click反應(yīng)形成的基團(tuán)。12. 權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的用途，用于在體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞，特別是用于在體外轉(zhuǎn) 染植物細(xì)胞或包括人細(xì)胞在內(nèi)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。13. 權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的用途，用于轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞。14. 權(quán)利要求書1-11中任意一項(xiàng)所定義的綴合物，其用于醫(yī)學(xué)，特別是用于人類醫(yī)學(xué)。15. 權(quán)利要求1-13中任意一項(xiàng)所述的用途或用于權(quán)利要求書14所述的用途的綴合物， 用于下調(diào)基因，例如病毒的基因或與細(xì)胞疾病相關(guān)聯(lián)的基因，例如癌基因或與自身免疫病 相關(guān)聯(lián)的基因。16. 生產(chǎn)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所定義的綴合物的方法，所述的綴合物具有通式 (Ia)或（Ib)，其中糖殘基與RNA分子的3或5端共價(jià)結(jié)合 Fn一(Lm_N'）r ( la) Fn-(Lm_N'）r-Lm-Fn (Ib) 其中 F是糖殘基， L是接頭， Ν'是RNA分子，例如mRNA， m是O或1， η是1-10，優(yōu)選地1-5，更加優(yōu)選地1的整數(shù)， r是1-25,優(yōu)選地2-20以及更優(yōu)選地2-8的整數(shù)， 該方法包括 (i) 使式V的試劑 Fn-(L1)m-(RGl)r (V) 其中 L'是接頭，并且 RGl是反應(yīng)基，特別是Click反應(yīng)基，例如疊氮基， 與至少一種修飾的核酸分子(VII)偶聯(lián) (N，）r-(L，，）m-RG2 (VII) 其中 L"是接頭，并且 RG2是能夠與RGl反應(yīng)的反應(yīng)基，特別是Click反應(yīng)基，例如炔基團(tuán)， 從而形成所述的綴合物，或 (ii) 使通式(V)的試劑與至少一種修飾的核酸結(jié)構(gòu)單元(VIII)偶聯(lián) BB-(Dm-RG2 (VIII) 其中BB是用于合成核酸分子的結(jié)構(gòu)單元，并且 L"是接頭， 并且把已經(jīng)與所述的試劑偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)單元摻入核酸分子中，從而形成所述的綴合物。17.轉(zhuǎn)染細(xì)胞，優(yōu)選地植物細(xì)胞的方法，包括使細(xì)胞暴露于在權(quán)利要求1 -11的任意一項(xiàng) 中所定義的綴合物。
【文檔編號(hào)】C12N15/87GK105899666SQ201580003755
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2015年1月15日
【發(fā)明人】T·卡雷爾
【申請(qǐng)人】巴斯夫歐洲公司