包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的細(xì)菌的檢測和定量方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了提取包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物并對所述微生物數(shù)目進(jìn)行定量的方法。
【專利說明】
包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的細(xì)菌的檢測和定量方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明提供了提取包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物并對所述微生物的數(shù)目進(jìn)行定量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]首次使用口香糖的描述可以追溯到古希臘，在那里人們使用來自于乳香木黃連的樹膠解渴或清新口氣。直至I 9世紀(jì)晚期，第一塊口香糖才成功上市，當(dāng)時人心果樹(Sapodilla)的橡膠狀樹汁形成了口香糖的基礎(chǔ)。在20世紀(jì)晚期，口香糖不僅被視為生活方式的象征，而且已報道了對認(rèn)知表現(xiàn)、心情、警覺和食欲控制的影響。此外，口香糖已更多地向口腔護(hù)理和功能性食品(“營養(yǎng)品”)發(fā)展，因?yàn)樗峁┝丝扇菀椎貞?yīng)用的藥物遞送介質(zhì)，對口腔健康具有潛在益處。高達(dá)每人每年2.5kg的高消費(fèi)率使它成為十億美元的工業(yè)。
[0003]—般來說，口香糖由合成的彈性體如聚乙酸乙烯酯或聚異丁烯的水不溶性混合物構(gòu)成，所述混合物通常被稱為膠基。對膠基材料的重要要求是它們在口腔中不溶解，并且可以被長時間咀嚼而不經(jīng)歷組成變化。在所有可商購的口香糖中，膠基被增補(bǔ)有建構(gòu)劑、軟化劑和調(diào)味劑，同時目前糖經(jīng)常用人造甜味劑例如山梨糖醇、木糖醇或甘露糖醇代替。
[0004]已描述，木糖醇和其他人造甜味劑的包含減少了牙齒上口腔生物膜的形式?？谇簧锬な侨澜缱顝V泛傳播的傳染病、即齲齒和牙周疾病的病因。齲齒由牙釉質(zhì)的天然存在的去礦化和再礦化之間的失衡引起。當(dāng)由于糖被牙齒上口腔生物膜的選定成員發(fā)酵而造成口腔生物膜的PH下降到低于5.5時，發(fā)生去礦化。大多數(shù)人造糖不被或幾乎不被口腔細(xì)菌發(fā)酵，因此不降低pH。此外，口香糖引起增加的咀嚼，其刺激唾液產(chǎn)生，因此提高了口腔中再礦化所需的鈣和磷酸鹽的濃度。已向商品化口香糖添加氟化物，以防止釉質(zhì)去礦化并刺激再礦化。把咀嚼口香糖視為每日口腔衛(wèi)生程序的補(bǔ)充是非常有吸引力的，特別是因?yàn)榇蠖鄶?shù)人多年來不能維持預(yù)防疾病所需的口腔生物膜控制水平。這導(dǎo)致了向口香糖摻入抗微生物劑如氯己定和草藥提取物，并且口香糖事實(shí)上已被證實(shí)成功地阻止口腔生物膜的重新生長。盡管已知阻嚼口香糖幫助移除齒間碎肩(Kakodkar等，Dental Research Journal 7:64-69,2011)并且已向口香糖添加去污劑如多磷酸鹽以提高它們的清潔能力，但不清楚咀嚼口香糖是否實(shí)際上從口腔移除細(xì)菌。特別是，通過口香糖偏好性移除引起疾病的生物體如產(chǎn)酸的變形鏈球菌(Streptococcus mutans)或被視為牙釉質(zhì)的最初定植者的物種，將使口香糖成為每日口腔衛(wèi)生程序的有價值的補(bǔ)充。
[0005]人類口腔含有可變且大量的菌群，胃腸系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的許多疾病可以表現(xiàn)在口腔中。還存在許多特異性針對口腔的疾病。除了細(xì)菌生物體之外，口腔微生物可以包括真菌、原生動物和病毒物種，并且許多這些微生物附著到牙齒、齦溝、舌和頰粘膜。每個位點(diǎn)具有允許細(xì)菌建立其駐留的獨(dú)特方式。每個位點(diǎn)具有允許所述生物體建立其駐留的獨(dú)特方式。許多這些微生物可以附著到它們在口腔中時接觸到的聚合物并被捕獲在所述聚合物中，這些聚合物除了如上所述的口香糖之外還包括牙齒和牙周裝置和組合物。
[0006]因此，對于檢測、鑒定和定量附著到口腔中的聚合物的微生物、例如包含在使用后的口香糖上或口香糖內(nèi)的細(xì)菌的新方法的開發(fā)，存在著需求。
[0007]發(fā)明概述
[0008]已知口香糖有助于維護(hù)口腔健康;然而，不清楚口香糖是否能夠?qū)嶋H上從口腔移除細(xì)菌和其他微生物。本發(fā)明提供了一種用于對在使用(例如體內(nèi)咀嚼、手指揉捏(fingerchewing)或機(jī)器人或人工模擬的咀嚼)后包含在口香糖上和口香糖內(nèi)的微生物進(jìn)行檢測和定量的方法。本文中提供的研究描述了對咀嚼后包含在口香糖上和口香糖內(nèi)的微生物的數(shù)目進(jìn)行定量和定性的方法。
[0009]本發(fā)明提供了檢測和定量包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物的數(shù)目的方法。術(shù)語“包含在……的”是指附著或粘附于所述口香糖的微生物，包括在咀嚼過或手指揉捏過的口香糖內(nèi)或被捕獲在其皺褶中的微生物。
[0010]在本發(fā)明的一種情況下，本發(fā)明提供了檢測包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物的方法，所述方法包括:a)在從所述口香糖移除所述微生物并使所述微生物沉積在懸液中的條件下對所述口香糖進(jìn)行超聲處理，b)在促進(jìn)集落形成的條件下將至少一部分所述懸液與固體支持物相接觸，其中集落在所述固體支持物上的形成表明包含在所述口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物的存在。在這種方法中，可以在超聲處理之前將所述口香糖與哺乳動物的口腔進(jìn)行接觸，例如所述哺乳動物咀嚼所述口香糖，或者將所述微生物附著到哺乳動物口腔外部的口香糖，例如通過如實(shí)施例1中所描述的手指揉捏或通過機(jī)械或機(jī)器人咀嚼模擬器?！肮腆w支持物”是微生物例如細(xì)菌、真菌、原生動物或病毒可以在其中生長的基質(zhì)，例如包含瓊脂或另一種惰性固化劑例如明膠的培養(yǎng)基。
[0011 ]超聲處理是指施加聲能例如超聲以攪動樣品中的粒子的行動，例如對口香糖進(jìn)行超聲處理以移除附著于它的微生物例如細(xì)菌。某些超聲處理器利用直接接觸樣品的探頭?；谒〉某曁幚砥骶哂形挥谒巯路介g接地攪動樣品的超聲波發(fā)生元件。所述超聲處理必須在標(biāo)準(zhǔn)化尺寸下進(jìn)行，例如對使用模具成型成特定形狀的口香糖進(jìn)行超聲處理。所述模具可以是具有標(biāo)準(zhǔn)化尺寸的任何形狀，并且可以是僅僅略微粘附或不粘附口香糖的任何材料，例如聚四氟乙烯(TEFLON)。
[0012]所述檢測包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物的方法還可以包括對包含在咀嚼過的口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物進(jìn)行定量的步驟，其中集落的數(shù)目指示了包含在所述口香糖上和口香糖內(nèi)的微生物的數(shù)量。所述定量可以包括產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線以確定包含在所述口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物的數(shù)量。對口香糖進(jìn)行超聲處理和產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線的組合，允許使用所述口香糖表面上的微生物數(shù)目來外推包含在所述口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物的總數(shù)。
[0013]在本發(fā)明的另一種情況下，本發(fā)明提供了檢測哺乳動物口腔中微生物的存在的方法，所述方法包括:a)在從與哺乳動物口腔發(fā)生接觸的口香糖移除所述微生物并使微生物沉積在懸液中的條件下，對所述口香糖進(jìn)行超聲處理，b)在促進(jìn)集落形成的條件下將至少一部分所述懸液與固體支持物相接觸，其中集落在所述固體支持物上的形成表明在所述哺乳動物的口腔中存在微生物。所述超聲處理可以在標(biāo)準(zhǔn)化尺寸下進(jìn)行，例如對使用模具成型成特定形狀的口香糖進(jìn)行超聲處理。
[0014]所述檢測哺乳動物口腔中微生物的存在的方法還可以包括對包含在所述哺乳動物口腔內(nèi)的微生物進(jìn)行定量的步驟，其中集落的數(shù)目指示了所述哺乳動物口腔內(nèi)的微生物的數(shù)量。所述定量可以包括產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線以確定所述哺乳動物口腔內(nèi)的微生物的數(shù)量。
[0015]在本發(fā)明的另一種情況下，本發(fā)明提供了對包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物進(jìn)行定量的方法，所述方法包括:a)在從所述口香糖移除所述微生物并使所述微生物沉積在懸液中的條件下對所述口香糖進(jìn)行超聲處理，b)在促進(jìn)集落形成的條件下將至少一部分所述懸液與固體支持物相接觸，以及c)對在所述固體支持物上形成的集落進(jìn)行定量，其中所述集落的數(shù)目指示了包含在所述口香糖上和口香糖內(nèi)的微生物的數(shù)量。所述對附著到口香糖的微生物進(jìn)行定量的方法還可以包括產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線以確定附著到所述口香糖的微生物的數(shù)量的步驟。所述超聲處理可以在標(biāo)準(zhǔn)化尺寸下進(jìn)行，例如對使用模具成型成特定形狀的口香糖進(jìn)行超聲處理。
[0016]任何上述方法還可以包括鑒定所述微生物的步驟。這些微生物包括細(xì)菌、病毒、真菌和原生動物。例如，通過本發(fā)明的方法檢測和定量的細(xì)菌包括口腔的病原性或共生性細(xì)菌，例如變形鏈球菌(Streptococcus mutans)、口腔鏈球菌(Streptococcus oralis)、內(nèi)氏放線菌(Actinomyces naeslundii)、血鏈球菌(Streptococcus sanguinis)、牙銀卩卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中間P卜啉單胞菌(Porphyromonas intermedia)、福賽斯擬桿菌(Bacteroides forsythus)、福賽斯坦納菌(TanneraeI la forsythia)、直腸彎曲桿菌(Campylobacterrectus)、纏結(jié)優(yōu)桿菌(Eubacterium nodatum)、微小消化鏈球菌(Peptostreptococcus micros)、中間鏈球菌(Streptococcus intermedius)、伴放線放線桿菌(Aggregetibacter actinomycetemcomitans)、齒垢密螺方定體(Treponemadenticola)、嗤蝕艾肯菌(Eikenella corrodens )、牙銀二氧化碳嗜纖維菌(Capnocytophaga gingivalis)、格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii)、小韋榮球菌(Vei I lone I la parvula)、具核梭桿菌(Fuso bacterium nucleatum)、中間普雷沃菌(Prevotel Iaintermedia)、唾液乳桿菌(Lactobaci I Ius sal ivarius)、唾液鏈球菌(Streptococcus sal ivarius)和遠(yuǎn)緣鏈球菌(Streptococcus sobrinus)。
[0017]此外，任何上述本發(fā)明的方法還可以包括在哺乳動物對象中診斷微生物感染的步驟，其中將所述口香糖與所述對象的口腔進(jìn)行接觸，并且其中包含在所述口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物的存在指示了所述對象中的微生物感染。
[0018]本發(fā)明的另一種情況提供了產(chǎn)生哺乳動物對象口腔的微生物分布情況的方法，所述方法包括:a)將口香糖與所述對象的口腔相接觸，b)檢測在與所述對象的口腔接觸后包含在延展性聚合物上或聚合物內(nèi)的至少一種微生物的存在和不存在，其中至少一種微生物類型的存在或不存在確定了所述對象口腔的微生物分布情況。當(dāng)所述延展性聚合物是口香糖時，所述微生物可以被包含在所述口香糖上或包含在咀嚼過或手指揉捏過的口香糖的皺褶內(nèi)。術(shù)語“微生物類型”取決于鑒定方法，是指微生物的單一科、屬、種、株、血清型或血清群。該微生物可以是細(xì)菌、病毒、真菌或原生動物。所述微生物分布情況可能包含關(guān)于至少一種微生物類型、至少兩種微生物類型、至少5種微生物類型、至少10種微生物類型、至少20種微生物類型、至少50種微生物類型、至少100種微生物類型或至少500種微生物類型的信息。所述分布情況可能包含僅僅一種微生物類型或多種不同的微生物類型。
[0019]具體來說，本發(fā)明提供了“細(xì)菌分布情況”，其包含關(guān)于至少一種細(xì)菌類型、至少兩種細(xì)菌類型、至少5種細(xì)菌類型、至少10種細(xì)菌類型、至少20種細(xì)菌類型、至少50種細(xì)菌類型、至少100種細(xì)菌類型或至少500種細(xì)菌類型的信息。
[0020]本發(fā)明還提供了病毒分布情況，其包含關(guān)于至少一種病毒類型、至少兩種病毒類型、至少5種病毒類型、至少10種病毒類型、至少20種病毒類型、至少50種病毒類型、至少100種病毒類型和至少500種病毒類型的信息。
[0021]另外，本發(fā)明提供了微生物分布情況，其包含關(guān)于至少一種真菌類型(真菌分布情況)、至少兩種真菌類型、至少5種真菌類型、至少10種真菌類型、至少20種真菌類型、至少50種真菌類型、至少100種真菌類型或至少500種真菌類型的信息。
[0022]另外，本發(fā)明提供了微生物分布情況，其包含關(guān)于至少一種原生動物類型(原生動物分布情況)、至少兩種原生動物類型、至少5種原生動物類型、至少10種原生動物類型、至少20種原生動物類型、至少50種原生動物類型、至少100種原生動物類型或至少500種原生動物類型的信息。
[0023]這些方法還可以任選地包括將所述哺乳動物對象的微生物分布情況與參比微生物分布情況進(jìn)行比較的步驟，其中所述參比分布情況指示了對口腔的疾病、障礙或病癥的增加的易感性，以及對所述微生物分布情況進(jìn)行評分，以確定所述對象是否對口腔疾病或障礙具有增加的易感性的步驟。此外，這些方法可以任選地包括對包含在所述口香糖上和口香糖內(nèi)的微生物進(jìn)行定量的步驟。
[0024]術(shù)語“微生物分布情況”是指至少一種類型的微生物的存在或不存在，所述微生物至少被部分鑒定或表征，以便可以監(jiān)測任何特定樣品中所述微生物的存在或不存在。術(shù)語“微生物分布情況”包括細(xì)菌分布情況、病毒分布情況、原生動物分布情況和真菌分布情況及其組合。術(shù)語“參比微生物分布情況”是指為已知對照或標(biāo)準(zhǔn)樣品產(chǎn)生的微生物分布情況，例如已知對口腔疾病、障礙或病癥具有提高的易感性的對象的參比分布情況。例如，所述微生物分布情況可能包含一種或多種類型的細(xì)菌、一種或多種類型的真菌、一種或多種類型的原生動物或一種或多種類型的病毒。此外，所述微生物分布情況可能包含微生物的組合，例如一種或多種類型的細(xì)菌、病毒、真菌和/或原生動物。
[0025]當(dāng)參比分布情況中的一種或多種微生物存在于對象的微生物分布情況中時，所述對象的微生物分布情況與所述參比細(xì)菌分布情況相關(guān)。為了確定對象微生物分布情況是否與參比微生物分布情況相關(guān)，對所述分布情況進(jìn)行評分以將所述對象微生物分布情況與所述參比分布情況進(jìn)行比較。
[0026]術(shù)語“細(xì)菌分布情況”是指至少一種類型的細(xì)菌的存在或不存在，所述細(xì)菌至少被部分鑒定或表征，以便可以監(jiān)測任何特定樣品中所述細(xì)菌的存在或不存在。術(shù)語“參比細(xì)菌分布情況”是指為已知對照或標(biāo)準(zhǔn)樣品產(chǎn)生的細(xì)菌分布情況，例如已知對口腔疾病、障礙或病癥具有提高的易感性的對象的參比分布情況。
[0027]當(dāng)參比分布情況中的一種或多種細(xì)菌存在于對象的細(xì)菌分布情況中時，所述對象的細(xì)菌分布情況與所述參比細(xì)菌分布情況相關(guān)。為了確定對象細(xì)菌分布情況是否與參比細(xì)菌分布情況相關(guān)，對所述分布情況進(jìn)行評分以將所述對象微生物分布情況與所述參比分布情況進(jìn)行比較。
[0028]產(chǎn)生細(xì)菌分布情況的方法可能檢測一種或多種類型的細(xì)菌。例如，被檢測以產(chǎn)生細(xì)菌分布情況下的細(xì)菌包括變形鏈球菌(S t r e P t ο c ο c c u s mutans)、口腔鏈球菌(Streptococcus ora I i s )、內(nèi)氏放線菌(Ac t inomy ce s nae s I und i i )、血鏈球菌(Streptococcus sanguinis)、牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中間P卜啉單胞菌(Porphyromonas intermedia)、福賽斯擬桿菌(Bacteroides forsythus)、福賽斯坦納菌(Tannerael la forsythia)、直腸彎曲桿菌(Campylobacter rectus )、纏結(jié)優(yōu)桿菌(Eubacterium nodatum)、微小消化鏈球菌(Peptostreptococcus micros)、中間鏈球菌(Streptococcus intermedius )、伴放線放線桿菌(Aggregetibacteractinomycetemcomitans)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola)、乳桿菌(Lactobacillus)、嗤蝕艾肯菌(Eikenella corrodens )、牙銀二氧化碳嗜纖維菌(Capnocytophaga gingivalis)、格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii)、小韋榮球菌(Ve i Ilonel la parvula)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)和遠(yuǎn)緣鏈球菌(Streptococcus sobrinus)等。
[0029]此外，本發(fā)明的任何微生物分布情況可用于確定對象對發(fā)生疾病、病癥或障礙的易感性，所述疾病、病癥或障礙例如慢性牙周炎、急性成人牙周炎、牙齦炎例如急性壞死潰瘍性牙齦炎、奮森氏咽峽炎(戰(zhàn)壕口炎)、齲齒、皰疹病毒感染、原發(fā)性皰疹性齦口炎或口腔皰疹(唇皰疹和口瘡)、生殖器皰疹、水痘-帶狀皰疹病毒感染例如水痘或帶狀皰疹、流感、普通感冒、性病、單核細(xì)胞增多癥、柯薩奇病毒感染例如手足口病、皰疹性咽峽炎、急性淋巴結(jié)性咽炎、流行性腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹(德國麻疹)、非洲伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、口腔毛狀白斑、幼兒急疹、卡波斯肉瘤、念珠菌病、急性假膜型念珠菌口炎(鵝口瘡)、急性萎縮性(紅斑型)念珠菌病、慢性增生性念珠菌病、慢性萎縮性(紅斑型)念珠菌病、曲霉病、隱球菌病、組織胞漿菌病、芽生菌病、副球孢子菌病和接合菌病(毛霉菌病)。
[0030]另一方面，本發(fā)明提供了用于執(zhí)行任何前面本文中描述的方法的試劑盒。具體來說，本發(fā)明提供了用于對包含在咀嚼過的口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物進(jìn)行檢測或定量或用于產(chǎn)生哺乳動物對象中的細(xì)菌分布情況的試劑盒。
【附圖說明】
[0031]圖1提供了用于實(shí)施例1中描述的手指揉捏過的口香糖的校準(zhǔn)曲線。所述曲線描繪了在手指揉捏后收回的細(xì)菌的量，被表示成隨著手指揉捏進(jìn)的細(xì)菌的起始量的變化。
[0032]圖2提供了被捕獲在口香糖中的細(xì)菌數(shù)目隨時間的變化，所述細(xì)菌數(shù)目用使用校準(zhǔn)曲線確定的集落形成單位(CFU;對數(shù)單位)表示。詳細(xì)描述
[0033]本發(fā)明提供了使用超聲處理從咀嚼過的口香糖移除微生物，以檢測和定量包含在所述口香糖上或捕獲在口香糖內(nèi)的微生物例如細(xì)菌的方法。術(shù)語“包含在……的”是指附著于或粘附于所述口香糖的微生物，包括在咀嚼過或手指揉捏過的口香糖內(nèi)或捕獲在所述口香糖的皺褶中的微生物。具體來說，本發(fā)明提供了檢測和定量包含在咀嚼過的口香糖上和所述口香糖內(nèi)的細(xì)菌的方法，所述方法使用超聲處理從所述口香糖移除所述細(xì)菌，并在促進(jìn)集落生長的條件下將所述細(xì)菌沉積在固體支持物上，其中細(xì)菌集落在所述固體支持物上的形成表明包含在所述口香糖上或口香糖內(nèi)的細(xì)菌的存在。形成的集落數(shù)目允許產(chǎn)生如實(shí)施例I中所述的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線。這種方法不依賴于細(xì)菌類型或試驗(yàn)的口香糖類型，始終如一地確定包含在口香糖上和口香糖內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目。由于超聲處理只能釋放附著于口香糖表面的細(xì)菌，因此收回的細(xì)菌數(shù)目比咀嚼進(jìn)入的細(xì)菌數(shù)目低大約I個對數(shù)單位。
[0034]校準(zhǔn)曲線的使用允許計算包含在口香糖上或包含在口香糖內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目。具體來說，對口香糖進(jìn)行超聲處理和產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線的組合允許使用口香糖表面上的微生物數(shù)目來外推包含在口香糖上和口香糖內(nèi)的微生物的總數(shù)。產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線的一種方法是對口香糖進(jìn)行超聲處理，其中所述口香糖具有標(biāo)準(zhǔn)化尺寸，例如使用模具造型成特定形狀的口香糖。這種模具為給定重量的口香糖提供固定的表面積，使得附著于口香糖表面的微生物的數(shù)目將充當(dāng)計算口香糖體積內(nèi)的微生物數(shù)目的手段。
[0035]所述模具可以是具有標(biāo)準(zhǔn)化尺寸的任何形狀，例如所述模具是尺寸為15x15x4mm的長方形或尺寸為12mm3的立方體。所述模具可以是任何材料，例如也被稱為TEFLON或DYNEON的聚四氟乙烯(PTFE)，也被稱為KYNAR、HYLAR和SOLEF的聚偏氟乙烯(PVDF)，也被稱為DELRIN、CELCON、DURAC0N和H0STAF0RM的聚甲醛(POM )，也被稱為TEFZEL的乙烯四氟乙烯(ETFE)，也被稱為TORLON的聚酰胺-酰亞胺，全氟烷氧基(PFA)或氟化的乙烯丙烯(FEP)。
[0036]校準(zhǔn)方法的一致性是令人吃驚的，并且不論包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的細(xì)菌類型如何都允許準(zhǔn)確的試驗(yàn)。例如，實(shí)施例1中描述的實(shí)驗(yàn)使用體外手指揉捏方法。本發(fā)明還設(shè)想了使用人工或機(jī)器人咀嚼模擬器執(zhí)行本發(fā)明，它們重現(xiàn)在咀嚼期間執(zhí)行的下頌運(yùn)動。手指揉捏實(shí)驗(yàn)表明收回的細(xì)菌比實(shí)際上咀嚼進(jìn)去的細(xì)菌少約I個對數(shù)單位。盡管回收率低，但其說明了在手指揉捏過程中損失的細(xì)菌數(shù)目，絕大多數(shù)仍被捕獲在口香糖嚼團(tuán)中。校準(zhǔn)曲線說明了這些損失，并使被捕獲的細(xì)菌量的估算更加準(zhǔn)確。此外，本發(fā)明的方法僅僅對可培養(yǎng)的活微生物進(jìn)行計數(shù)?；厥章实囊恢滦苑浅８?，例如對于廣范圍的濃度一致地觀察到細(xì)菌從口香糖的10%回收。在本文描述的實(shí)驗(yàn)中，桿狀的內(nèi)氏放線菌(A.naeslundii)表現(xiàn)出比球狀菌株更高的損失，這可能可以歸因于粘附性質(zhì)的差異，因?yàn)閮?nèi)氏放線菌(A.naeslundii)是已知對表面具有強(qiáng)粘附性的細(xì)菌。當(dāng)口香糖接觸哺乳動物的口腔時，微生物例如細(xì)菌粘附于口香糖。因此，本發(fā)明的方法可用于檢測哺乳動物口腔中微生物的存在?？谇恢心承┪⑸锢缂?xì)菌的存在的知識，可用于診斷口腔的感染或其他疾病或障礙。此外，口腔中某些微生物例如某些細(xì)菌的存在，可以允許確定哺乳動物發(fā)生口腔的傳染疾病或障礙的風(fēng)險或易感性。
[0037]口香糖
[0038]口香糖通常由不溶于水的膠基、水溶性部分和調(diào)味劑構(gòu)成。在咀嚼期間，經(jīng)過一段時間，所述水溶性部分隨著一部分口香糖的調(diào)味劑消散。所述膠基部分在整個咀嚼過程中保留在口中。
[0039]所述不溶性膠基通常包含彈性體、樹脂、脂肪和油、軟化劑和無機(jī)填充劑。所述膠基可能包括或者也可能不包括蠟。所述不溶性膠基可以占口香糖重量的約5%至約95%，更通常地，所述膠基占所述口香糖的10 %至約50 %，并且在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，占所述口香糖重量的約25%至約35 %。
[0040]例如，本發(fā)明的口香糖膠基含有約20 %至約60重量%的合成彈性體、約O %至約30重量%的天然彈性體、約5 %至約55重量%的彈性體增塑劑、約4 %至約35重量%的填充劑、約5%至約35重量％的軟化劑和任選的少量(約I重量％或更少)混雜成分例如著色劑、抗氧化劑等。
[0041]合成彈性體可以包括但不限于凝膠滲透層析(GPC)重均分子量為約10，000至約95，000的聚異丁烯、異丁烯-異戊二烯共聚物(丁基彈性體)、苯乙烯-丁二烯、苯乙烯-丁二烯比率為約1:3至約3:1的共聚物、GPC重均分子量為約2,000至約90,000的聚乙酸乙烯酯、聚異戊二烯、聚乙烯、月桂酸乙烯酯含量為共聚物的約5%至約50重量％的乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物，及其組合。
[0042]聚異丁烯的優(yōu)選范圍為50,000至80，000GPC重均分子量，苯乙烯-丁二烯的優(yōu)選范圍為1:1至1:3范圍的苯乙烯-丁二烯，聚乙酸乙烯酯的優(yōu)選范圍為10，000至65，00068(:重均分子量，更高分子量的聚乙酸乙烯酯通常用于泡泡糖膠基中，乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯的優(yōu)選范圍為10-45%的月桂酸乙烯酯含量。
[0043]天然彈性體可以包括天然橡膠例如煙熏過的或液體乳膠和銀菊膠，以及天然樹膠例如節(jié)路頓膠、lechi casp1、perillo、索馬膠、二齒鐵線子膠、巧克力鐵線子膠、nispero、rosindinha、糖膠樹膠、馬來乳膠(gutta hang kang)及其組合。優(yōu)選的合成彈性體和天然彈性體濃度隨著在其中使用所述膠基的口香糖是粘附型還是常規(guī)型、是泡泡糖還是普通口香糖而變，正如下面討論的。優(yōu)選的天然彈性體包括節(jié)路頓膠、糖膠樹膠、索馬膠和二齒鐵線子膠。
[0044]彈性體增塑劑可以包括但不限于天然的松香酯如部分加氫松香的甘油酯、聚合松香的甘油酯、部分二聚松香的甘油酯、松香的甘油酯、部分加氫松香的季戊四醇酯、松香的甲酯和部分氫化的甲酯、松香的季戊四醇酯，合成物質(zhì)例如源自于蒎烯、β_蒎烯和/或d-檸檬烯的萜烯樹脂，以及上述物質(zhì)的任何適合的組合。優(yōu)選的彈性體增塑劑也將隨著具體應(yīng)用和使用的彈性體類型而變。
[0045]填充劑/調(diào)質(zhì)劑可以包括碳酸鎂和碳酸鈣、碎石灰、硅酸鹽類型例如硅酸鎂和硅酸鋁、粘土、氧化鋁、滑石、鈦氧化物、磷酸單鈣、二鈣和三鈣、纖維素聚合物如木材及其組合。
[0046]軟化劑/乳化劑可以包括動物脂、氫化動物脂、氫化和部分氫化的植物油、可可脂、單硬脂酸甘油酯、三乙酸甘油酯、卵磷脂、甘油單酯、二酯和三酯、乙?；母视蛦熙?、脂肪酸(例如硬脂酸、棕櫚酸、油酸、油酸、亞油酸)及其組合。著色劑和增白劑可以包括ro&c類型的染料和色淀、水果和蔬菜提取物、二氧化鈦及其組合。膠基可以包括或者也可以不包括蠟。
[0047]除了水不溶性膠基部分之外，典型的口香糖組合物包括水溶性增量部分和一種或多種調(diào)味劑。所述水溶性部分可以包括增量甜味劑、高強(qiáng)度甜味劑、調(diào)味劑、軟化劑、乳化劑、著色劑、酸化劑、填充劑、抗氧化劑和提供所需屬性的其他組分。
[0048]向口香糖添加軟化劑以便優(yōu)化口香糖的咀嚼性能和口感。也被稱為增塑劑和塑化劑的軟化劑一般占所述口香糖的約0.5%至約15重量％之間。軟化劑可以包括甘油、卵磷脂及其組合。甜味劑水性溶液例如含有山梨糖醇、氫化淀粉水解物、玉米糖漿及其組合的水性溶液，也可以在口香糖中用作軟化劑和粘合劑。
[0049]增量甜味劑包括糖和無糖組分兩者。增量甜味劑通常占所述口香糖的約5%至約95重量％，更通常為所述口香糖的約20%至約80重量％，更通常為約30%至約60重量％。糖類甜味劑通常包括口香糖技術(shù)領(lǐng)域中公知的含糖組分，包括但不限于單獨(dú)或組合的蔗糖、右旋糖、麥芽糖、糊精、干的轉(zhuǎn)化糖、果糖、左旋糖、半乳糖、玉米漿固形物等。無糖甜味劑包括但不限于糖醇例如單獨(dú)或組合的山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、氫化淀粉水解物、麥芽糖醇等。
[0050]高強(qiáng)度甜味劑也可以單獨(dú)或與上述甜味劑組合使用。優(yōu)選的甜味劑包括但不限于單獨(dú)或組合的三氯蔗糖、阿斯巴甜、安賽蜜的鹽、阿力甜、糖精及其鹽、環(huán)拉酸及其鹽、甘草酸(glycerrhizinate)、二氫查爾酮、奇異果甜蛋白、羅漢果、應(yīng)樂果甜蛋白、甜葉菊及其糖苷等。為了提供持續(xù)時間更長的甜味和香味感覺，可能希望囊封或以其他方式控制至少一部分人造甜味劑的釋放。諸如濕法成粒、蠟法成粒、噴霧干燥、噴霧激冷、流化床包衣、凝聚和纖維延伸的技術(shù)，可用于實(shí)現(xiàn)所需的釋放特性。
[0051]糖和/或無糖甜味劑的組合可用于口香糖中。此外，軟化劑也可能提供額外的甜味，例如使用糖或糖醇的水性溶液。
[0052]本發(fā)明提供了檢測包含在在活生物體中可延展的聚合物上或所述聚合物內(nèi)的微生物的檢測方法。此外，本發(fā)明提供了確定來自于活生物體的唾液樣品的微生物分布情況的方法。唾液樣品的微生物分布情況可用于確定所述生物體對發(fā)生齲齒或牙周疾病的易感性或風(fēng)險，不論所述微生物目前是否正引起感染。此外，本發(fā)明的方法可用于質(zhì)量控制方法，以確定聚合物對微生物的附著或捕獲是易感還是有抗性。
[0053]微生物
[0054]本發(fā)明提供了檢測、鑒定和定量包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物的方法。術(shù)語“微生物類型”取決于鑒定方法，是指特定微生物的單一科、屬、種、株、血清型或血清群。
[0055]“微生物”是指微觀生物體，其可以是單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體，并且對宿主生物體來說可以是病原性或共生的。本發(fā)明提供了檢測和定量包含在在活生物體中可延展的聚合物上和所述聚合物內(nèi)的微生物的方法，并且這些微生物包括細(xì)菌、病毒、真菌和原生動物。
[0056]例如，本發(fā)明提供了檢測、鑒定和定量包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的細(xì)菌的方法。術(shù)語“細(xì)菌類型”取決于鑒定方法，是指細(xì)菌的單一科、屬、種、株、血清型或血清群。
[0057]所述細(xì)菌可以是革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì)菌，并且可以是厭氧或好氧細(xì)菌。所述細(xì)菌可以是球菌(球形)或桿菌(桿狀)。本發(fā)明特別設(shè)想了檢測口腔細(xì)菌例如共生性口腔細(xì)菌和病原性口腔細(xì)菌的方法，所述細(xì)菌例如鏈球菌(strep toco cci)、乳桿菌(Iactobacilli )、葡萄球菌(staphylococci)、棒狀桿菌(corynebacteria)、放線菌(actinomcyes sp.)、梭桿菌(fusobacterium sp.)和各種不同的厭氧菌特別是擬桿菌(bacteroides)。示例性的口腔細(xì)菌包括變形鏈球菌(Streptococcus mutans)、口腔鏈球菌(Streptococcus oralis)、唾液鏈球菌(Streptococcus sal i varius)、內(nèi)氏放線菌(Actinomyces naeslundii )、血鏈球菌(Streptococcus sanguinis)、牙銀卩卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中間P卜啉單胞菌(Porphyromonas intermedia)、福賽斯擬桿菌(Bacteroides forsythus)、坦納菌(Tanneraella)。
[0058]本發(fā)明還提供了檢測、鑒定和定量附著于口香糖的病毒的方法。術(shù)語“病毒類型”取決于鑒定方法，是指病毒的單一科、屬、種、株、血清型或血清群。
[0059]所述病毒可以是皰疹病毒科的成員例如人皰疹病毒(HHV)，包括HHV-1 (也被稱為單純性皰疹病毒(HSV)-1)、HHV-2(HSV-2)、HHV-3(也被稱為水痘-帶狀皰疹病毒)、HHV-4(Epstein-Barr病毒)、HHV_5(細(xì)胞肥大病毒)、HHV-6、HHV_7和HHV-8。
[0060]所述病毒可以是小RNA病毒科(腸病毒屬)的成員，例如脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒A組、柯薩奇病毒B組、?？刹《尽＞唧w來說，所述病毒可能引起手足口病例如柯薩奇病毒八16^5)7^10、82和85，引起皰疹性咽峽炎的病毒例如柯薩奇病毒41-6^8^10和422，以及腸病毒(Enterovirus)71(EV_71) ο
[0061]所述病毒可以是乳多空病毒科的成員，例如人乳頭瘤病毒家族(HPV)，包括HPV-16、HPV-18、HPV-33和HPV-35。所述病毒可以是副粘病毒科(腮腺炎病毒屬)的成員，例如流行性腮腺炎病毒、新城疫病毒、人副流感病毒2、4a和4b型。所述病毒可以是副粘病毒科(麻疹病毒屬)的成員。此外，所述病毒可以是披膜病毒科(風(fēng)疹病毒屬)的成員。所述病毒也可以是犬口腔乳頭瘤病毒、貓杯狀病毒和貓皰疹病毒。
[0062]所述病毒也可以是流感病毒例如人流感病毒A例如HlNl和H3N3、人流感病毒B和人流感病毒C。所述病毒可以是引起普通感冒的病毒例如鼻病毒。
[0063]某些皰疹病毒(單純性皰疹和水痘-帶狀皰疹病毒，水痘和帶狀皰疹的病因)是牙齦炎的已知病因。其他皰疹病毒(細(xì)胞肥大病毒和Epstein-Barr)也可能在某些類型的牙周疾病、包括侵襲性和嚴(yán)重慢性牙周疾病的發(fā)生或發(fā)展中發(fā)揮作用。所有皰疹病毒經(jīng)歷活動期，隨后是潛伏期，并可能重新激活。這些病毒可能以不同方式引起牙周疾病，包括釋放出組織破壞性細(xì)胞因子、牙周細(xì)菌的過度生長、抑制免疫因子和啟動導(dǎo)致細(xì)胞死亡的其他疾病過程。
[0064]本發(fā)明還提供了檢測、鑒定和定量附著于口香糖的真菌的方法。術(shù)語“真菌類型”取決于鑒定方法，是指真菌的單一科、屬、種、株、血清型或血清群。
[0065]本發(fā)明的方法可以檢測真菌例如假絲酵母如白假絲酵母(Candida albicans)、曲霉(Aspergillus)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隱球菌(Cryptococcusgattii)、莢膜組織胞楽菌(Histoplasma capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis )、巴西副球抱子菌(Paracoccid1ides brasiI iensis)、粗球抱子菌(Coccid1de simmites)和接合菌類(Zygomycota)。
[0066]本發(fā)明提供了檢測、鑒定和定量附著于口香糖的原生動物的方法。術(shù)語“原生動物類型”取決于鑒定方法，是指原生動物的單一科、屬、種、株、血清型或血清群。
[0067]本發(fā)明的方法可以檢測原生動物例如齒銀內(nèi)阿米巴(Entamoeba gingival is)和口腔毛滴蟲(Trichomonas tenax) ο
[0068]本發(fā)明設(shè)想了檢測引起口腔疾病和障礙或與口腔疾病和障礙相關(guān)的微生物，所述口腔疾病和障礙例如牙周疾病(牙齦組織的炎癥或感染)例如慢性牙周炎和急性成人牙周炎、牙齦炎例如急性壞死潰瘍性牙齦炎、奮森氏咽峽炎、齲齒、皰疹病毒感染、原發(fā)性皰疹性齦口炎或口腔皰疹(唇皰疹和口瘡)、生殖器皰疹、水痘-帶狀皰疹病毒感染例如水痘或帶狀皰疹、流感、普通感冒、性病、單核細(xì)胞增多癥、柯薩奇病毒感染例如手足口病、皰疹性咽峽炎、急性淋巴結(jié)性咽炎、流行性腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹(德國麻疹)、非洲伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、口腔毛狀白斑、幼兒急疹、卡波斯肉瘤、念珠菌病、急性假膜型念珠菌口炎(鵝口瘡)、急性萎縮性(紅斑型)念珠菌病、慢性增生性念珠菌病和慢性萎縮性(紅斑型)念珠菌病、曲霉病、隱球菌病、組織胞漿菌病(也被稱為巖洞病、達(dá)林氏病、俄亥俄山谷病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖、3?6111111?^、肺病和0&￥紅’8病)、芽生菌病(也被稱為北美芽生菌病、芽生菌性皮炎和吉耳克里斯特氏病)、副球孢子菌病(也被稱為巴西芽生菌病、南美芽生菌病、Lutz-Splendore-de Almeida病和副球孢子菌肉芽腫)、毛霉菌病(毛霉菌感染后)、藻菌病(藻菌感染后)和蛙糞霉病(蛙糞霉感染后)和接合菌病(毛霉菌病)。本發(fā)明還提供了由包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物的存在引起或與其相關(guān)的任何病癥、疾病或障礙的診斷方法。
[0069]微生物集落
[0070]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法包括將微生物例如細(xì)菌、病毒、原生動物或真菌的懸液沉積在固體支持物例如包含瓊脂或另一種惰性固化劑例如明膠的培養(yǎng)基上。固化程度也可以改變，其中優(yōu)選僵硬的瓊脂以抑制“群涌(swarming)”，半固體或“稀松”的瓊脂被用于觀察其他特征。在使用前，這些培養(yǎng)基優(yōu)選是無菌的。
[0071]所述固體支持物可以是包含固體培養(yǎng)基的斜面培養(yǎng)皿、穩(wěn)定培養(yǎng)皿或皮氏培養(yǎng)皿。所述固體培養(yǎng)基具有的物理結(jié)構(gòu)允許細(xì)菌以在物理上提供信息或有用的方式生長例如生長成集落或條紋。術(shù)語“集落”是指生長在固體培養(yǎng)基上或固體培養(yǎng)基中的細(xì)胞或生物體的堆或團(tuán)。本發(fā)明設(shè)想了所述固體培養(yǎng)基可以包含色度指示劑，是選擇性培養(yǎng)基或鑒別培養(yǎng)基。
[0072]在本發(fā)明中使用的營養(yǎng)培養(yǎng)基是適合于細(xì)菌生長、維持、儲存、分化、分離和/或鑒定的任何液體或固體制備物。這些培養(yǎng)基包括用于起始培養(yǎng)(或傳代培養(yǎng))、用于富集或用于各種不同生物體的診斷(鑒定)試驗(yàn)的培養(yǎng)基。這些試驗(yàn)是可以從給定生物體在特定培養(yǎng)基中或培養(yǎng)基上生長的特性推演出它的身份的試驗(yàn)。
[0073]選擇性培養(yǎng)基是指被設(shè)計用于抑制某些微生物的生長并在同時允許其他微生物生長的培養(yǎng)基。例如，MacConkey瓊脂針對革蘭氏陽性細(xì)菌進(jìn)行選擇，曙紅-亞甲基藍(lán)瓊脂針對革蘭氏陽性細(xì)菌進(jìn)行選擇，并且苯乙醇瓊脂針對革蘭氏陰性細(xì)菌進(jìn)行選擇。鑒別培養(yǎng)基允許超過一種目標(biāo)微生物生長，但具有形態(tài)上可辨別的集落。例如，甘露糖醇鹽類瓊脂(甘露糖醇發(fā)酵=黃色)，血瓊脂(各種不同類型的溶血)，MacConkey瓊脂(乳糖發(fā)酵=黃色)和曙紅-亞甲基藍(lán)瓊脂(各種不同類型的差異化)。
[0074]對于厭氧細(xì)菌來說，培養(yǎng)需要在培養(yǎng)基表面上方不含氧氣，并且培養(yǎng)基不含溶解氧。即使在這些條件下，一些厭氧菌也可能不生長，除非培養(yǎng)基已被預(yù)先還原，即平衡在特定氧化還原電位處或更低。因此，還原劑，例如含有巰基的還原劑(例如H2S、半胱氨酸、巰基乙醇酸鹽)也可以被包含在培養(yǎng)基組成中。通?？色@得的適合用于厭氧菌的選擇性生長的培養(yǎng)基的實(shí)例描述在本發(fā)明中，包括但不限于腦心浸液、布魯氏菌培養(yǎng)基、CDC厭氧菌培養(yǎng)基、Nutrient、Schaedler、巰基乙醇酸鹽培養(yǎng)基或胰酪胨大豆培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基具有肉湯或瓊脂兩種形式。
[0075]此外，可以在厭氧罐、厭氧室或厭氧袋中將培養(yǎng)基制造成厭氧的。厭氧罐是用于在不存在氧的情況下或總的來說在非大氣的氣態(tài)條件下對材料(例如接種的培養(yǎng)基)進(jìn)行溫育的容器。通常已知的這些厭氧罐使用“布魯爾厭氧罐”、“Gaspak”、“McIntosh和FiIde’s厭氧Si”等的名稱。
[0076]將所述培養(yǎng)基用從口香糖移除的細(xì)菌的懸液樣品接種。在接種培養(yǎng)基或施加到固體支持物之前，可以將所述懸液稀釋。在某些實(shí)施方式中，所述樣品可以被連續(xù)稀釋，并將連續(xù)稀釋液用于接種多個培養(yǎng)基，以便獲得原始樣品中細(xì)菌的更精確計數(shù)。
[0077]在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述方法包括生長從所述口香糖移除的細(xì)菌，并且可以用從所述口香糖移除的細(xì)菌的稀釋的懸液接種肉湯培養(yǎng)基。肉湯培養(yǎng)基是指缺少固化基質(zhì)的培養(yǎng)基。將接種的培養(yǎng)基在允許細(xì)菌生長的條件下溫育。所述肉湯培養(yǎng)基可能允許檢測培養(yǎng)基的類型。例如，所述培養(yǎng)基包含色度指示劑、選擇培養(yǎng)基或分化的細(xì)菌。
[0078]在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方式中，可以計數(shù)樣品中存在的微生物的數(shù)目。例如，人們可以通過選擇允許集落形成的培養(yǎng)基形式來計數(shù)樣品中的細(xì)菌數(shù)目。在接種培養(yǎng)基并在允許細(xì)菌集落形成的條件下溫育后，可以對集落進(jìn)行計數(shù)。可以通過對由細(xì)菌產(chǎn)生的磷酸酶與指示劑的反應(yīng)產(chǎn)生的可檢測信號進(jìn)行計數(shù)，來計數(shù)集落。在使用磷酸酶底物指示劑5-溴-6-氯-3-B引噪基磷酸酯或6-氯-3-B引噪基磷酸酯的實(shí)施方式中，所述可檢測信號可以包括紅色至紅紫色集落。因此，在某些實(shí)施方式中，微生物的計數(shù)包括在磷酸酯條件下只計數(shù)特定顏色的集落例如紅色至紅紫色集落。適合的可檢測信號包括但不限于化學(xué)發(fā)光信號、熒光信號或電導(dǎo)性的變化。在某些實(shí)施方式中，可檢測信號的檢測可以手動實(shí)現(xiàn)，而在其他實(shí)施方式中，可檢測信號的檢測可能需要本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的特殊檢測儀器。用于計數(shù)特定樣品中的微生物的方法可能至少部分依賴于在本發(fā)明的方法中使用的可檢測信號的類型。
[0079]除了對從口香糖移除的微生物進(jìn)行定量之外，本發(fā)明的方法還可用于鑒定所述從口香糖移除的微生物。所述鑒定可以根據(jù)基于形態(tài)和代謝特征的分類原則。可以分析集落形態(tài)以鑒定從所述口香糖移除的細(xì)菌的類型。術(shù)語“集落形態(tài)”是指集落的視覺特征。外觀有差異的集落通常是不同的細(xì)菌科、屬、種、株、血清型或血清群。集落形態(tài)在集落形狀、邊緣、顏色、表面特點(diǎn)、高度、透光性或色素沉著等的基礎(chǔ)上進(jìn)行評估。
[0080]本領(lǐng)域中已知許多不同試驗(yàn)可以辨別微生物。用于鑒定已知細(xì)菌的特定基因或基因區(qū)段的分子生物學(xué)技術(shù)包括PCR、Northern印跡法、常規(guī)和脈沖場Southern印跡法、變性梯度凝膠電泳、微陣列、狹線印跡法或斑點(diǎn)印跡法，其使用特異性針對特定科、屬、種、株、血清型或血清群的多核苷酸序列。
[0081]例如，確定細(xì)菌基因組內(nèi)16SrRNA和其他區(qū)域的序列，可用于鑒定細(xì)菌類型。分析化學(xué)技術(shù)例如確定脂肪酸分布情況、糖類分布情況和泛醌分布情況、分泌的代謝產(chǎn)物例如揮發(fā)性醇類和短鏈脂肪酸的表征，也可用于鑒定細(xì)菌的類型。
[0082]在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述方法包括將病毒的懸液沉積在成片的細(xì)胞單層上，所述細(xì)胞單層附著在如上所述的固體支持物內(nèi)，例如包含瓊脂、羧甲基纖維素或另一種惰性固化劑例如明膠的培養(yǎng)基。病毒的集落也被稱為“病毒噬斑”。當(dāng)病毒感染固定的單層內(nèi)的細(xì)胞時，形成病毒噬斑。所述病毒裂解所述細(xì)胞，感染將蔓延到其他細(xì)胞。被感染的細(xì)胞產(chǎn)生可以使用顯微鏡直觀觀察到的噬斑。用于確定病毒量的測定法在本領(lǐng)域中是公知的，例如利用免疫熒光、比色測量、蛋白質(zhì)和血凝的測定法，參見例如Kau f man&Kab elitz,Methods of Microb1logy Vol.32,Immunology of Infect1n,Academic Press,2002。
[0083]除了對從口香糖移除的病毒進(jìn)行定量之外，本發(fā)明的方法可用于鑒定所述從口香糖移除的病毒。所述鑒定可以基于用于鑒定已知病毒的特定基因或基因區(qū)段的分子生物學(xué)技術(shù)，包括PCR、Northern印跡法、常規(guī)和脈沖場Southern印跡法、變性梯度凝膠電泳、微陣列、狹線印跡法或斑點(diǎn)印跡法，其使用特異性針對特定科、屬、種、株、血清型或血清群的多核苷酸序列。顯微術(shù)也可用于鑒定所述病毒的形態(tài)特征，例如觀察所述病毒的尺寸、形狀或其他顯著形態(tài)特點(diǎn)。
[0084]試劑盒
[0085]本發(fā)明還提供了執(zhí)行本發(fā)明的方法的試劑盒。具體來說，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含用于檢測和/或定量按照本發(fā)明的任一方法從口香糖移除的細(xì)菌的組分。
[0086]在考慮下面的說明性實(shí)施例后，將會理解本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例
[0087]實(shí)施例1
[0088]粘附于手指揉捏的口香糖的細(xì)菌的定量
[0089]進(jìn)行了體外手指揉捏研究以定量粘附于口香糖或口香糖內(nèi)的細(xì)菌。在所述實(shí)驗(yàn)中使用兩種可商購的留蘭香口香糖片:
[0090]口香糖A:商品化留蘭香口香糖1(1.5g片裝)。以重量計，含量的降序排列的組成:山梨糖醇，膠基，甘油。天然和人造調(diào)味劑；少于2%的組分:氫化淀粉水解物，阿斯巴甜，甘露糖醇，安賽蜜K，大豆卵磷脂，木糖醇，胡蘿卜素，I號藍(lán)色色淀和丁基化羥基甲苯。
[0091]口香糖B:商品化留蘭香口香糖2(1.5g片裝)。以重量計，含量的降序排列的組成:山梨糖醇，膠基，甘油，甘露糖醇，木糖醇。天然和人造調(diào)味劑;少于2%的組分:安賽蜜K，阿斯巴甜，丁基化羥基甲苯，I號藍(lán)色色淀，大豆卵磷脂和5號黃色色淀。所有口香糖片具有1.5g的標(biāo)準(zhǔn)重量。
[0092]三種不同細(xì)菌菌株被用于本研究，口腔鏈球菌(S.0ralis)J22，變形鏈球菌(S.mutans) ATCC 25175和內(nèi)氏放線菌(A.naeslundii )T14V_J1。口腔鏈球菌(S.0ral is)和內(nèi)氏放線菌(A.naes lundi i )被認(rèn)為在體內(nèi)是牙齒表面的最初定植者，而變形鏈球菌(S.mutans)是離齒的病因。鏈球菌在Todd Hewitt肉湯中在37°C下好氧生長，放線菌在腦心浸液中厭氧生長。首先將來自于冷凍儲用液的細(xì)菌在適合的瓊脂平板上生長24小時，隨后接種5ml適合的培養(yǎng)基24小時。在新鮮培養(yǎng)基中以1:10稀釋制備主培養(yǎng)物16小時。將主培養(yǎng)物超聲處理以懸浮細(xì)菌聚集體。使用Biirker Tiirk計數(shù)室測定細(xì)菌濃度，并將濃度調(diào)整到每ml 104、105、107 和 19 個細(xì)菌。
[0093]對于每種菌株來說，通過將1.5g 口香糖與200μ1細(xì)菌懸液一起添加到無菌乳膠手套(無粉末乳膠檢查手套，VWR internat1nal ,Radnor，USA)的手指中，將細(xì)菌用手指揉捏到口香糖片中。接下來，在30°C水浴中將細(xì)菌用手指揉捏到口香糖中5分鐘。在手指揉捏后，將口香糖從手指中取出，在無菌水中蘸一次，并置于特氟龍模具(15x 15x Imm)中，使用一副無菌鑷子產(chǎn)生可重現(xiàn)的口香糖表面積(± 15x I 5x 4mm)。隨后，通過如Syed等(Appl.Microb1logy 24:638-644)中所述在裝填有5ml 濾器除菌(Mi I lipor e，Mi 11 ex GS
0.22μηι)的還原型運(yùn)輸流體(RTF)的無菌聚苯乙稀杯中，在水浴超聲儀(ELMA TranssonicTP690，Elma GmbH&Co，德國)中超聲處理60秒，從口香糖移除細(xì)菌。最后，將得到的懸液連續(xù)稀釋，并鋪板在Todd Hewitt肉湯(THB)瓊脂或血瓊脂板(n0.2血瓊脂基料，40g/L，氯高鐵血紅素5mg/L，甲萘醌lmg/L，綿羊血50ml/L)上。集落形成單位(CFU):在37°C48小時后，對集落形成單位的數(shù)目進(jìn)行計數(shù)，并將其轉(zhuǎn)變成捕獲在單一口香糖片中的細(xì)菌數(shù)目。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一式三份。
[0094]為了說明由于粘附于手套表面的內(nèi)表面而造成的可能的細(xì)菌損失，將手套的手指內(nèi)部翻出，在1ml濾器除菌的RTF中超聲處理60秒，并且如上所述將連續(xù)稀釋液鋪在瓊脂上，隨后確定可能損失的CFU數(shù)目。同樣地，分析所述手指揉捏的口香糖在其中蘸過(參見上述)的水的細(xì)菌損失。在手指揉捏期間，由于粘附于手套表面，損失約0.05對數(shù)單位的球菌(口腔鏈球菌(S.0ralis)和變形鏈球菌(S.mutans))。粘附于手套表面的內(nèi)氏放線菌(A.naeslundii)的數(shù)目略微更高。由于將手指揉捏的口香糖片蘸在水中引起的細(xì)菌損失的量平均為0.004對數(shù)單位。在手指揉捏期間的損失與涉及的口香糖無關(guān)，然而隨著濃度上升而略微降低。
[0095]因此，由于不同的細(xì)菌數(shù)目被手指揉捏到口香糖樣品中，因此可以使用為不同細(xì)菌菌株從每種口香糖收回的細(xì)菌數(shù)目針對手指揉捏的口香糖中捕獲的實(shí)際細(xì)菌數(shù)目制作校準(zhǔn)曲線。所述校準(zhǔn)曲線允許計算附著于手指揉捏過的或咀嚼過的的口香糖或捕獲在其中的細(xì)菌的量，并且反映出附著于口香糖和口香糖內(nèi)的微生物的總量。
[0096]為了說明這些損失，在從口香糖收回的細(xì)菌數(shù)目與手指揉捏進(jìn)的細(xì)菌數(shù)目之間獲得線性關(guān)系(圖1)，其不依賴于涉及的細(xì)菌菌株或口香糖類型。由于超聲處理只能從外表面釋放出捕獲在口香糖中的細(xì)菌，因此收回的細(xì)菌數(shù)目粗略地比揉捏進(jìn)的細(xì)菌數(shù)目低1.5對數(shù)單位。
[0097]這項(xiàng)研究進(jìn)一步證實(shí)了本發(fā)明的方法可以檢測和定量包含在口香糖上和口香糖內(nèi)的口腔細(xì)菌。
[0098]實(shí)施例2
[0099]粘附于體內(nèi)咀嚼的口香糖的細(xì)菌的定量
[0100]進(jìn)行了一項(xiàng)體內(nèi)研究以證實(shí)口香糖可以從口腔移除細(xì)菌。健康的人類志愿者提供了參與本研究的書面知情同意書。所述研究的包含判據(jù)是每位志愿者健康狀況良好，并且他們的恒牙具有至少16種天然元素。排除判據(jù)是在研究前的一個月中使用抗生素或漱口水。此外，志愿者在研究期間不使用抗生素、漱口水和其他口香糖類型。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一式兩份。
[0101]接下來，要求志愿者咀嚼兩種不同的口香糖類型不同量的時間，最長10分鐘，并使用標(biāo)準(zhǔn)化尺寸下咀嚼過的口香糖片的超聲處理，根據(jù)CFU來確定咀嚼到所述口香糖中的細(xì)菌數(shù)目。細(xì)菌數(shù)目的確定，在咀嚼后不久產(chǎn)生附著的細(xì)菌的初始峰。隨著咀嚼時間增加直至10分鐘，細(xì)菌附著減少。
[0102]對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在考慮了目前優(yōu)選的實(shí)施方式后，預(yù)期可以在本發(fā)明的實(shí)踐中做出大量改良和改變。因此，應(yīng)該被置于本發(fā)明的范圍之上的唯一限制是在權(quán)利要求書中出現(xiàn)的限制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物的方法，所述方法包括: a)在從所述口香糖移除所述微生物并使所述微生物沉積在懸液中的條件下對所述口香糖進(jìn)行超聲處理， b)在促進(jìn)集落形成的條件下將至少一部分所述懸液與固體支持物相接觸，其中集落在所述固體支持物上的形成表明在所述口香糖上或口香糖內(nèi)存在微生物。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述超聲處理在標(biāo)準(zhǔn)化尺寸下進(jìn)行。3.權(quán)利要求1或2的方法，其還包括對包含在所述口香糖上和口香糖內(nèi)的所述微生物進(jìn)行定量的步驟，其中集落的數(shù)目指示包含在所述口香糖上和口香糖內(nèi)的微生物的總量。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述定量包括產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線以確定包含在所述口香糖上和口香糖內(nèi)的微生物的數(shù)量。5.一種檢測哺乳動物口腔中微生物的存在的方法，所述方法包括: a)在從與哺乳動物口腔發(fā)生接觸的口香糖移除所述微生物并使所述微生物沉積在懸液中的條件下，對所述口香糖進(jìn)行超聲處理， b)在促進(jìn)集落形成的條件下將至少一部分所述懸液與固體支持物相接觸，其中集落在所述固體支持物上的形成表明在所述哺乳動物的口腔中存在微生物。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述超聲處理在標(biāo)準(zhǔn)化尺寸下進(jìn)行。7.權(quán)利要求5或6的方法，其還包括對所述哺乳動物口腔內(nèi)的所述微生物進(jìn)行定量的步驟，其中集落的數(shù)目指示所述哺乳動物口腔內(nèi)的微生物的數(shù)量。8.權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)的方法，其中所述定量包括產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線以確定所述哺乳動物口腔內(nèi)的微生物的數(shù)量。9.一種對包含在口香糖上和口香糖內(nèi)的微生物進(jìn)行定量的方法，所述方法包括: a)在從所述口香糖移除所述微生物并使所述微生物沉積在懸液中的條件下對所述口香糖進(jìn)行超聲處理， b)在促進(jìn)集落形成的條件下將至少一部分所述懸液與固體支持物相接觸，以及 c)對在所述固體支持物上形成的集落進(jìn)行定量，其中所述集落的數(shù)目指示包含在所述口香糖上和口香糖內(nèi)的微生物的總量。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述超聲處理在標(biāo)準(zhǔn)化尺寸下進(jìn)行。11.權(quán)利要求9或10的方法，其還包括產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線以確定包含在所述口香糖上和口香糖內(nèi)的微生物的數(shù)量的步驟。12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其還包括鑒定所述微生物的步驟。13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物是細(xì)菌、病毒、真菌或原生動物。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述細(xì)菌是變形鏈球菌(Streptococcusmutans)、口腔鏈球菌(Streptococcus oralis)、內(nèi)氏放線菌(Actinomyces naeslundii )、血鏈球菌(Streptococcus sanguinis)、牙銀 P 卜啉單胞菌(Porphyromonas gingival is)、中間P卜啉單胞菌(Porphyromonas intermedia)、福賽斯擬桿菌(Bacteroides forsythus)、福賽斯坦納菌(Tanneraella forsythia)、直腸彎曲桿菌(Campylobacter rectus )、纏結(jié)優(yōu)桿菌(Eubacterium nodatum)、微小消化鏈球菌(Peptostreptococcus micros)、中間鏈球菌(Streptococcus intermedius )、伴放線放線桿菌(Aggregetibacteractinomycetemcomitans)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola)、乳桿菌(Lactobac i I Ius )、嗤蝕艾肯菌(Eikenella corrodens )、牙銀二氧化碳嗜纖維菌(Capnocytophaga gingivalis)、格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii)、小韋榮球菌(Vei I lone I la par vula)、具核梭桿菌(Fuso bacterium nucleatum)、中間普雷沃菌(Prevotella intermedia)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、唾液鏈球菌(Streptococcus sal ivarius)和遠(yuǎn)緣鏈球菌(Streptococcus sobrinus)。15.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法，其還包括在哺乳動物對象中診斷感染的步驟，其中將所述口香糖與所述對象的口腔進(jìn)行接觸，并且其中包含在所述口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物的存在指示所述對象中的感染。16.—種在哺乳動物對象的口腔中診斷感染的體外方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法檢測包含在口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物，其中將所述口香糖與所述對象的口腔進(jìn)行接觸，并且其中所述口腔內(nèi)所述微生物的存在指示所述對象中的細(xì)菌感染。17.—種確定哺乳動物對象發(fā)生口腔內(nèi)感染的易感性的體外方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法檢測微生物，其中將所述口香糖與所述哺乳動物的口腔進(jìn)行接觸，并且其中所述口腔內(nèi)所述微生物的存在指示所述對象中對感染的增加的易感性。18.一種產(chǎn)生哺乳動物對象口腔的微生物分布情況的方法，所述方法包括: a)將口香糖與所述對象的口腔相接觸，以及 b)檢測在與所述對象的口腔接觸后包含在所述口香糖上或口香糖內(nèi)的至少一種微生物類型的存在和不存在， 其中至少一種微生物類型的存在或不存在確定了所述對象口腔的微生物分布情況。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述方法還包括下列步驟: c)將所述哺乳動物對象的微生物分布情況與參比微生物分布情況進(jìn)行比較，其中該參比分布情況指示對口腔疾病或障礙的增加的易感性，以及 d)對所述微生物分布情況進(jìn)行評分，以確定所述對象是否對口腔疾病或障礙具有增加的易感性。20.權(quán)利要求18或19的方法，其還包括對包含在所述口香糖上或口香糖內(nèi)的微生物進(jìn)行定量的步驟。21.權(quán)利要求20的方法，其還包括產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線以定量所述微生物。22.權(quán)利要求18-21任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物是細(xì)菌、病毒、真菌或原生動物。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述細(xì)菌是變形鏈球菌(Streptococcusmutans)、口腔鏈球菌(Streptococcus oralis)、內(nèi)氏放線菌(Actinomyces naeslundii )、血鏈球菌(Streptococcus sanguinis)、牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中間P卜啉單胞菌(Porphyromonas intermedia)、福賽斯擬桿菌(Bacteroides forsythus)、福賽斯坦納菌(Tannerael la forsythia)、直腸彎曲桿菌(Campylobacter rectus )、纏結(jié)優(yōu)桿菌(Eubacterium nodatum)、微小消化鏈球菌(Peptostreptococcus micros)、中間鏈球菌(Streptococcus intermedius )、伴放線放線桿菌(Aggregetibacteractinomycetemcomitans)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola)、乳桿菌(Lactobacillus)、嗤蝕艾肯菌(Eikenella corrodens )、牙銀二氧化碳嗜纖維菌(Capnocytophaga gingivalis)、格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii)、小韋榮球菌(Vei Ilonel la parvula)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)和遠(yuǎn)緣鏈球菌(Streptococcus sobrinus)024.—種試劑盒，其用于執(zhí)行權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法。
【文檔編號】C12Q1/04GK105899671SQ201580004251
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年1月9日
【發(fā)明人】阿馬蘭特·梅特拉, 斯特凡·韋塞爾, 亨尼·C·范德密, 亨克·J·比舍
【申請人】Wm.雷格利Jr.公司