一種收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明一種收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法，包括一個(gè)培養(yǎng)畢赤酵母細(xì)胞的步驟，將畢赤酵母接種到培養(yǎng)基上，在22～32℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～48 h活化，畢赤酵母在培養(yǎng)基中增殖得到畢赤酵母培養(yǎng)液；然后用去離子水置換掉培養(yǎng)基，獲得畢赤酵母細(xì)胞溶液；一個(gè)配制酵母細(xì)胞分離液的步驟，將淋巴細(xì)胞分離液和聚蔗糖溶液進(jìn)行混合得到酵母細(xì)胞分離液；一個(gè)離心分離方法，將畢赤酵母細(xì)胞溶液和酵母細(xì)胞分離液混合，然后進(jìn)行離心；收集上層溶液，70%以上的活細(xì)胞在上層溶液中。本發(fā)明的方法是一種簡(jiǎn)單、易行篩選畢赤酵母細(xì)胞的方法，可以應(yīng)用到畢赤酵母細(xì)胞連續(xù)誘變，畢赤酵母耐受壓力特性的篩選中。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種畢赤酵母，具體來(lái)說(shuō)是一種收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]畢赤酵母是一種能利用甲醇為碳源，且高效表達(dá)外源蛋白的工業(yè)微生物。畢赤酵母來(lái)源多種外源蛋白作為工業(yè)用酶和蛋白藥物已經(jīng)商業(yè)化。所以越來(lái)越受到人們的重視。目前，提高外源蛋白的表達(dá)量仍然是很多研究的目的。例如利用外源基因高拷貝數(shù)提高外源蛋白的表達(dá)量，例如利用提高外源基因的拷貝數(shù)將人腫瘤壞死因子的表達(dá)量提高200多倍。利用畢赤酵母有成熟的基因敲除技術(shù)開(kāi)發(fā)不同表型的宿主和代謝控制研究。例如減少蛋白酶降解外源蛋白SMD1168菌株。從培養(yǎng)角度上看，控制畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中溶氧恒定(20%以上)，保證畢赤酵母代謝甲醇的能力。細(xì)胞在溶氧過(guò)高時(shí)由于甲醇供應(yīng)量不足導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生死亡。其次是控制恒定甲醇濃度。MutS型畢赤酵母誘導(dǎo)過(guò)程中甲醇濃度一般控制在
0.2?0.8%。這樣的低甲醇濃度不能提供充足的能量，限制了外源蛋白的表達(dá)，細(xì)胞死亡率達(dá)到35%。高密度發(fā)酵過(guò)程中還出現(xiàn)大量細(xì)胞的凋亡，表現(xiàn)為代謝活力降低。這是由于畢赤酵母耐受甲醇或者耐受培養(yǎng)條件的能力決定的。降溫可以減少細(xì)胞死亡率，但是細(xì)胞死亡率依然隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而升高，而且低溫降低細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和外源蛋白的表達(dá)。所以篩選到耐受性好，使培養(yǎng)過(guò)程中活細(xì)胞比例高的畢赤酵母對(duì)畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的量具有良好的潛力。由于工業(yè)上的需要，篩選有更好性質(zhì)的畢赤酵母是有必要的。亞硝基胍(NTG)誘變微生物的方法已經(jīng)較為成熟，具有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。NTG誘變過(guò)程需要連續(xù)誘變的步驟，通常的連續(xù)誘變是采用從前一個(gè)步驟中取一部分樣品繼續(xù)培養(yǎng)，誘變的重復(fù)步驟。在去一部分樣品的步驟中就損失了前面幾步誘導(dǎo)的細(xì)胞，降低了獲得目的細(xì)胞的機(jī)率。所以，去掉誘導(dǎo)后的死細(xì)胞，然后繼續(xù)誘導(dǎo)，去掉取樣的步驟，可以提高NTG誘導(dǎo)畢赤酵母的機(jī)率。密度梯度離心法已經(jīng)成功用于分離哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這是由于不同種類(lèi)哺乳動(dòng)物的密度有所差別。畢赤酵母死細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞器被液泡降解的現(xiàn)象，所以推斷也會(huì)導(dǎo)致與畢赤酵母活細(xì)胞密度的不同。本研究利用聚蔗糖離心的方法探討了去除畢赤酵母死細(xì)胞的可能性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法，所述的這種收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法要解決現(xiàn)有技術(shù)的發(fā)酵過(guò)程中畢赤酵母的死細(xì)胞較多，從而影響細(xì)胞連續(xù)誘變的技術(shù)問(wèn)題。
[0004]本發(fā)明提供了一種收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
I)一個(gè)培養(yǎng)畢赤酵母細(xì)胞的步驟，將畢赤酵母接種到培養(yǎng)基上，在22?32°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12?48 h活化，畢赤酵母在培養(yǎng)基中增殖得到畢赤酵母培養(yǎng)液;然后用去離子水置換掉培養(yǎng)基，獲得畢赤酵母細(xì)胞溶液，所述的酵母細(xì)胞濃度為4.35 X 17?1.39 X 109/ml，所述的畢赤酵母細(xì)胞的存活率為10?80%;
2)—個(gè)配制酵母細(xì)胞分離液的步驟，將淋巴細(xì)胞分離液和質(zhì)量百分比濃度為50%的聚蔗糖溶液按照1:3?3:1的體積比進(jìn)行混合得到酵母細(xì)胞分離液；
3)—個(gè)離心分離方法，將畢赤酵母細(xì)胞溶液和酵母細(xì)胞分離液按照1:3?3:1的體積比混合，然后進(jìn)行離心；
4)收集上層溶液，70%以上的活細(xì)胞在上層溶液中。
[0005]進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基選自YH)培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)、BSM培養(yǎng)基、或者PTMl培養(yǎng)基。
[0006]進(jìn)一步的，所述的YPD培養(yǎng)基中:酵母膏的質(zhì)量百分比濃度為1%，蛋白胨的質(zhì)量百分比濃度為2%，葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為2%，余量為蒸餾水。
[0007]進(jìn)一步的，所述的BMGY培養(yǎng)基中，酵母粉的質(zhì)量百分比濃度為1%，蛋白胨的質(zhì)量百分比濃度為2%，酵母的質(zhì)量百分比濃度為13.4%，pH6.0?7.0的磷酸緩沖液在培養(yǎng)基中的濃度為0.1 mo 1/L，甘油的質(zhì)量百分比濃度為10%，余量為蒸餾水。
[0008]進(jìn)一步的，所述的BSM培養(yǎng)基中，甘油的濃度為40g/L，硫酸鉀的濃度為18.6 g/L,七水硫酸鎂的濃度為14.9 g/L，氫氧化鉀的濃度為4.13 g/L，磷酸的濃度為26.7 mL/L，硫酸鈣的濃度為0.93 g/L, PTMl的濃度為4.35mL/L。
[0009]進(jìn)一步的，所述的PTMl培養(yǎng)基中，硫酸銅的濃度為6g/L，碘化鉀的濃度為0.09 g/L，硫酸錳的濃度為3 g/L，硼酸的濃度為0.02 g/L，鉬酸鈉的濃度為0.24 g/L，氯化鈷的濃度為0.5 g/L，氯化鋅的濃度為20 g/L，硫酸亞鐵的濃度為65 g/L，生物素的濃度為0.2 g/L，濃硫酸的濃度為5.0 mL/Lo
[0010]進(jìn)一步的，所述酵母細(xì)胞分離液中，淋巴細(xì)胞分離液的體積百分比為25%?75%。
[0011]進(jìn)一步的，所述酵母細(xì)胞分離液中，淋巴細(xì)胞分離液的體積百分比為27.5%，余量為聚蔗糖溶液。
[0012]進(jìn)一步的，離心條件為1000?10，000 r/min、I.0?30.0 min。
[0013]進(jìn)一步的，畢赤酵母的培養(yǎng)條件為28?32°C。
[0014]進(jìn)一步的，所述的畢赤酵母細(xì)胞濃度優(yōu)選4.35 X 18?1.13X 10%1。
[0015]進(jìn)一步的，所述的畢赤酵母細(xì)胞的存活率為10?80%，優(yōu)選的為10?30%。
[0016]本發(fā)明的原理是:死亡的畢赤酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁可能會(huì)發(fā)生裂解，所以會(huì)有細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)釋放到發(fā)酵液中，也導(dǎo)致死亡的畢赤酵母細(xì)胞和活畢赤酵母細(xì)胞的密度有差另IJ。本研究采用蔗糖密度梯度離心的方式從密度差異的角度分離死亡和活的畢赤酵母細(xì)胞。
[0017]本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明的方法是一種簡(jiǎn)單、易行篩選畢赤酵母細(xì)胞的方法，可以應(yīng)用到畢赤酵母細(xì)胞連續(xù)誘變，畢赤酵母耐受壓力特性的篩選中。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1酵母細(xì)胞分離液密度對(duì)畢赤酵母活細(xì)胞在上下兩層分配的影響(■表示上層中活細(xì)胞比例，?表示下層活細(xì)胞比例)。
[0019]圖2細(xì)胞濃度對(duì)活細(xì)胞在酵母細(xì)胞分離液上下兩層分配的影響(■表示上層中活細(xì)胞比例，?表示下層活細(xì)胞比例)。
[0020]圖3畢赤酵母細(xì)胞中活細(xì)胞比例對(duì)離心分離活細(xì)胞的影響(■表示上層中活細(xì)胞比例，?表示下層活細(xì)胞比例)。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0022]實(shí)施例1
第一步、畢赤酵母細(xì)胞的培養(yǎng)
將畢赤酵母到培養(yǎng)基上，在22°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h活化，畢赤酵母在培養(yǎng)基中增殖得到畢赤酵母培養(yǎng)液;然后用去離子水置換掉培養(yǎng)基，細(xì)胞濃度為I.39 X 109/ml。
[0023]第二步、酵母細(xì)胞分離液的配制
將淋巴細(xì)胞分離液和質(zhì)量百分比濃度為50%的聚蔗糖溶液進(jìn)行混合得到酵母細(xì)胞分離液(以淋巴細(xì)胞分離液計(jì)25?75%)。
[0024]第三步、離心分離方法
將畢赤酵母細(xì)胞溶液和酵母細(xì)胞分離液(1: 3?3:1)混合，進(jìn)行離心1000 rpm, 30
min；
第四步、總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)測(cè)定
總細(xì)胞計(jì)數(shù)利用雪球計(jì)數(shù)板方法。活細(xì)胞計(jì)數(shù)用稀釋平板法。
[0025]離心后畢赤酵母活細(xì)胞在不同密度的酵母細(xì)胞分離液的上下層分配比例見(jiàn)圖1。隨著酵母細(xì)胞分離液密度的增大，上層中畢赤酵母活細(xì)胞的比例由10.99%逐漸增大92.80%，下層中畢赤酵母活細(xì)胞的比例由89.01%下降到7.20%。其中，在酵母細(xì)胞分離液的密度為1.1467 g/ml(27.5%淋巴細(xì)胞分離液+72.5%聚蔗糖溶液)，上下層細(xì)胞中活細(xì)胞分配差別達(dá)到最大，為94.67%和5.33%。
[0026]實(shí)施例2
第一步、畢赤酵母細(xì)胞的培養(yǎng)
將畢赤酵母到培養(yǎng)基上，在32°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h活化，畢赤酵母在培養(yǎng)基中增殖得到畢赤酵母培養(yǎng)液;然后用去離子水置換掉培養(yǎng)基，在畢赤酵母細(xì)胞濃度在4.35 X 17?1.39 X 109/ml ο
[0027]第二步、酵母細(xì)胞分離液的配制
將淋巴細(xì)胞分離液和質(zhì)量百分比濃度為50%的聚蔗糖溶液進(jìn)行混合得到酵母細(xì)胞分離液(25%淋巴細(xì)胞分離液+75%聚蔗糖溶液)；
第三步、離心分離方法
將畢赤酵母細(xì)胞溶液和酵母細(xì)胞分離液混合，進(jìn)行離心10，000rpm，1.0 min；
第四步、總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)測(cè)定
總細(xì)胞計(jì)數(shù)利用雪球計(jì)數(shù)板方法。活細(xì)胞計(jì)數(shù)用稀釋平板法。
[0028]畢赤酵母細(xì)胞濃度對(duì)以酵母細(xì)胞分離液分離酵母活細(xì)胞的影響見(jiàn)圖2。在較低和較高的細(xì)胞密度時(shí)活細(xì)胞在酵母細(xì)胞分離液上下兩層的分配比例有波動(dòng)。畢赤酵母的細(xì)胞濃度為4.35 X 18?1.13 X 109/ml時(shí)，在上下兩層的分配比例約為95%和5%。
[0029]實(shí)施例3
第一步、畢赤酵母細(xì)胞的培養(yǎng)將畢赤酵母到培養(yǎng)基上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h活化，畢赤酵母在培養(yǎng)基中增殖得到畢赤酵母培養(yǎng)液;然后用去離子水置換掉培養(yǎng)基，總細(xì)胞濃度為I.2 X 109/ml時(shí)，。
[0030]第二步、酵母細(xì)胞分離液的配制
將淋巴細(xì)胞分離液和質(zhì)量百分比濃度為50%的聚蔗糖溶液進(jìn)行混合得到酵母細(xì)胞分離液；
第三步、離心分離方法
將畢赤酵母細(xì)胞溶液和酵母細(xì)胞分離液混合和，進(jìn)行離心；
第四步、總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)測(cè)定
總細(xì)胞計(jì)數(shù)利用雪球計(jì)數(shù)板方法?；罴?xì)胞計(jì)數(shù)用稀釋平板法。
[0031]畢赤酵母存活率不同時(shí)，分離效果見(jiàn)圖3。畢赤酵母的存活率為11%時(shí)，活細(xì)胞在酵母細(xì)胞分離液上下兩層分配分別為91.01%和8.99%。隨著畢赤酵母存活率逐漸升高，酵母細(xì)胞分離液上下兩層中活細(xì)胞的分配差別逐漸變小。當(dāng)畢赤酵母存活率為84.04%時(shí)，活細(xì)胞在酵母細(xì)胞分離液上下兩層分配分別為70.05%和29.55%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)一個(gè)培養(yǎng)畢赤酵母細(xì)胞的步驟，將畢赤酵母接種到培養(yǎng)基上，在22°c-32°c的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12?48 h活化，畢赤酵母在培養(yǎng)基中增殖得到畢赤酵母培養(yǎng)液;然后用去離子水置換掉培養(yǎng)基，獲得畢赤酵母細(xì)胞溶液，所述的酵母細(xì)胞濃度為4.35 X 17?1.39 X 109/ml，所述的畢赤酵母細(xì)胞的存活率為10?80%; 2)—個(gè)配制酵母細(xì)胞分離液的步驟，將淋巴細(xì)胞分離液和質(zhì)量百分比濃度為50%的聚蔗糖溶液按照1:3?3:1的體積比進(jìn)行混合得到酵母細(xì)胞分離液； 3)—個(gè)離心分離方法，將畢赤酵母細(xì)胞溶液和酵母細(xì)胞分離液按照1:3?3:1的體積比混合，然后進(jìn)行離心； 4)收集上層溶液，70%以上的活細(xì)胞在上層溶液中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基選自YPD培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)、BSM培養(yǎng)基、或者PTMl培養(yǎng)基。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述的YPD培養(yǎng)基中:酵母膏的質(zhì)量百分比濃度為1%，蛋白胨的質(zhì)量百分比濃度為2%，葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為2%，余量為蒸餾水。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述的BMGY培養(yǎng)基中，酵母粉的質(zhì)量百分比濃度為1%，蛋白胨的質(zhì)量百分比濃度為2%，酵母的質(zhì)量百分比濃度為13.4%，pH 6.0?7.0的磷酸緩沖液在培養(yǎng)基中的濃度為0.1 mol/L，甘油的質(zhì)量百分比濃度為10%，余量為蒸餾水。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述的BSM培養(yǎng)基中，甘油的濃度為40 g/L，硫酸鉀的濃度為18.6 g/L，七水硫酸鎂的濃度為14.9 g/L，氫氧化鉀的濃度為4.13 g/L，磷酸的濃度為26.7 1^/1，硫酸鈣的濃度為0.93 g/L, PTMl的濃度為4.35 mL/Lo6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述的PTMl培養(yǎng)基中，硫酸銅的濃度為6 g/L，碘化鉀的濃度為0.09 g/L，硫酸猛的濃度為3 g/L，硼酸的濃度為0.02 g/L，鉬酸鈉的濃度為0.24 g/L，氯化鈷的濃度為0.5 g/L，氯化鋅的濃度為20 g/L,硫酸亞鐵的濃度為65 g/L，生物素的濃度為0.2 g/L，濃硫酸的濃度為5.0 mL/L。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述酵母細(xì)胞分離液中，淋巴細(xì)胞分離液的體積百分比為25?75%。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述酵母細(xì)胞分離液中，淋巴細(xì)胞分離液的體積百分比為27.5%，余量為聚蔗糖溶液。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法，其特征在于:離心條件為1000?10000 r/min、I.0?30.0 min。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的收集畢赤酵母活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述的畢赤酵母細(xì)胞濃度優(yōu)選為4.35 X 18?1.13 X 109/ml。
【文檔編號(hào)】C12N1/02GK105907654SQ201610342591
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月23日
【發(fā)明人】張建國(guó), 劉泰瑜, 張燕, 馮豪, 藍(lán)娜娜
【申請(qǐng)人】上海理工大學(xué)