一種cd19免疫原多肽及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CD19免疫原多肽，屬于抗癌疫苗領(lǐng)域。具體涉及用作抗癌疫苗的CD19免疫原的優(yōu)化多肽，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。該氨基酸序列為全新的序列，在制備用于治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。尤其在制備用于腫瘤免疫細(xì)胞，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答藥物中的應(yīng)用，以及在制備用于CAR?T細(xì)胞免疫治療的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于為全新的序列，可用于腫瘤免疫細(xì)胞技術(shù)中的免疫原，能（1）促進(jìn)T細(xì)胞，（2）促進(jìn)CD8+免疫應(yīng)答，（3）能與T細(xì)胞表面的MHC有效的特異性結(jié)合，（4）促進(jìn)T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，（5）在荷瘤小鼠體內(nèi)，能抑制腫瘤的生長。作為細(xì)胞療法的靶標(biāo)分子，應(yīng)用于CAR?T等細(xì)胞療法。
【專利說明】
一種CD19免疫原多肽及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明是有關(guān)抗癌疫苗領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明涉及用作抗癌疫苗的CD19免疫原 的優(yōu)化多肽，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
【背景技術(shù)】
[0002] B細(xì)胞淋巴瘤是B細(xì)胞發(fā)生的實(shí)體腫瘤通常發(fā)生于兒童和成年人，是一種攻擊免疫 系統(tǒng)中B細(xì)胞的癌癥類型。包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。其分型眾多，經(jīng)典霍奇金 淋巴瘤和結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型霍奇金淋巴瘤，現(xiàn)在被認(rèn)為是起源于B細(xì)胞的腫瘤。彌漫性 大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(MALT)、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤/慢性 淋巴細(xì)胞白血病、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)5種B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤最為常見，占非霍奇金淋巴 瘤的3/4』細(xì)胞淋巴瘤的預(yù)后和治療取決于淋巴瘤的具體類型以及分期分級(jí)。目前的治療 手段以化療為主，但化療對身體傷害很大，以后康復(fù)了身體抵抗力也會(huì)變得很差。
[0003] 研究人員發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞表面受體CD19起著關(guān)鍵作用。CD19是一種B細(xì)胞特 異性轉(zhuǎn)膜糖蛋白，表達(dá)于B系細(xì)胞(不包括成熟漿細(xì)胞)及濾泡樹突狀細(xì)胞上，CD19是一種重 要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的生長激活和活化，在調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞抗原受體或其他 表面受體的信號(hào)閾值中起重要作用，是與B淋巴細(xì)胞分化、活化、增殖及抗體產(chǎn)生有關(guān)的重 要膜抗原，是診斷B淋巴細(xì)胞系腫瘤的最好標(biāo)志，如慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)和急性淋巴 細(xì)胞白血病(ALL)。
[0004] 目前已經(jīng)有腫瘤的臨床試驗(yàn)測試對抗CD19受體的抗體。這種抗體不僅能殺死B淋 巴細(xì)胞系腫瘤，同時(shí)也能健康的B細(xì)胞，從而削弱免疫系統(tǒng)。研究人員希望能夠設(shè)計(jì)更有效 的治療方法，能選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞，同時(shí)保留健康的B細(xì)胞，產(chǎn)生更安全、有效的臨床治 療效果。
[0005] 腫瘤細(xì)胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的腫瘤治療模式，是一種自身免 疫抗癌的新型治療方法。它是運(yùn)用生物技術(shù)和生物制劑對從病人體內(nèi)采集的免疫細(xì)胞進(jìn)行 體外培養(yǎng)和擴(kuò)增后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)的方法，來激發(fā)，增強(qiáng)機(jī)體自身免疫功能，從而達(dá)到治療 腫瘤的目的。腫瘤細(xì)胞免疫療法是繼手術(shù)、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術(shù)。
[0006] CD19可以作為腫瘤疫苗的特異性免疫原。然而，CD19由95KDa的蛋白，分子量較大， 較難得到純度高的⑶19。這樣，不僅會(huì)給后期的特異性T細(xì)胞免疫帶來困難，而且會(huì)導(dǎo)致患 者的自身免疫。因此，本發(fā)明提供了一種特異性強(qiáng)，純度較高的小分子多肽作為免疫原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明目的
[0008] 本發(fā)明提供一種CD19免疫原多肽，可用于腫瘤細(xì)胞免疫的免疫原，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫 應(yīng)答，具有分子量小、特異性免疫原性強(qiáng)的特點(diǎn)。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案在于提供一種C D 1 9免疫原多肽，序列為 DNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLK FLKLSLGLPGLGIHMRPLASW(SEQ ID N0:1)。該氨基酸序列 為全新的序列，在制備用于治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。尤其在制備用于腫瘤免疫細(xì)胞，增強(qiáng)T 細(xì)胞免疫應(yīng)答藥物中的應(yīng)用，以及在制備用于CAR-T細(xì)胞免疫治療的應(yīng)用。
[0011] 有益效果
[0012] 本發(fā)明的CD19免疫原多肽，為全新的序列，可用于腫瘤免疫細(xì)胞技術(shù)中的免疫原。 有益效果在于（1)促進(jìn)Τ細(xì)胞，（2)促進(jìn)CD8+免疫應(yīng)答，（3)能與Τ細(xì)胞表面的MHC有效的特異 性結(jié)合，⑷促進(jìn)Τ細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，（5)在荷瘤小鼠體內(nèi)，能抑制腫瘤的生長。作為細(xì) 胞療法的靶標(biāo)分子，應(yīng)用于CAR-Τ等細(xì)胞療法。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 多肽由上海生工吉爾合成。
[0014] 實(shí)施例1
[0015] Τ淋巴細(xì)胞的增殖作用:無菌取小鼠脾臟，1640培養(yǎng)基清洗3次，5ml注射器芯研磨， 200目篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，離心（1000r/min，5min)，棄上清，TriS-NH4CL破解紅細(xì) 胞，冰水浴靜置3_5min，離心（1000r/min，5min)，棄上清，用無菌冷roS洗滌細(xì)胞兩次。最后 加入10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(5ml)懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X106 個(gè)/ml，于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。
[0016] 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組、模型組(刀豆蛋白A，sigma公司購買）、多肽各劑量(3、6、12mg/ ml)組。各組分別加入脾臟淋巴細(xì)胞懸液100μΙ/孔后，空白對照組加入1640培養(yǎng)液100μΙ，模 型組加入ConA(終濃度為5μg/ml)，多肽各劑量組在加入不同濃度的多肽基礎(chǔ)上加 ConA(終 濃度為Sμg/ml)。37 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入20μ1 MTT，繼續(xù)培養(yǎng) 4h，最后棄掉每孔所有溶液，每孔加入100ylDMS0，震蕩，用酶標(biāo)儀檢測570nm處0D值，每孔設(shè) 5個(gè)平行。
[0017]表1多肽對T淋巴細(xì)胞的增殖作用
[0018]
[0019] *P〈〇 · 05，#P〈0 · 01 與模型組相比。
[0020]實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，與模型組比較，多肽能促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，在劑量為3 ~12mg/ml的范圍呈現(xiàn)很好的劑量依賴關(guān)系，以20mg/ml的增殖率最高，為153.6%。
[0021] 實(shí)施例2
[0022] CD19免疫原多肽的免疫原性測定:采用流式細(xì)胞技術(shù)測定免疫原多肽對CD8+T細(xì) 胞的影響。6_8w齡C57BL/6小鼠，小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只。（1)空白組；（2)免疫原多肽低 劑量組；（3)免疫原多肽中劑量組；（4)多肽高劑量組。在試驗(yàn)的第0、7、14天，分別進(jìn)行免疫。 方案為:空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組多肽設(shè)3個(gè)劑量：l、2、4mg/Kg，在小鼠背部淋巴 結(jié)附近多點(diǎn)注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，將血離心后取血細(xì)胞層，用紅細(xì)胞裂 解液破解紅細(xì)胞，洗去裂解的紅細(xì)胞，再用熒光標(biāo)記的單克隆抗CD8+-FITC(購自北京華泰 昕生物醫(yī)療技術(shù)有限公司)孵育、固定后，進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)測定，評價(jià)免疫原多肽對CD8+T 細(xì)胞的影響。
[0023]表2多肽對⑶8+T淋巴細(xì)胞的作用
[0024]
[0025] *P〈0 · 05，#P〈0 · 01 與模型組相比。
[0026]實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2,與空白組比較，多肽能促進(jìn)小鼠 CD8+T淋巴細(xì)胞，在劑量為1~ 4mg/Kg的范圍呈現(xiàn)很好的劑量依賴關(guān)系，以4mg/Kg的增殖率最高，為156.82%。
[0027] 實(shí)施例3
[0028] 應(yīng)用競爭性受體-配體親和法測試多肽與MHC的結(jié)合能力：
[0029] 將多肽與HLA各型的結(jié)合能力由競爭性受體-配體親和法判斷。將固定濃度為50μ mo 1 /L的標(biāo)記1251的多肽以及不同濃度（1 -50μπιο 1 /L)的多肽加入反應(yīng)體系（磷酸鹽緩沖液 和MHC，所述的MHC試劑盒購自上海泛柯生物科技有限公司，試劑盒內(nèi)有HLA-A1、Α2、A3、A11 和A24)，在反應(yīng)體系中形成兩種復(fù)合物，即待測多肽MHC復(fù)合物和1251標(biāo)記多肽復(fù)合物。待 測多肽與1251標(biāo)記多肽競爭與MHC的結(jié)合。用超過濾(產(chǎn)品型號(hào)Microcon 30，Amicon公司） 分離游離多肽和多肽MHC復(fù)合物，然后測定多肽MHC復(fù)合物的1251放射量，將此放射量與沒 有競爭性抑制的多肽MHC復(fù)合物(沒有加待測多肽的樣本）的放射量比較，求待測多肽在抑 制50%標(biāo)記多肽與腿(：結(jié)合時(shí)的濃度，8卩1050。由此得到，多肽對!11^-六1^2^3^11和八24的 IC50值分別為8.67、6.87、3.22、6.53和0.22以111〇1/1，均符合陽性多肽的標(biāo)準(zhǔn)（彡1(^111〇1/1)。 因此，多肽為具有有效結(jié)合能力的免疫原多肽。
[0030] 實(shí)施例4
[0031] CD19免疫原多肽的T細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn):采用玫瑰花環(huán)試驗(yàn)評價(jià)T細(xì)胞與人彌漫大B細(xì) 胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)活化B細(xì)胞（activated B-cell,ABC) 型細(xì)胞株〇CI_Ly3的結(jié)合能力。無菌取豚鼠胸腺，1640培養(yǎng)基清洗3次，5ml注射器芯研磨， 200目篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，離心1000轉(zhuǎn)/分，10分鐘，棄上清，以Hank's液調(diào)細(xì)胞濃度 為3 X 10%1。于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。
[0032] 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組、多肽各劑量(3、6、12mg/ml)組。各組分別加入胸腺淋巴細(xì)胞懸 液?οομL/孔后，空白對照組加入1640培養(yǎng)液500μ1，多肽各劑量組在加入不同濃度的多肽。 37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔中加入100μΙ/孔0CI-Ly3細(xì)胞(細(xì)胞濃度為IX 106/ml，含10 %胎牛血清），混勻，500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘。棄上清，加少量戊二醛，輕輕晃動(dòng)， 使細(xì)胞懸浮，加甲紫染色，400倍顯微鏡觀察。凡結(jié)合3個(gè)以上腫瘤細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞為花環(huán) 陽性細(xì)胞。記數(shù)100個(gè)T細(xì)胞中形成花環(huán)的淋巴細(xì)胞百分率，即為T細(xì)胞與0CI-Ly3細(xì)胞的結(jié) 合率。每孔設(shè)5個(gè)平行。
[0033] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，與空白組比較，CD19免疫原多肽可以顯著性增加 T細(xì)胞與0CI_Ly3 細(xì)胞的結(jié)合率(P〈〇.01)，低中高劑量組的結(jié)合率分別為34.35、45.30和54.72%。在劑量為3 ~12mg/ml的范圍呈現(xiàn)很好的劑量依賴關(guān)系。
[0034] 表3多肽對T細(xì)胞結(jié)合的影響
[0035]
[0036]
[0037] *P〈〇 · 05，#P〈0 · 01 與空白組相比。
[0038] 實(shí)施例5
[0039] 用人彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤移植瘤模型檢測CD19免疫原多肽的體內(nèi)活力。
[0040] 6-8齡SCID小鼠，小鼠隨機(jī)分成4組，雌雄各半，每組10只。（1)空白組；（2)多肽低劑 量組；（3)多肽中劑量組；（4)多肽高劑量組。建立人彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤移植瘤模型，在接 種腫瘤細(xì)胞后的第3、5、7天，分別進(jìn)行免疫。方案為:空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組多 肽設(shè)3個(gè)劑量:1、2、4mg/Kg，在腫瘤周圍多點(diǎn)注射。21天后，觀察小鼠存活數(shù)量，計(jì)算存活率。 結(jié)果顯示，劑量l、2、4mg/Kg的多肽可有效地保護(hù)小鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率達(dá)到 65·87、70·98 和82.98%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種⑶19免疫原多肽，其特征在于:所述的多肽序列為SEQ ID NO: 1。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽在用于治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的多肽在制備用于腫瘤免疫細(xì)胞，增 強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答藥物中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:在制備用于CAR-T細(xì)胞免疫治療的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/705GK105906705SQ201610438413
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月19日
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司