一種雙孢蘑菇內生菌及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙孢蘑菇內生菌及其應用，雙孢蘑菇內生菌為賴氨酸芽孢桿菌，命名為賴氨酸芽孢桿菌SCAU1，保藏編號為CCTCCM2016106。本發(fā)明從雙孢蘑菇中分離出的功能內生菌，不僅促進植物生長、抑制植物病原真菌和病原細菌的生長且具備高效纖維素降解能力，可用于“肥藥兼效型”微生物肥料的制作，改善土壤理化性質，促進植物生長；連續(xù)三次盆栽實驗顯示SCAU1發(fā)酵液經清水稀釋后，采用灌根方式對玉米苗表現出明顯的促生作用，能夠明顯提高玉米苗期的根數、根長、株高、葉片數量和葉面積；以烤煙為供試植物，進行SCAU1的大田實驗，結果顯示能提高烤煙云87團棵期的莖粗、株高、葉面積系數，提高了烤煙的產量和鉀含量。CCTCC NO:M201610620160311
【專利說明】
一種雙孢蘑菇內生菌及其應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物技術領域，尤其涉及一種雙孢蘑菇內生菌及其應用。
【背景技術】
[0002]內生菌是一類生長于活體植物組織中的特殊微生物，在植物中普遍存在，且能夠 產生與宿主相同或相似的生物活性物質。從內生菌中篩選活性高的菌株為尋找新型生物活 性物質及開發(fā)具有應用功能的微生物菌劑開辟了一條新的道路。食用菌是美食良藥兼用的 大型真菌，目前有關食用菌內生菌報道極少。
[0003] 雙孢蘑燕（Agar i cus b i sporus )在分類學上屬于真菌界（Fungi )、真菌門 ^111115^(^&)、擔子菌亞門（1^8丨(1；[01115^01：；[11&)、擔子菌綱（1^8丨(1；[01115^6七68)、傘菌目 (Agaricales)、傘菌科(Agaricaceae)、蘑燕屬(Agaricus)，它營養(yǎng)豐富，味道鮮美，色白質 嫩，富含蛋白質、多糖等營養(yǎng)成分，是一種受世界各國人民喜愛的"健康食品"，具有很好地 保健功能。雙孢蘑菇是世界上人工栽培時間最長，栽培規(guī)模最廣，栽培效益最好的"三最"大 宗食用菌，也是一類以纖維素為主要碳源，栽培過程需要覆土才能扭結出菇的大型真菌。以 雙孢蘑菇為分離源，進行內生細菌的分離并鑒定分離菌株的功能對于挖掘新的微生物菌種 資源應用于新型復合微生物菌劑的開發(fā)具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種雙孢蘑菇內生菌及其應用，通過綜合評價篩選食用菌 內部細菌的功能特性，旨在解決當前微生物肥料生產菌種單一、菌株優(yōu)良性狀退化、菌劑產 品環(huán)境適應性較弱等問題。
[0005] 本發(fā)明是這樣實現的，一種雙孢蘑菇組織內細菌，所述雙孢蘑菇內生菌為賴氨酸 芽孢桿菌，命名為賴氨酸芽孢桿菌SCAU1，保藏編號為CCTCCM2016106。該菌具有較廣泛的抗 菌作用，同時能促進植物生長，兼具"肥藥"雙效功能，使用該菌制成的微生物肥料對于在農 業(yè)種植業(yè)中減少化學肥料和農藥施用具有重要意義。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述雙孢蘑菇內生菌的分離方法，所述分離方法 選取未開傘的雙孢蘑菇子實體，進行賴氨酸芽孢桿菌的分離。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述雙孢蘑菇內生菌的鑒定方法，所述鑒定方法 包括:對賴氨酸芽孢桿菌SCAU1進行抗菌活性、IAA產生量、溶磷特性、產纖維素酶特性進行 分析。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述雙孢蘑菇內生菌制備的發(fā)酵液。
[0009] 進一步，所述制備方法包括:將篩選得到的賴氨酸芽孢桿菌SCAU1活化后接種于LB 肉湯培養(yǎng)液中，30°C，120r/min的丨旦溫搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)36h后，作為種子液以1:1比例加入 含有葡萄糖的LB肉湯培養(yǎng)基，30°C，120r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)36h使其活菌數達到10億以 上，取出備用。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述雙孢蘑菇內生菌制備的賴氨酸芽孢桿 菌SCAU1液體菌劑。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述發(fā)酵液在玉米盆栽的應用。
[0012] 進一步，將按50-200比例稀釋的SCAU1菌株的發(fā)酵液采用灌根的方式進行玉米苗 的接菌處理。
[0013] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述發(fā)酵液在烤煙的應用。
[0014] 進一步，將按50-200比例稀釋SCAU1菌株發(fā)酵液，在烤煙苗移栽時，將SCAU1進行烤 煙灌根處理。
[0015] 本發(fā)明提供的雙孢蘑菇內生菌及其應用，從雙孢蘑菇中分離出特異內生菌，不僅 可以促進植物的生長，還可以抑制植物病原真菌和細菌的生長，且具備高效纖維素降解能 力，可用于抗病促生型多功能微生物肥料的制作，改善土壤理化性質，促進植物生長;連續(xù) 三次盆栽實驗顯示SCAU1發(fā)酵液經清水稀釋后，采用灌根的方式對玉米苗表現出明顯的促 生作用，能夠明顯提高玉米苗期的根數、根長、株高、葉片數量和葉面積；以烤煙為供試植 物，進行SCAU1的大田實驗，結果顯示該菌能提高烤煙云87團棵期的莖粗、株高、葉面積系 數，提高烤煙的產量和鉀含量。本發(fā)明的賴氨酸芽孢桿菌，具有較廣泛的抗菌作用，同時能 促進植物生長，具有"肥藥"兼效功能，使用該菌制成的發(fā)酵菌劑對于在農業(yè)種植業(yè)中減少 化學肥料和農藥施用具有重要意義;菌株具有廣泛的抗菌活性，高效纖維素降解能力，同時 產生IAA，對植物具有明顯的促進生長作用，表現出多重生物學功能。該菌制作的生物肥料 能夠促進玉米和烤煙等植物的生長，同時促進烤煙品質。對于在農業(yè)生產中"減肥減藥"具 有潛在應用價值。
【附圖說明】
[0016] 圖1是本發(fā)明實施例提供的雙孢蘑菇內生菌的制備方法流程圖。
【具體實施方式】
[0017] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0018] 下面結合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細的描述。
[0019] 本發(fā)明實施例的雙孢蘑菇內生菌，經形態(tài)、生理、分子鑒定為賴氨酸芽孢桿菌 (Lysinibacillus fusiformis)，命名為賴氨酉愛芽抱桿菌(Lysinibacillus fusiformis) SCAU1，該菌株已于2016年3月11日湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山的中國典型培養(yǎng)物保 藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCM2016106。
[0020] 如圖1所示，本發(fā)明實施例的雙孢蘑菇內生菌的制備方法包括以下步驟：
[0021] S101:雙孢蘑菇子實體選擇，采集田間露地栽培的雙孢蘑菇，品種為川農蘑菇3號， 子實體燕型正常、無病蟲害、八分成熟；
[0022] S102:雙孢蘑菇內生細菌的分離，取新鮮雙孢蘑菇樣品，利用97%酒精表面消毒。 用無菌解剖刀去掉子實體表皮，用無菌鑷子取綠豆大小的內部組織，接于NB和ISP4培養(yǎng)基 平板中，以最后一遍的洗滌水作對照，以檢測表面消毒是否徹底；
[0023] S103:在28°C倒置培養(yǎng)4-5d，根據菌落大小、形態(tài)和色澤等表觀特征挑取單菌落并 進行劃線純化。通過分離，共獲得46株菌落形態(tài)各不相同的菌株。
[0024] 下面結合具體實施例對本發(fā)明的應用原理作進一步的描述。
[0025] (一)賴氨酸芽抱桿菌(Lysinibacillus fusiformis)SCAUl菌株篩選
[0026] 1、雙孢蘑菇子實體選擇
[0027]采集田間露地栽培的雙孢蘑菇，品種為川農蘑菇3號，子實體菇型正常、無病蟲害、 八分成熟。
[0028] 2、雙孢蘑菇內生細菌的分離
[0029]取步驟1中的新鮮雙孢蘑菇樣品，利用97%酒精表面消毒。用無菌解剖刀去掉子實 體表皮，用無菌鑷子取綠豆大小的內部組織，接于NB和ISP4培養(yǎng)基平板中，以最后一遍的洗 滌水作對照，以檢測表面消毒是否徹底。在28°C倒置培養(yǎng)4-5d，根據菌落大小、形態(tài)和色澤 等表觀特征挑取單菌落并進行劃線純化。通過分離，共獲得46株菌落形態(tài)各不相同的菌株。 [0030] 3、內生細菌產吲哚乙酸（IAA)測定
[0031]將步驟2中的46株菌培養(yǎng)到對數期，取菌液50μ1于含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液體 培養(yǎng)基中（約3ml)中，重復3次，28 °C 140r/min振蕩培養(yǎng)1.5天，取50μ1于洗凈的白瓷板中， 加 100μΙ顯色劑，25°C下避光30min，如果出現粉紅色，表明產生ΙΑΑ，以沒有接菌的含0.5g/L 色氨酸的牛肉膏液體培養(yǎng)基為對照。
[0032]將產吲哚乙酸的內生細菌繼續(xù)在含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-48h后，8000r/min離心5min，取上清液2ml加入4ml Salkowski顯色劑，25°C下避光30min后， 530nm下測定吸光度值。以空白培養(yǎng)基作對照，并以IAA的標準樣品對應的光密度做標準曲 線，計算IAA的產量(mg/L)。
[0033] 46株菌中有36株產生IAA，產量大于40mg/L的菌株有6株，其中SCAU1菌株IAA產量 最高，為 53.4mg/L。
[0034] 4、菌株溶磷測定
[0035] 將步驟2中的菌株用無菌牙簽點接種于含磷酸鈣的固體培養(yǎng)基上，然后倒置于28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，記錄菌株溶磷圈直徑HD值及菌落直徑⑶值，并計算其比值。46株菌 中有19株具溶磷能力，并且有5株表現較好的溶磷效果(HD/CD>2)，其中SCAU1的HD/CD值約 2.1〇
[0036] 5、產纖維素酶測定
[0037]將步驟2中的菌株點種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)2d，用lmg/mL的 剛果紅溶液侵染lh，再用lmol/L的NaCl溶液脫色lh，倒入lmol/L的HC1使背景呈藍色而使透 明圈更加明顯，記錄透明圈直徑HD值與菌落直徑CD值并計算其比值。46株菌中有29株具纖 維素酶活，SCAU1的HD/⑶值約1.8。
[0038] 6、菌株抑菌能力測定
[0039]以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、玉米彎孢病菌、玉米紋枯病菌、西瓜枯黃病菌和番 茄早疫病菌為供試病原菌，通過平板拮抗測定分離菌株對病原菌的抑制作用。記錄HD值與 CD值并計算其比值。46株供試內生細菌中有4株對上述6種病原菌均表現出抑制效果，其中 SCAU1對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的HD/CD值分別為3.4和4.2，對玉米彎孢病菌、玉米紋 枯病菌、西瓜枯黃病菌和番茄早疫病菌的HD/CD值介于約1.2~2.1。
[0040] 7、SCAU1發(fā)酵液的準備
[0041 ] 將上述步驟中篩選得到的賴氨酸芽孢桿菌(1^8；[11；^3(3；[11118；1^18丨；1^01'111丨8)30八1]1 活化后接種于LB肉湯培養(yǎng)液中，30°C，120r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)36h后，作為種子液 以1:1比例加入含有葡萄糖的LB肉湯培養(yǎng)基，30°C，120r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)36h使其活 菌數達到10億以上，取出備用。
[0042] 8、玉米盆栽應用
[0043]供試玉米品種為川單13,將按一定比例稀釋的SCAU1菌株的發(fā)酵液采用灌根的方 式進行玉米苗的接菌處理，以無菌水作對照，培養(yǎng)60后測定玉米苗相關指標。
[0044]表1玉米苗在各處理中的形態(tài)指標
[0045]
[0046]從表1可以看出，不同濃度SCAU1菌株的發(fā)酵液稀釋物對玉米苗的根數、根長、株 高、葉片數和葉綠素含量均表現出促進作用。
[0047] (二)賴氨酸芽抱桿菌(Lysinibacillus fusiformis)SCAUl菌株田間應用
[0048] 1、SCAU1液體菌劑制作
[0049]①斜面菌種（一級種）：牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂 17g，水1000mL，pH約7 · 2)，接種賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus fusiformis) SCAU1后在30°C下培養(yǎng)36小時制成一級種子。
[0050] ②液體菌種(二級種）：肉湯培養(yǎng)基（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL) 經高壓滅菌后，按200mL液體盛于300mL三角瓶比例(通氧控制）裝瓶，在無菌狀態(tài)接種賴氨 酸芽孢桿菌SCAU1斜面種子，每瓶接種2支斜面種子，溫度27-29°C，初始pH值7.0，120r/min 振蕩培養(yǎng)36h，制成賴氨酸芽孢桿菌SCAU1液體種子。
[0051] ③液體發(fā)酵:營養(yǎng)肉質培養(yǎng)液(玉米粉6g/L、豆柏17g/L、氯化鈉10g/L)經高壓滅菌 后，按200mL液體盛于500mL三角瓶比例（通氧控制）裝瓶，在無菌狀態(tài)接種SCAU1液體種子， 接種量10%(體積比），溫度27-29°(：，初始?田直7.5，125以1^11振蕩培養(yǎng)7211，制成5041]1液體 菌劑。
[0052] ④制劑保存：菌劑無菌條件下常溫保存半年或低溫(4度）1年半不影響其促生效 果。
[0053] 2、SCAU1菌劑田間應用 [0054] 供試植物:烤煙云87。
[0055]將按一定比例稀釋SCAU1菌株發(fā)酵液，在烤煙苗移栽的時候，將SCAU1進行烤煙灌 根處理，以無菌水作對照，于烤煙生長的團棵期和打頂期進行烤煙農藝性狀的測定(表2和 表3)。
[0056]表2 SCAU1菌劑對烤煙團棵期農藝性狀的影響
[0057]
[0058] 在云煙87的團棵期，SCAU1菌劑200倍以內的各稀釋液均可以有效提高烤煙的株高 和葉片數等農藝性狀指標。
[0059] 表3 SCAU1菌劑對烤煙打頂期農藝性狀的影響
[0060]
[0061 ]在云煙87的打頂期，SCAU1菌劑200倍以內的各稀釋液同樣可 [0062]以有效提高烤煙的株高、葉片數、節(jié)距和莖圍等農藝性狀指標。以上所述僅為本發(fā) 明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修 改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種雙孢蘑菇內生菌，其特征在于，所述雙孢蘑菇內生菌為賴氨酸芽孢桿菌，命名為 賴氨酸芽孢桿菌SCAU1，保藏編號為CCTCCM2016106。2. -種如權利要求1所述雙孢蘑菇內生菌的分離方法，其特征在于，所述分離方法選取 未開傘的雙孢蘑菇子實體，進行賴氨酸芽孢桿菌的分離。3. -種如權利要求1所述雙孢蘑燕內生菌的鑒定方法，其特征在于，所述鑒定方法包 括:對賴氨酸芽孢桿菌SCAUl進行抗菌活性、IAA產生量、溶磷特性、產纖維素酶特性進行分 析。4. 一種利用如權利要求1所述雙孢蘑菇內生菌制備的發(fā)酵液。5. 如權利要求4所述的發(fā)酵液的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括:將篩選得 到的賴氨酸芽孢桿菌SCAUl活化后接種于LB肉湯培養(yǎng)液中，30°C，120r/min的恒溫搖床中培 養(yǎng)，培養(yǎng)36h后，作為種子液以1:1比例加入含有葡萄糖的LB肉湯培養(yǎng)基，30°C，120r/min的 恒溫搖床中培養(yǎng)36h使其活菌數達到IO億以上，取出備用。6. -種利用如權利要求1所述雙孢蘑菇內生菌制備的賴氨酸芽孢桿菌SCAUl菌液體菌 劑。7. -種如權利要求4所述發(fā)酵液在玉米盆栽的應用。8. 如權利要求7所述玉米盆栽的應用，其特征在于，將按50-200比例稀釋的SCAUl菌株 的發(fā)酵液采用灌根的方式進行玉米苗的接菌處理。9. 一種如權利要求4所述發(fā)酵液在烤煙的應用。10. 如權利要求9所述的烤煙的應用，其特征在于，將按50-200比例稀釋SCAUl菌株發(fā)酵 液，在烤煙苗移栽時，將SCAUl進行烤煙灌根處理。
【文檔編號】C12N1/20GK105907671SQ201610280630
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】辜運富, 陳小敏, 陳強, 張小平, 余秀梅, 趙珂, 謝強
【申請人】四川農業(yè)大學