一種依次提取和分級鹽析純化雞爪皮膠原蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明一種依次提取和分級鹽析純化雞爪皮膠原蛋白的方法，屬于食品生物利用領域。將去除可見脂肪的雞爪皮清洗，低溫風干，剪成小塊。浸泡在NaCl的Tris?HCl緩沖液中除去雜蛋白、脂肪。預處理后的雞爪皮浸泡于預冷的NaCl中性鹽溶液中，攪拌離心后。沉淀浸泡于乙酸中提取酸溶性膠原蛋白，離心取沉淀浸泡于酶溶液中提取酶溶性膠原蛋白。三步的上清液分級鹽析，透析，凍干即得到較純的鹽溶性膠原蛋白，酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白。本發(fā)明利用一種溶液可對原料進行預處理高效節(jié)約，利用分級提取，原料利用率更高，并且可按不同使用范圍選擇對應的膠原蛋白，分級鹽析可得到純的I型膠原蛋白且除去膠原蛋白里面的酶殘留。
【專利說明】
一種依次提取和分級鹽析純化雞爪皮膠原蛋白的方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于食品生物利用領域，具體講是涉及一種依次提取和分級鹽析純化膠原蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]肉雞在世界范圍內消費量很大，但其作為家禽類產(chǎn)業(yè)加工的副產(chǎn)物的雞爪經(jīng)常被直接丟棄、用于制作泡椒鳳爪等簡單加工的肉制品或者用于生產(chǎn)動物飼料，并且很多西方國家是從不食用雞爪的，這就造成了資源的極大浪費。而雞爪皮中含有豐富的膠原蛋白，因此開發(fā)和利用雞爪皮的這一優(yōu)勢來提取膠原蛋白，可以極大的提高雞爪的經(jīng)濟附加值，增加其生物綜合利用度，對于肉雞產(chǎn)業(yè)有著重大的意義。
[0003]I型膠原蛋白是機體中含量最豐富的的膠原蛋白，廣泛存在于動物的皮膚、筋腱和韌帶中。I型膠原蛋白以其特殊的結構廣泛的應用于醫(yī)學、食品和生物領域。雞爪皮中也含有大量I型膠原蛋白。
[0004]目前從動物皮中提取膠原蛋白的預處理方法一般是，經(jīng)堿浸泡除去色素和雜蛋白，再由乙醇來除去脂肪，此方法繁瑣，并且每步之后都要經(jīng)過蒸餾水反復清洗。而本方法直接使用緩沖溶液就達到以上幾種溶液的目的，極大節(jié)省時間，提高效率。而傳統(tǒng)的提取過程如:中國專利CN 105218663 A中，牛跟腱膠原蛋白用溶解于乙酸的胃蛋白酶溶液提取，但是原料的利用率不高，有大量的原料殘渣里面還含有膠原蛋白未溶解出。而本發(fā)明依次用中性鹽、乙酸、胃蛋白酶提取，每一步之后的固體留待下一步提取，這樣能夠達到原料中膠原蛋白幾乎完全被提取出的效果，并且可以根據(jù)不同提取方法提取出的膠原蛋白的特點，使用在不同得地方，依次達到更高效率提取，更細化膠原蛋白使用的目的。并且本發(fā)明在得到膠原蛋白粗提取液后，用分級鹽析的方法不僅得到純的I型膠原蛋白，并且酶提取的膠原蛋白里面沒有酶殘留。提取方便，原料利用率高，效率高且得到有活性的純的I型膠原蛋白。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明以肉雞加工的副產(chǎn)物雞爪皮為原料，利用中性鹽(NaCI )，乙酸和酶(Pepsin)三種溶液提取，分級鹽析依次得到鹽溶性膠原蛋白(SSC)，酸溶性膠原蛋白(ASC)和酶溶性膠原蛋白(PSC)三種純化的I型膠原蛋白。
[0006]因此，本發(fā)明采用的技術方案如下:一種依次提取和分級鹽析純化雞爪皮膠原蛋白的方法，按照下述步驟進行:
(I)原料的預處理
剝下雞爪上的皮，切除可見脂肪，自來水洗干凈，低溫風干，剪成小塊。浸泡在NaCl的Tris-HCl緩沖液中除去雜蛋白，色素和脂肪，攪拌，取離心后沉淀。
[0007](2)鹽溶性膠原蛋白提取
預處理的雞爪皮浸泡于預冷的NaCl的Tris-HCl緩沖液中，攪拌，提取，離心上清液即鹽溶性膠原蛋白粗提液。離心沉淀用蒸餾水沖洗。
[0008](3)酸溶性膠原蛋白提取
鹽提后離心所得沉淀浸泡于預冷的乙酸溶液中，攪拌，提取，離心上清液即酸溶性膠原蛋白粗提液。離心沉淀用蒸餾水沖洗。
[0009](4)酶溶性膠原蛋白提取
酸提后所得沉淀浸泡于預冷的胃蛋白酶溶液中，攪拌，提取，離心上清液即酶溶性膠原蛋白粗提液。
[0010](5)膠原蛋白的提純
鹽溶性膠原蛋白粗提液中先添加HCl攪拌，緩慢的邊攪拌邊加入NaCl直至其完全溶解，進行第一次鹽析過夜，離心，沉淀即鹽溶性膠原蛋白粗品，溶解于乙酸中。
[0011 ]酸溶性膠原蛋白粗提液中直接加NaCl，同上步操作進行第一次鹽析過夜，離心，收集的沉淀即酸溶性膠原蛋白粗品，溶解于乙酸中。
[0012]酶溶性膠原蛋白粗提液直接加NaCl，同上步操作進行第一次鹽析過夜，離心，所得沉淀酸溶性膠原蛋白粗品，用NaCl的Tris-HCl緩沖液溶解，溶解膠原蛋白的同時中性環(huán)境使胃蛋白酶殘留失活。
[0013]上述三種溶解后的膠原蛋白溶液，離心取上清液，再次加入NaCl進行第二次鹽析，離心收集沉淀溶解于適量乙酸中，蒸餾水透析，真空冷凍干燥得較純的膠原蛋白凍干品。
[0014]步驟(I)手術刀剝去雞爪皮，手工切除可見脂肪，雞爪皮剪成IcmXIcm的方塊，自來水沖洗，瀝干后20 0C下風干，-20 °(:保藏以待下一步使用。雞爪皮與鹽溶液比為Ig: 20mL，Tris-HCl緩沖液為0.05M，調pH為7.5，10mL緩沖液中加20g NaCl。離心為1000g進行20min。此操作重復直至無可見脂肪和色素。
[0015]步驟(2)中Tris-HCl緩沖液同上步相同條件，緩沖液中加NaCl至0.45mol/L，提取4811，離心條件為1700(^進行301^11。離心后沉淀用蒸餾水沖洗至?!1為7.0。
[0016]步驟(3)中酸提取液為0.5mol/L乙酸，提取48h，離心條件為17000g進行30min。
[0017]步驟(4)中酶溶液為0.5moI/L乙酸中加胃蛋白酶比為0.Ig:1OOL。提取48h，離心條件為17000g進行30min。
[0018]步驟(5)中，鹽溶性膠原蛋白粗提液中加HCl至0.01mol/L,三種膠原蛋白粗提液第一次鹽析加NaCl至0.9mol/L，第一次離心條件為2500g進行30min。鹽提和酸提所得沉淀溶解于0.5mol/L乙酸中，溶解酶提所得沉淀的Tris-HCl緩沖液為0.05mol/L調pH為7.5，加NaCl至1.0mol/L。離心條件為2500g進行30min，上清液中加NaCl至2.4mol/L進行第二次鹽析。攪拌后17000g離心30min，收集三種提取方法所得沉淀，溶解于0.5mol/L乙酸中，蒸餾水透析，直至用0.0lmol/L AgNO3檢測透析外液無白色沉淀為止。之后膠原蛋白溶液倒入培養(yǎng)皿中進行真空冷凍干燥，即得到呈纖維海綿狀的白色干燥的膠原蛋白純品。
[0019]以上技術方案中所有除雜，提取，離心，純化等操作都在4°C下進行。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)勢在于:
(I)世界各國每天消耗大量的雞肉，但肉雞產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物雞爪在很多國家直接被視為加工下腳料，通常被加工成飼料或者肥料，而更甚者直接作為垃圾掩埋掉。只有部分亞洲國家會食用雞爪，也只是進行簡單加工，這就造成了資源的極大浪費和對環(huán)境的污染。而本發(fā)明以雞爪皮為原料，生產(chǎn)具有較高營養(yǎng)價值和使用價值的膠原蛋白，這就極大地提高了其附加值，增加其生物綜合利用度。
[0021](2)傳統(tǒng)膠原蛋白的提取在原料預處理時需要進行多步操作，用多種不同的溶液對原料進行除雜蛋白、色素和脂肪，耗時并且浪費大量溶液，并且每一步之后都要用蒸餾水反復沖洗原料以除去上一步溶液殘留。而本發(fā)明在預處理時直接使用中性鹽的緩沖溶液，即可完成以上繁瑣操作，省時省力，效率高，易操作。
[0022](3)雞爪皮中含有大量的膠原蛋白，傳統(tǒng)大多只用熱水、鹽、酸等單種方法難以將雞爪皮中的膠原蛋白完全提取出，這樣就存在原料利用率低，經(jīng)濟效益不高并且提取出的膠原蛋白不純的問題。而本發(fā)明利用分級提取法，依次將用中性鹽、酸和酶將雞爪皮中的膠原蛋白幾乎完全提取出。并且可以根據(jù)三種方法提出的膠原蛋白的結構分類利用于食品和化妝品領域中。
[0023](4)酶溶性膠原蛋白提取時，純化步驟粗膠原蛋白溶解在NaCl的Tris_HCl中性緩沖液中，提純膠原蛋白的同時滅酶，避免在之后的透析、凍干和存放的步驟中膠原蛋白中的胃蛋白酶還存在活性，將膠原蛋白酶解為小分子肽，影響膠原蛋白的生物活性。
【附圖說明】
[0024]圖1:雞爪皮膠原蛋白提取方法的流程圖。
[0025]圖2:不同溶液提取雞爪皮膠原蛋白的SDS-PAGE圖譜。
[0026]圖3:不同溶液提取的膠原蛋白的流變特性圖:動態(tài)頻率掃描實驗的動態(tài)模量(G')。
[0027]具體事例
下面結合實例對本發(fā)明進行詳細闡述:
本發(fā)明中三種溶液提取膠原蛋白的流變性測定通過以下方法，膠原蛋白溶解于0.5M乙酸中制備1.0%(w/w)溶液，用直徑40mm磨具，磨具和樣品臺間距100ym，sweep模式，溫度250C，頻率0.1-1 OHZ，持續(xù)應力0.5%,進行震蕩流變測量動態(tài)模量G丨值。
[0028]實施例1:
將除去可見脂肪的雞爪皮，自來水洗干凈，低溫風干，剪成小塊(約IcmX Icm)。稱取10g浸泡在20L 20% (w/v) NaCl的Tris-HCl(0.05mol/L，pH7.5)緩沖液中除去雜蛋白，色素和脂肪，攪拌48h，1000g離心20min，收集沉淀，蒸餾水洗至pH為7.0。
[0029]預處理后的雞爪皮浸泡于8L預冷的0.45mol/L NaCl的Tris-HCl (0.05mol/L，pH7.5)緩沖液中，攪拌48h，17000g離心30min上清液即鹽溶性膠原蛋白粗提液。離心后所得沉淀用蒸餾水沖洗至pH為7.0。
[0030]鹽提后離心所得沉淀浸泡于8L預冷的0.5mol/L的乙酸溶液中，攪拌48h，17000g離心30min上清液即酸溶性膠原蛋白粗提液。
[0031]酸提后所得沉淀浸泡于8L預冷的胃蛋白酶溶液(8L乙酸中加Sg胃蛋白酶)中，攪拌48h，17000g離心30min上清液即酶溶性膠原蛋白粗提液。
[0032]鹽溶性膠原蛋白粗提液中先添加HCl至0.0lmol/L，緩慢的邊攪拌邊加入NaCl至0.9mol/L進行第一次鹽析過夜，2500g離心30min，沉淀即鹽溶性膠原蛋白粗品，溶解于8L0.5mol/L乙酸中。
[0033]酸溶性膠原蛋白粗提液中緩慢的邊攪拌邊加入NaCl至0.9mol/L進行第一次鹽析過夜，2500g離心30min，收集的沉淀即酸溶性膠原蛋白粗品，溶解于8L 0.5mol/L乙酸中。
[0034]酶溶性膠原蛋白粗提液緩慢的邊攪拌邊加入NaCl至0.9mol/L進行第一次鹽析過夜，2500g離心30min，所得沉淀酸溶性膠原蛋白粗品，用8L的NaCl (1.0mol/L)的Tris-HCl(0.05mo 1/L，pH7.5)緩沖液溶解。
[0035]上述三種溶解后的膠原蛋白溶液，2500g離心30min取上清液，再次加入NaCl至2.4mol/L進行第二次鹽析，17000g離心30min收集沉淀溶解于500mL乙酸(0.5mol/L)中，將溶液裝入截留分子量為14KDa的透析袋中，蒸餾水透析72h，真空冷凍干燥得到膠原蛋白凍干品。按照膠原蛋白粗提液和原料中羥脯氨酸比例計算其得率為PSC>ASC>SSC，依次為(49.10±1.95)%、(14.49±0.90)%和(1.13±0.31)%。經(jīng)SDS-PAGE分析得到的膠原蛋白都為較純的I型膠原蛋白。三種膠原蛋白溶解于乙酸中測定其流變特性，如圖3所示，三種膠原蛋白溶液都主要表現(xiàn)為彈性行為，而力學損耗趨勢為PSC> ASC> SSC。
[0036]實施例2:
將除去可見脂肪的雞爪皮，自來水沖洗干凈，瀝干，剪成小塊(約IcmX Icm)。稱取10g浸泡在25L 20% (w/v) NaCl的Tris-HCl(0.05mol/L，pH7.5)緩沖液中除去雜蛋白，色素和脂肪，攪拌72h，1000g離心20min，收集沉淀，蒸餾水洗至pH為7.0。
[0037]預處理后的雞爪皮浸泡于1L預冷的0.45mol/L NaCl的Tris-HCl (0.05mol/L，pH7.5)緩沖液中，攪拌72h，17000g離心30min上清液即鹽溶性膠原蛋白粗提液。離心后所得沉淀用蒸餾水沖洗至pH為7.0。
[0038]鹽提后離心所得沉淀浸泡于1L預冷的0.5mol/L的乙酸溶液中，攪拌72h，17000g離心30min上清液即酸溶性膠原蛋白粗提液。
[0039]酸提后所得沉淀浸泡于1L預冷的胃蛋白酶溶液(10L乙酸中加1g胃蛋白酶)中，攪拌72h，17000g離心30min上清液即酶溶性膠原蛋白粗提液。
[0040]鹽溶性膠原蛋白粗提液中先添加HCl至0.0lmol/L，緩慢的邊攪拌邊加入NaCl至0.9mol/L進行第一次鹽析過夜，2500g離心30min，沉淀即鹽溶性膠原蛋白粗品，溶解于1L0.5mol/L乙酸中。
[0041]酸溶性膠原蛋白粗提液中緩慢的邊攪拌邊加入NaCl至0.9mol/L進行第一次鹽析過夜，2500g離心30min，收集的沉淀即酸溶性膠原蛋白粗品，溶解于1L 0.5mol/L乙酸中
酶溶性膠原蛋白粗提液緩慢的邊攪拌邊加入NaCl至0.9mol/L進行第一次鹽析過夜，2500g離心30min，所得沉淀酸溶性膠原蛋白粗品，用1L的NaCl (1.0mol/L)的Tris-HCl(0.05mo 1/L，pH7.5)緩沖液溶解。
[0042]上述三種溶解后的膠原蛋白溶液，2500g離心30min取上清液，再次加入NaCl至2.4mol/L進行第二次鹽析，17000g離心30min收集沉淀溶解于500mL乙酸(0.5mol/L)中，蒸餾水透析72h，真空冷凍干燥得膠原蛋白凍干品。按照膠原蛋白粗提液和原料中羥脯氨酸比例計算其得率為 PSC>ASC>SSC，依次為(50.60 ±2.21)%、(16.01 ±0.03)%和(1.28土
0.97) %。與案例I相比說明提取時料液比變高時得率會適當提高。經(jīng)SDS-PAGE分析得到的膠原蛋白都為較純的I型膠原蛋白。
[0043]實施例3:
將除去可見脂肪的雞爪皮，自來水洗干凈，瀝干，剪成小塊(約IcmX Icm)。稱取10g浸泡在15L 20% (w/v) NaCl的Tris-HCl(0.05mol/L，pH7.5)緩沖液中除去雜蛋白，色素和脂肪，攪拌48h，1000g離心20min，收集沉淀，蒸餾水洗至pH為7.0。
[0044]預處理后的雞爪皮浸泡于6L預冷的0.45mol/L NaCl的Tris-HCl (0.05mol/L，pH7.5)緩沖液中，攪拌48h，17000g離心30min上清液即鹽溶性膠原蛋白粗提液。離心后所得沉淀用蒸餾水沖洗至pH為7.0。
[0045]鹽提后離心所得沉淀浸泡于6L預冷的0.5mol/L的乙酸溶液中，攪拌48h，17000g離心30min上清液即酸溶性膠原蛋白粗提液。
[0046]酸提后所得沉淀浸泡于6L預冷的胃蛋白酶溶液(6L乙酸中加6g胃蛋白酶)中，攪拌48h，17000g離心30min上清液即酶溶性膠原蛋白粗提液。
[0047]鹽溶性膠原蛋白粗提液中先添加HCl至0.01mol/L，緩慢的邊攪拌邊加入NaCl至0.9mol/L進行第一次鹽析過夜，2500g離心30min，沉淀即鹽溶性膠原蛋白粗品，溶解于6L0.5mol/L乙酸中。
[0048]酸溶性膠原蛋白粗提液中緩慢的邊攪拌邊加入NaCl至0.9mol/L進行第一次鹽析過夜，2500g離心30min，收集的沉淀即酸溶性膠原蛋白粗品，溶解于6L 0.5mol/L乙酸中。
[0049]酶溶性膠原蛋白粗提液緩慢的邊攪拌邊加入NaCl至0.9mol/L進行第一次鹽析過夜，250(^離心30111；[11，所得沉淀酸溶性膠原蛋白粗品，用6]^的他(:1(1.01]101凡)的1'1^8-此1(0.05mo 1/L，pH7.5)緩沖液溶解。
[0050]上述三種溶解后的膠原蛋白溶液，2500g離心30min取上清液，再次加入NaCl至
2.4mol/L進行第二次鹽析，17000g離心30min收集沉淀溶解于500mL乙酸(0.5mol/L)中，將溶液裝入截留分子量為14KDa的透析袋中，蒸餾水透析72h，真空冷凍干燥得到膠原蛋白凍干品。按照膠原蛋白粗提液和原料中羥脯氨酸比例計算其得率為PSC>ASC>SSC，依次為(47.78 ±0.20) %、(13.11 ±1.65)%和(0.78 ±0.33) %。經(jīng) SDS-PAGE 分析得到的膠原蛋白都為較純的I型膠原蛋白。
[0051]以上實例的所有除雜，提取，離心，純化等操作都在4°C下進行。依次提取雞爪皮膠原蛋白及分級鹽析的過程見流程圖。提取的膠原蛋白可以通過SDS-PAGE圖譜鑒定其純度。三種方法得到的蛋白都為較純的I型膠原蛋白，可以看出SSC、ASC和PSC都有清晰的三條肽鏈，g卩Q1(I)和α2( Π )兩條α鏈，α的二聚體β和α的三聚體γ鏈。
【主權項】
1.一種依次提取和分級鹽析純化雞爪皮膠原蛋白的方法，其特征在于按照下述步驟進行: (1)原料的預處理 剝下雞爪上的皮，切除可見脂肪，自來水洗干凈，低溫風干，剪成小塊；浸泡在NaCl的Tris-HCl緩沖液中除去雜蛋白，色素和脂肪，攪拌，取離心后沉淀； (2)鹽溶性膠原蛋白提取 預處理的雞爪皮浸泡于預冷的NaCl的Tris-HCl緩沖液中，攪拌，提取，離心上清液即鹽溶性膠原蛋白粗提液;離心沉淀用蒸餾水沖洗； (3)酸溶性膠原蛋白提取 鹽提后離心所得沉淀浸泡于預冷的乙酸溶液中，攪拌，提取，離心上清液即酸溶性膠原蛋白粗提液;離心沉淀用蒸餾水沖洗； (4)酶溶性膠原蛋白提取 酸提后所得沉淀浸泡于預冷的胃蛋白酶溶液中，攪拌，提取，離心上清液即酶溶性膠原蛋白粗提液； (5)膠原蛋白的提純 鹽溶性膠原蛋白粗提液中先添加HCl攪拌，緩慢的邊攪拌邊加入NaCl直至其完全溶解，進行第一次鹽析過夜，離心，沉淀即鹽溶性膠原蛋白粗品，溶解于乙酸中； 酸溶性膠原蛋白粗提液中直接加NaCl，同上步操作進行第一次鹽析過夜，離心，收集的沉淀即酸溶性膠原蛋白粗品，溶解于乙酸中； 酶溶性膠原蛋白粗提液直接加NaCl，同上步操作進行第一次鹽析過夜，離心，所得沉淀酸溶性膠原蛋白粗品，用NaCl的Tris-HCl緩沖液溶解，溶解膠原蛋白的同時中性環(huán)境使胃蛋白酶殘留失活； 上述三種溶解后的膠原蛋白溶液，離心取上清液，再次加入NaCl進行第二次鹽析，離心收集沉淀溶解于適量乙酸中，蒸餾水透析，真空冷凍干燥得較純的膠原蛋白凍干品。2.根據(jù)權利要求1所述的一種依次提取和分級鹽析純化雞爪皮膠原蛋白的方法，其特征在于步驟(I)手術刀剝去雞爪皮，手工切除可見脂肪，雞爪皮剪成IcmX Icm的方塊，自來水沖洗，瀝干后20°C下風干，_20°C保藏以待下一步使用；雞爪皮與鹽溶液比為lg:20mL，Tris-HCl緩沖液為0.05M，調pH為7.5，10mL緩沖液中加20g NaCl;離心為1000g進行20min;此操作重復直至無可見脂肪和色素。3.—種依次提取和分級鹽析純化雞爪皮膠原蛋白的方法，其特征在于步驟(2)中Tris-HCl緩沖液同上步相同條件，緩沖液中加NaCl至0.45mol/L，提取48h，離心條件為17000g進行30min;離心后沉淀用蒸餾水沖洗至pH為7.0。4.一種依次提取和分級鹽析純化雞爪皮膠原蛋白的方法，其特征在于步驟(3)中酸提取液為0.5mol/L乙酸，提取48h，離心條件為17000g進行30min。5.—種依次提取和分級鹽析純化雞爪皮膠原蛋白的方法，其特征在于步驟(4)中酶溶液為0.5mol/L乙酸中加胃蛋白酶比為0.1g:100L;提取48h，離心條件為17000g進行30min。6.一種依次提取和分級鹽析純化雞爪皮膠原蛋白的方法，其特征在于步驟(5)中，鹽溶性膠原蛋白粗提液中加HCl至0.0lmol/L，三種膠原蛋白粗提液第一次鹽析加NaCl至.0.9mol/L，第一次離心條件為2500g進行30min;鹽提和酸提所得沉淀溶解于0.5mol/L乙酸中，溶解酶提所得沉淀的Tris-HCl緩沖液為0.05mol/L調pH為7.5，加NaCl至1.0mol/L;離心條件為2500g進行30min，上清液中加NaCl至2.4mol/L進行第二次鹽析;攪拌后17000g離心.30min，收集三種提取方法所得沉淀，溶解于0.5mol/L乙酸中，蒸饋水透析，直至用0.0lmol/L AgNO3檢測透析外液無白色沉淀為止;之后膠原蛋白溶液倒入培養(yǎng)皿中進行真空冷凍干燥，即得到呈纖維海綿狀的白色干燥的膠原蛋白純品。
【文檔編號】C07K1/30GK105906710SQ201610393886
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】周存山, 李妍花, 馬海樂, 余筱潔, 胡佳麗, 鮑鑫捷
【申請人】江蘇大學