一種灰兜巴多糖及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于保健食品和藥品領域，公開了一種灰兜巴多糖及其制備方法。其步驟包括：以灰兜巴為原料，經過熱水提取，乙醇沉淀得到灰兜巴粗多糖，將粗多糖溶解，用活性炭脫色，Sevage試劑脫除蛋白質，采用超濾技術進行分離純化，篩選得到分子量較小的灰兜巴多糖2，其峰位分子量Mp為6277Da，重均分子量Mw為9703Da，數均分子量Mn為7144Da。本發(fā)明制備方法可高效地分離制備灰兜巴多糖2，所涉及的灰兜巴多糖2能顯著降低Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的血糖、血脂和糖化血紅蛋白，改善葡萄糖耐量，改善糖脂代謝，具有體外抗氧化作用，適用于制備具有降血糖作用灰兜巴多糖的保健食品和藥品。
【專利說明】
一種灰兜巴多糖及其制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于保健食品和藥品領域，涉及一種具有降血糖作用的灰兜巴多糖及其制 備方法。
【背景技術】
[0002] 糖尿病是一種由多病因引起的嚴重威脅人類健康的代謝疾病，具有慢性高血糖這 一顯著特征，伴隨胰島素分泌及/或作用缺陷引起的碳水化合物、蛋白質、脂肪代謝紊亂，而 造成全身性多器官的慢性損害、功能障礙，甚至衰竭。根據統(tǒng)計，全球范圍內有10 %的人口 遭受糖尿病折磨，而且國際糖尿病聯(lián)盟預測，如不采取措施，到2040年全球將有6.42億人患 有糖尿病。中國是糖尿病第一大國，目前20歲以上的成年患者超過1億人，發(fā)病率高達 11.6%。糖尿病長期持續(xù)的高血糖狀態(tài)可產生葡萄糖毒性，導致全身性的慢性并發(fā)癥，甚至 危及生命。毫無疑問，糖尿病已嚴重威脅人類的健康，對糖尿病的防治刻不容緩。
[0003] 當前治療糖尿病以西藥為主，西藥治療糖尿病見效快，降低血糖作用明顯，但療效 有限，對機體有明顯的毒副作用，不能消除糖尿病并發(fā)癥，而且有些西藥價格昂貴，因此尋 找具有降血糖作用的天然活性成分日益引起世界各國學者的重視。
[0004] 灰兜巴是一種寄生在海拔800~1500m的峨眉山茶樹上的紅蜘蛛吐絲筑的巢(也有 稱其為老茶樹根部生長出來的菌科植物），亦稱其為灰蔸巴、灰蔸芭、閉口袋?；叶蛋屯庥^形 成一個長長的袋子，上端依附于老茶樹根部樹干上，下端約有三分之一藏于泥土下洞穴里， 其表面附著泥土和少量枯枝敗葉。在四川峨眉山地區(qū)，灰兜巴的水煎液用于治療糖尿病已 有悠久的歷史，而且效果良好，是峨眉山民間數百年來世代相傳的秘方，因而擁有"仙山靈 藥"、"糖尿病克星"和"天然純綠色的大自然珍寶"的美譽。近年來，灰兜巴治療糖尿病的作 用逐漸引起了廣大糖尿病工作者和保健食品研究者的關注，然而對于灰兜巴的研究尚處于 起步階段，未見灰兜巴多糖的分子量對降血糖作用的影響方面的報道。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種灰兜巴多糖。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種灰兜巴多糖的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的第三個目的在于提供灰兜巴多糖在降血糖保健食品和藥品領域中的應 用。
[0008] 為實現上述目的，本發(fā)明提供一種具有降血糖作用的灰兜巴多糖，其峰位分子量 Mp為5000~15000Da，重均分子量Mw為7000~90000Da，數均分子量Μη為5000~30000Da。
[0009] 本發(fā)明目的可以通過以下技術方案實現：
[0010] -種灰兜巴多糖的制備方法，包括以下步驟：
[0011] (1)將灰兜巴除雜洗凈并干燥，粉碎得灰兜巴粉；
[0012] (2)向灰兜巴粉中加入去離子水進行多糖提取，離心得上清液；
[0013] (3)上清液脫色脫蛋白后，再將溶液經過超濾膜分離純化，收集截留端和透過端流 出的溶液分別得到灰兜巴多糖1和分子量較小的灰兜巴多糖2;其中，用活性炭脫色，用 Sevag法脫蛋白；
[0014] (4)向灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2中加入無水乙醇，使最終的乙醇體積分數為80 ~90%，靜置離心，收集沉淀；
[0015] (5)將沉淀物冷凍干燥，得粉末狀的灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2。
[0016] 步驟(1)中干燥溫度為40~50°C。
[0017] 步驟(2)中加入的去離子水的體積為灰兜巴的重量的25~30倍，即灰兜巴的重量 與去離子水的體積之比為1:25~1:30g/ml。
[0018] 步驟(2)中提取溫度為90~95°C，提取時間2.5~3.0h，提取次數為2~3次。
[0019 ] 步驟(3)中所述脫色脫蛋白為：向上清液中加入2 %~5 %的活性炭，55~60 °C下振 蕩2~3h，離心去除沉淀；向清液中加入Sevag試劑，磁力攪拌，分液收集上層清液，再加入 Sevag試劑，重復操作5~10次;靜置，去除中層和下層，保留上層。
[0020]所述Sevag試劑的體積與灰兜巴多糖溶液體積之比為1: 4。
[0021]所述Sevag試劑包括氯仿和正丁醇，其中，氯仿與正丁醇的體積之比為4:1。
[0022] 步驟(2)所述離心為4000~5000rmp/min的轉速離心10~15min。
[0023] 步驟(3)中使用10kDa的超濾膜。
[0024] 步驟(4)中靜置的溫度為0~4°C，時間為12~24h。
[0025] 步驟(4)中離心速度為4000~5000rmp/min。
[0026] 上述方法制備的灰兜巴多糖的峰位分子量Mp為5000~15000Da，重均分子量Mw為 7000 ~90000Da，數均分子量 Μη 為 5000 ~30000Da。
[0027] 本發(fā)明具有如下的優(yōu)點和有益效果：
[0028] (1)本發(fā)明制備方法安全無毒，綠色環(huán)保，能耗低，生產成本低，且對設備要求不 高，非常有利于工業(yè)化生產。
[0029] (2)本發(fā)明制備方法可高效地分離得降血糖活性更高的灰兜巴多糖，篩選得到灰 兜巴多糖2,其峰位分子量Mp為6277Da，重均分子量Mw為9703Da，數均分子量Μη為7144Da。本 發(fā)明所涉及的灰兜巴多糖2能顯著降低Π 型糖尿病KKAy小鼠的血糖、血脂和糖化血紅蛋白， 改善葡萄糖耐量，改善糖脂代謝，具有體外抗氧化作用，適用于制備具有降血糖作用的保健 食品和藥品。
【附圖說明】
[0030] 圖1為灰兜巴多糖1的凝膠滲透色譜圖。
[0031] 圖2為灰兜巴多糖2的凝膠滲透色譜圖。
[0032]圖3為灰兜巴多糖和Vc對DPPH的清除能力。
[0033]圖4為灰兜巴多糖和Vc對ABTS的清除能力。
【具體實施方式】
[0034]為了更好地理解本發(fā)明，下面結合實施例進一步說明本發(fā)明，并不是對本發(fā)明的 權利要求保護范圍的進一步限定。
[0035]實施例1:灰兜巴多糖的制備
[0036] 稱取干燥的灰兜巴原料200g，加入6L去離子水，95 °C提取3h，經400目紗布過濾，過 濾所得殘渣在相同操作條件下重復提取2次，合并提取液，4000rmp/min離心10min得上清 液；向上清液中加入200g活性炭，55°C振蕩2.5h，8000rmp/min的轉速離心15min得上清液， 呈淡黃色；向上清液中加入1250mL的Sevag試劑，磁力攪拌15min后，在分液漏斗中靜置15~ 20min，去除中層和下層，保留上層，重復操作8次，加入無水乙醇，使最終的乙醇體積分數為 80~90%，在0~4°C下靜置12~24h;離心，收集沉淀，冷凍干燥即得灰兜巴多糖固體粉末。 [0037]實施例2:灰兜巴多糖的制備
[0038] 稱取干燥的灰兜巴原料200g，加入6L去離子水，95 °C提取3h，經400目紗布過濾，過 濾所得殘渣在相同操作條件下重復提取2次，合并提取液，4000rmp/min離心10min得上清 液；向上清液中加入200g活性炭，55°C振蕩2.5h，8000rmp/min的轉速離心15min得上清液， 呈淡黃色；向上清液中加入1250mL的Sevag試劑，磁力攪拌15min后，在分液漏斗中靜置15~ 20min，去除中層和下層，保留上層，重復操作8次。將上層清液用lOkDa的超濾膜純化分級， 收集截留端和透過端流出的溶液分別得到灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2;向兩種溶液中加入 無水乙醇，使最終的乙醇體積分數為80~90%，在0~4°C下靜置12~24h;離心，收集沉淀， 冷凍干燥即得灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2固體粉末。
[0039]實施例3:灰兜巴多糖的分子量測定
[0040] 采用高效凝膠滲透色譜法(GPC)測定灰兜巴多糖的分子量。采用的色譜條件為： TSK-GEL G-5000PWXL column(7.8mmX300mm)色譜柱串聯(lián)TSK-GEL G-3000PWXL column (7.8mm X 300mm)色譜柱;pH6.0的0.02mo 1/L KH2PO4溶液作為流動相，流速為0.6mL/min;柱 溫35°C;檢測器為waters 2414示差檢測器；以Dextran系列葡聚糖為標準品。灰兜巴多糖1 和灰兜巴多糖2的GPC凝膠滲透色譜圖如圖1和圖2所示?；叶蛋投嗵?和灰兜巴多糖2的平均 分子量分別為3657 IDa和6277Da。
[0041] 實施例4:灰兜巴多糖的降血糖、降血脂作用的評價
[0042] (1)實驗樣品
[0043]本發(fā)明提取分離的灰兜巴多糖1、2,為淡黃色固體粉末;利用現有技術提取的灰兜 巴粗多糖。
[0044] (2)實驗動物
[0045] SPF級自發(fā)性Π 型糖尿病KKAy小鼠31只，雌性，體重約為30 ± 5g/只，6~8周齡。SPF 級C57BL/6J小鼠6只，雌性，體重約為20 ± 5g/只，6~8周齡。KKAy小鼠和C57BL/6J小鼠由中 國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供。
[0046] (3)實驗試劑和儀器
[0047]鹽酸二甲雙胍，中美上海施貴寶制藥有限公司；生理鹽水，廣東利泰制藥股份有限 公司；糖化血紅蛋白、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白試劑盒，上?？迫A 生物工程股份有限公司。羅氏卓越型血糖儀，德國羅氏診斷有限公司；高速臺式冷凍離心 機，湘儀離心機廠;切向流超濾系統(tǒng)，美國Merck Mi 11 ipore公司；冷凍干燥機;美國VirTis 公司；電子天平，德國Sartorious公司；數顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；全自動生 化分析儀，日本島津公司。
[0048] (4)實驗方法
[0049]自發(fā)性Π 型糖尿病KKAy小鼠，6~8周齡，體重為30 ± 5g/只，先以普通飼料適應性 喂養(yǎng)1周，之后再予高糖高脂飼料喂養(yǎng)2周。禁食不禁水12h，于早晨9時尾尖采血測空腹血 糖，空腹血糖大于11. lmmol/L者確定為建模成功的小鼠，可用于實驗中。C57BL/6J小鼠，6~ 8周齡，體重為20 ± 5g/只，以普通飼料喂養(yǎng)3周，禁食不禁水12h，早晨9時斷尾法取血測隨機 血糖，血糖在4.4~7.9mmol/L者確定為血糖正常的小鼠，可用于實驗中。
[0050] 將造模成功的Π 型糖尿病KKAy模型小鼠隨機分成5組(n = 6)，分別為糖尿病模型 對照組、陽性對照組(灌胃鹽酸二甲基雙胍)和灰兜巴多糖實驗組(灰兜巴粗多糖組、灰兜巴 多糖1組、灰兜巴多糖2組，灌胃劑量為200mg/kg)，以C57BL/6J的正常小鼠為正常對照組(灌 胃生理鹽水）。
[0051] 各組小鼠每天灌胃給藥一次，連續(xù)灌胃給藥35d。分別于給藥前和給藥后第7d， 14d，21d，28d，35d測定空腹血糖。實驗周期結束后，尾靜脈取血用血糖儀測定空腹血糖作為 Omin的血糖值。然后給予2g/kg的葡萄糖溶液灌胃，糖負荷后第30、60、90、12011^11時尾靜脈 采血測定血糖值，繪制葡萄糖耐量曲線。然后小鼠眼眶取血，置于用EDTA(抗凝血劑)包被的 2mL離心管中，4°C下4000r/min離心10min，小心地將血清和紅細胞迅速分離，收集血清，按 照糖化血紅蛋白、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白試劑盒的說明書所規(guī) 定的測定方法，利用全自動生化儀測定血清中糖化血紅蛋白、甘油三酯、總膽固醇、低密度 脂蛋白、高密度脂蛋白的水平。
[0052] (5)實驗結果
[0053] 結果表明：模型組KKAy小鼠的空腹血糖明顯高于正常組C57BL/6J小鼠。經連續(xù)35d 的灌胃給藥治療，灰兜巴多糖1、灰兜巴多糖2和灰兜巴多糖均能降低Π 型糖尿病KKAy小鼠 的空腹血糖，與模型組相比有明顯差異。降低Π 型糖尿病KKAy小鼠空腹血糖的效果依次為 灰兜巴多糖2>灰兜巴多糖1 >灰兜巴多糖，其中灰兜巴多糖2的效果最佳。結果見表1。
[0054] 表1灰兜巴多糖對Π 型糖尿病KKAy小鼠空腹血糖的影響
[0055]
[0057] 注:與正常組比較ap〈0.05;與模型組比較bp〈0.05
[0058] Π 型糖尿病KKAy小鼠糖化血紅蛋白明顯升高，顯著高于正常組C57BL/6J小鼠。經 過連續(xù)35d灌胃灰兜巴多糖治療，灰兜巴多糖1、灰兜巴多糖2和灰兜巴多糖均能降低Π 型糖 尿病KKAy小鼠的糖化血紅蛋白，與模型對照組相比有顯著差異。其中灰兜巴多糖2降低KKAy 小鼠糖化血紅蛋白的效果最好，但低于鹽酸二甲雙胍的作用效果。結果見表2。
[0059] 表2灰兜巴多糖對Π 型糖尿病KKAy小鼠糖化血紅蛋白的影響
[0060]
[0061 ] 注:與正常組比較ap〈0.05;與模型組比較bp〈0.05
[0062]模型組KKAy小鼠葡萄糖耐量顯著低于正常組C57BL/6J小鼠，體現了葡萄糖不耐受 的Π 型糖尿病典型特征。經過灰兜巴多糖給藥治療，灰兜巴多糖1、灰兜巴多糖2和灰兜巴多 糖均能改善Π 型糖尿病KKAy小鼠的葡萄糖耐量，灰兜巴多糖2對糖尿病KKAy小鼠的糖耐受 量具有十分明顯的改善作用，但低于陽性藥鹽酸二甲雙胍的作用效果。結果見表3。
[0063] 表3灰兜巴多糖對Π 型糖尿病KKAy小鼠葡萄糖耐量的影響
[0064]
[0066] 注:與正常組比較ap〈0 · 05;與模型組比較bp〈0 · 05
[0067] Π 型糖尿病KKAy小鼠血清中TC、TG、LDL_c含量顯著升高，明顯高于正常對照組 C57BL/6J小鼠；而HDL/LDL降低，明顯低于正常對照組C57BL/6J小鼠，表明KKAy小鼠的脂質 代謝紊亂，高血脂癥伴隨著高血糖癥。經過灌胃灰兜巴多糖治療，灰兜巴多糖、灰兜巴多糖1 和灰兜巴多糖2能不同程度地降低Π 型糖尿病KKAy小鼠的TC、TG和LDL-c，以及不同程度的 升高HDL/LDL，但低于陽性藥鹽酸二甲基雙胍的作用效果，證實灰兜巴多糖2具有良好的調 節(jié)血脂水平，改善脂質代謝異常的作用，預防動脈硬化和血栓形成，防治糖尿病心血管并發(fā) 癥。結果見表4。
[0068] 表4灰兜巴多糖對Π 型糖尿病KKAy小鼠血脂水平的影響 [0069]
[0070] 注:與正常組比較ap〈0.05;與模型組比較bp〈0.05 [0071 ]實施例5:灰兜巴多糖的體外抗氧化作用實驗 [0072] (1)實驗樣品
[0073]本發(fā)明提取分離的灰兜巴多糖1、2,為淡黃色固體粉末;利用現有技術提取的灰兜 巴多糖，為灰褐色。
[0074] (2)實驗試劑和儀器
[0075]甲醇，國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇，天津富宇化工試劑有限公司；二氧 化錳，天津市科密歐化學試劑有限公司；〇??!1^8了5、￥(3，美國5丨81^公司。數顯恒溫水浴鍋， 常州澳華儀器有限公司；切向流超濾系統(tǒng)，美國Merck Millipore公司;低速離心機，北京時 代北利離心機有限公司;冷凍干燥機，美國VirTis公司;酶標儀，瑞士 TECAN公司。
[0076] (3)實驗方法
[0077] DPPH清除能力：取一定量的DPPH粉末溶于甲醇中，配制成6mmo 1 /L的DPPH儲備液。 在使用時，用甲醇稀釋將DPPH儲備液為60ymol/L的DPPH工作液。稱取灰兜巴多糖溶于蒸餾 水中，分別配制成濃度為0.01，0.05,0.1，0.15,0.2mg/mL的多糖溶液。再加入150yL新配制 的DPPH工作液和150yL的95%乙醇溶液，搖勻后，黑暗下放置30min，在517nm下測定吸光度 值記為Aim，以乙醇代替DPPH乙醇溶液測定吸光值記為A背景，以去離子水代替樣品溶液測定 吸光值記為A空白。配制濃度為0.01，0.05,0.1，0.15,0.2mg/mL的Vc溶液，重復以上步驟作為 陽性對照。平行測定三次后取平均值。按下式計算DPPH清除率：
[0078] DPPH)禽除率（％) = -XI00 A $0
[0079] ABTS清除能力：用pH 7.4的roS緩沖液配置成最終濃度為5mmol/L ABTS水溶液，室 溫下與過量的二氧化錳(Μη02)反應后，經0.2μπι的PVDF微孔濾膜過濾，制得ABTS存儲液，使 用時用ρΗ7.4的PBS緩沖液稀釋至734nm處吸光度為0.70 ±0.02得到ABTS工作液。在96孔板 中加入20yL的樣品溶液，然后加入180yL的ABTS工作液，振蕩混合均勻，室溫下后測定其在 734nm處的吸光值記為A '樣a，以緩沖液代替ABTS工作液測定的吸光值記為A '背景，以緩沖液代 替樣品溶液作為空白對照A'》。平行測定三次后取平均值。ABTS自由基清除率根據下式計 算：
[0080]
[0081] (4)實驗結果
[0082]由圖3可知，灰兜巴多糖對DPPH自由基的清除能力強弱依次為灰兜巴多糖2>灰兜 巴多糖〉灰兜巴多糖1，其中灰兜巴多糖2清除DPPH自由基的能力最強。但與陽性對照Vc相 比，灰兜巴多糖2的清除DPPH能力明顯低于Vc。
[0083]由圖4可知，在較低濃度下，灰兜巴多糖、灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2對ABTS自由 基的清除能力相差不大，隨著灰兜巴多糖濃度的升高，其清除ABTS自由基的能力逐漸增強。 清除ABTS自由基的能力強弱依次為:灰兜巴多糖2>灰兜巴多糖〉灰兜巴多糖1，其中灰兜巴 多糖2清除ABTS的能力最強，但均低于抗氧化劑Vc清除ABTS自由基的能力。
[0084]以上實驗證明，灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2具有降低Π 型糖尿病KKAy小鼠的空腹 血糖和糖化血紅蛋白，改善葡萄糖耐量，改善糖脂代謝，以及體外抗氧化作用，其中灰兜巴 多糖2的降血糖、降血脂和抗氧化作用最強，提示本發(fā)明公開的制備方法能高效地篩選出活 性更高的灰兜巴多糖。
【主權項】
1. 一種灰兜巴多糖的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將灰兜巴除雜洗凈并干燥，粉碎得灰兜巴粉； (2) 向灰兜巴粉中加入去離子水進行多糖提取，離心得上清液； (3) 上清液經脫色脫蛋白后，再將溶液經過超濾膜分離純化，收集截留端和透過端流出 的溶液分別得到灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2;其中，用活性炭脫色，用Sevag法脫蛋白； (4) 向灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2中加入無水乙醇，使最終的乙醇體積分數為80~ 90%，靜置離心，收集沉淀； (5) 將沉淀物冷凍干燥，得粉末狀的灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中灰兜巴的重量與去離子水 的體積之比為1:25~1:30g/ml。3. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)提取溫度為90~95°C，提取時 間2.5~3. Oh，提取次數為2~3次。4. 根據權利要求1或2或3所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述脫色脫蛋白為： 向上清液中加入2 %~5 %的活性炭，55~60°C下振蕩2~3h，離心去除沉淀；向清液中加入 Sevag試劑，Sevag試劑的體積與灰兜巴多糖溶液體積之比為1:4，磁力攪拌，分液收集上層 清液，再加入Sevag試劑，重復操作5~10次;靜置，去除中層和下層，保留上層。5. 根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述Sevag試劑包括氯仿和正丁醇，其 中，氯仿與正丁醇的體積之比為4:1。6. 根據權利要求1或2或3的制備方法，其特征在于，步驟(4)中靜置的溫度為0~4°C，時 間為12~24h;離心速度為4000~5000rmp/min。7. 根據權利要求1或2或3所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)所述離心為4000~ 5000rmp/min的轉速離心 10~15min。8. 根據權利要求1或2或3所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中使用IOkDa的超濾 膜。9. 根據權利要求1或2或3所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中干燥溫度為40~50 cC。10. 權利要求1~9任意一項所述方法制備的灰兜巴多糖，其特征在于，該灰兜巴多糖的 峰位分子量Mp為5000~15000Da，重均分子量Mw為7000~90000Da，數均分子量Mn為5000~ 30000Da〇
【文檔編號】A61K31/715GK105906737SQ201610330803
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】李琳, 周新, 李冰, 黃吉東, 張霞, 蘇健裕, 徐振波
【申請人】華南理工大學, 廣東中輕楓泰生化科技有限公司