一種原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法，本發(fā)明的原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法獲得細胞總量大，分離度高，活率高，而且細菌、真菌和其他細胞的污染概率低，同時還能夠進行傳代培養(yǎng)，為血管疾病相關研究提供了良好的細胞培養(yǎng)基礎。
【專利說明】
一種原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術領域，尤其涉及一種原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離 培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002] 血管疾病發(fā)生和發(fā)展的一個主要因素是由于血管平滑肌細胞轉變成為了具有繁 殖能力的表型。近期的研究表明，平滑肌細胞能表達鈣離子通道，ICAM-1和VCAM-1。其中 ICAM-1和VCAM-1的表達可能是造成血管壁炎癥反應，并進一步造成血管疾病的原因。因此， 對血管平滑肌細胞的體外培養(yǎng)和研究可用來發(fā)現(xiàn)和確定新的血管疾病的靶向治療方法。
[0003] 目前，國內(nèi)外已經(jīng)有大量的研究者進行了小鼠/大鼠主動脈平滑肌細胞的培養(yǎng)和 藥理學特性方面的研究，原代細胞培養(yǎng)的核心是，越年輕的個體，細胞存活率越高，有特殊 年齡要求的除外。尤其是肌細胞，如：心肌、骨髂肌和平滑肌，對細胞外環(huán)境的要求比較高， 同時又比較脆弱。這就更強調(diào)了選擇新生小鼠或大鼠在培養(yǎng)主動脈平滑肌細胞時分離過程 的重要性。既往的研究多采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。其缺點在于，首先，組織塊培養(yǎng)方法的原 代細胞培養(yǎng)時間長，且并非每一塊都有細胞萌出，故細胞傳代次數(shù)和最終獲取的細胞數(shù)較 少;其次，細胞種類不純，簡單地使用組織塊消化分離培養(yǎng)，導致了非主動脈平滑肌細胞的 很多其他細胞的混入;再次，使用單一的膠原酶消化細胞，導致分離過程吹打較多，細胞分 離度差且活性降低;最后，分離細胞和培養(yǎng)細胞的過程中容易污染，導致細胞活率和活性不 尚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術中的上述問題提出的一種高純度、高活率、高活性同時低 污染的原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種新的大鼠主動脈平滑肌采集、分離和培養(yǎng) 方法，主要分為采集、分離和培養(yǎng)三大部分。
[0006] 采集操作時，首先處死新生大鼠（冰凍10分鐘或者頸椎脫白），酒精浸泡5分鐘，在 解剖顯微鏡下，打開胸腔，剪除肺組織，充分暴露胸腔的后壁。從心臟的升主動脈開始剝離 主動脈。用一只鑷子夾緊升主動脈，另一只鑷子沿胸腔后壁，逐步剝離胸主動脈，直至胸主 動脈的尾端，即入腹腔之前，剪斷主動脈。
[0007] 采集操作結束后，即行分離的培養(yǎng)步驟具體包括以下步驟：
[0008] 步驟1:清洗和預灌流
[0009] 將離體的大鼠主動脈使用含有2 %雙抗的37 °C預熱的D-Hanks溶液沖洗后，剝離血 管內(nèi)膜，灌注37 °C預熱的預灌流液，所述預灌流液配方為15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl， 3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HP〇4· 12H2〇,0.6mM/L的EGTA，2%雙抗和 1%兩性霉素；
[0010] 步驟2:沖洗灌流
[0011] 將步驟1處理后的大鼠主動脈使用37°C預熱的沖洗灌流液灌流沖洗，所述沖洗灌 流液的配方為 15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HP〇4· 12H20,3mM/L CaCl2，2 %雙抗和1 %兩性霉素；
[0012] 上述步驟1和步驟2的灌流操作均可以利用留置針軟管和小型注射器進行；
[0013] 步驟3:復合酶消化
[0014] 將步驟2處理后的大鼠主動脈置于37°C預熱的復合酶消化液中消化，其中復合酶 消化液中包括質(zhì)量比為1:1:1:1的I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶;復合 酶消化液為同等重量的四種酶溶于PBS、D-hanks溶液或一般的貼壁細胞培養(yǎng)基配制而成；
[0015] 步驟4:分離培養(yǎng)平滑肌細胞
[0016]將步驟3消化完畢的主動脈使用37 °C預熱的D-Hanks溶液吹打洗脫，過70um篩網(wǎng)， 進行離心洗滌，然后進行重懸并再次離心，最后用無血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到大鼠主 動脈平滑肌細胞，使用含10 % -20 %胎牛血清、2 %雙抗的培養(yǎng)基在37 °C 5 % C02的培養(yǎng)箱中 進行培養(yǎng)。
[0017]為了進一步優(yōu)化上述技術方案，本發(fā)明所采取的技術措施還包括：
[0018] 上述步驟1中預灌流的速度為2-8mL/min，預灌流時間為5-8分鐘。
[0019] 上述步驟2中沖洗灌流的速度為5-10mL/min，沖洗灌流時間為3-5分鐘。
[0020] 上述步驟2和步驟3之間還包括剝離血管外膜的步驟；
[0021] 上述步驟3中復合酶消化時間為4_6h;在經(jīng)過復合酶的消化后，由于血管外膜和內(nèi) 膜均已剝離，故很多平滑肌細胞已經(jīng)分散分離開來。
[0022] 上述步驟4的培養(yǎng)基選自DMEM培養(yǎng)基、Williams'medium E培養(yǎng)基或DMEM/F12培養(yǎng) 基，優(yōu)選DMEM培養(yǎng)基。
[0023]上述雙抗為青霉素和鏈霉素。
[0024] 優(yōu)選地，還可以將獲得的大鼠主動脈平滑肌細胞進行傳代培養(yǎng)，將步驟3中制得主 動脈平滑肌細胞重懸液，加入到T25培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，接種密度為0.5*10 6/瓶。置于37度， 5%C02的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每3天更換新的培養(yǎng)基，每天于顯微鏡下觀察細胞生長情況， 至細胞融合度達70 %~80 %，進行傳代培養(yǎng)。每瓶細胞加0.25 %胰酶-EDTA lml，在37度培 養(yǎng)箱中孵育消化2分鐘。顯微鏡下觀察，當細胞變圓、間隙增大時，用含血清的培養(yǎng)基終止消 化，并將細胞吹打下來。400g離心5分鐘，獲得的細胞再加入含20 %胎牛血清、1 %青鏈霉素 的DMEM培養(yǎng)基，接種于T25培養(yǎng)瓶中，接種密度為0.5*106/瓶。置于37度，5 %C02的培養(yǎng)箱中 繼續(xù)擴增培養(yǎng)。第2天更換培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、1 %青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，每3天更 換新的培養(yǎng)基。
[0025] 另一方面，本發(fā)明還提供根據(jù)上述的分離培養(yǎng)方法所培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細 胞。
[0026] 本發(fā)明采用上述技術方案，與現(xiàn)有技術相比，具有如下技術效果：
[0027] 與現(xiàn)有的大鼠主動脈平滑肌分離培養(yǎng)方法(如組織塊消化法)相比，本發(fā)明的原代 大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法進行了重大的改進，建立了成熟的高活率、低污染 的原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法，同時使得獲得的細胞培養(yǎng)時間長、分化好、 細胞活力高。
[0028] 本發(fā)明在分離細胞的操作中開創(chuàng)性的引入了灌流的方法。預灌流的預灌流液中添 加了 0.6mM/L的EGTA、雙抗和兩性霉素。EGTA-方面可以起到抗凝的作用（防止血凝塊附 著），使灌流更充分，無灌流死角;另一方面，EGTA可以去除細胞間的Ca2+依賴性粘附因子，使 細胞間連接變松散，提高所得平滑肌細胞的分離度。添加2%的雙抗和兩性霉素，可以有效 地抑制組織或操作中存在的潛在的細菌和真菌污染。由于復合酶的包括多種膠原酶，而膠 原酶的在具有Ca 2+活化時可以達到最佳的消化效果，故本發(fā)明相應地引入了沖洗灌流的步 驟，沖洗灌流液中含有CaCl2，Ca 2+可以有效螯合預灌流液殘存于的EGTA，同時提供足夠的鈣 離子增加膠原酶的活性。
[0029] 本發(fā)明使用復合酶消化液，復合酶消化液由I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶 和Dispase酶組成，相比傳統(tǒng)單一的膠原酶，避免了對組織過度消化過度吹打所導致的細胞 活性低、得率差的問題，尤其是對于平滑肌這樣對缺血缺氧比較敏感的組織細胞。
[0030] 最后，本發(fā)明在培養(yǎng)細胞的過程中，采用原代、傳代第1天和復蘇第1天增加血清濃 度的方式，可以極大地提高細胞的貼壁率，進一步提高細胞活性和得率。
【附圖說明】
[0031] 圖1為普通顯微鏡視圖下拍攝的本發(fā)明方法分離得到的大鼠主動脈平滑肌細胞； [0032]圖2為使用熒光染色(DAPI)細胞的顯微照片；
[0033]圖3為使用熒光染色(a-SMA)細胞的顯微照片；
[0034]圖4為圖2和圖3合并的顯微照片。
【具體實施方式】
[0035]本發(fā)明提供了一種原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟： [0036] 步驟1:清洗和預灌流
[0037]將離體的大鼠主動脈使用含有2%雙抗的37°C預熱的D-Hanks溶液沖洗后，剝離血 管內(nèi)膜，灌注37 °C預熱的預灌流液，所述預灌流液配方為15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl， 3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HP〇4· 12H20,0.6mM/L的EGTA，2%雙抗和 1%兩性霉素；
[0038] 步驟2:沖洗灌流
[0039]將步驟1處理后的大鼠主動脈使用37°C預熱的沖洗灌流液灌流沖洗，所述沖洗灌 流液的配方為 15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HP〇4· 12H20,3mM/L CaCl2，2 %雙抗和1 %兩性霉素；
[0040] 步驟3:復合酶消化
[0041] 將步驟2處理后的大鼠主動脈置于37°C預熱的復合酶消化液中消化，其中復合酶 消化液中包括質(zhì)量分數(shù)比為1:1:1:1的I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶； [0042]步驟4:分離培養(yǎng)平滑肌細胞
[0043]將步驟3消化完畢的主動脈使用37°C預熱的D-Hanks溶液吹打洗脫，過70um篩網(wǎng)， 進行離心洗滌，然后進行重懸并再次離心，最后用無血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到大鼠主 動脈平滑肌細胞，使用含10 % -20 %胎牛血清、2 %雙抗的培養(yǎng)基在37 °C 5 % C02的培養(yǎng)箱中 進行培養(yǎng)。
[0044] 下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0045] 實施例1
[0046]本實施例以新生SD大鼠為細胞來源，首先頸椎脫白處死，酒精浸泡5分鐘，在解剖 顯微鏡下，打開胸腔，剪除肺組織，充分暴露胸腔的后壁。從心臟的升主動脈開始剝離主動 脈。用一只鑷子夾緊升主動脈，另一只鑷子沿胸腔后壁，逐步剝離胸主動脈，直至胸主動脈 的尾端，即入腹腔之前，剪斷主動脈。將離體的大鼠主動脈使用含有2%雙抗的37°C預熱的 D-Hanks溶液沖洗后，小心地剝離血管內(nèi)膜，使用小型注射器連接細的軟管（留置針軟管)灌 注37 °C預熱的預灌流液，灌注速度為5mL/miη，時間為5分鐘，預灌流液配方為15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HP〇4· 12Η2〇,0·6ι?Μ/1 的EGTA，2%雙抗和 1%兩性霉素;處理后的大鼠主動脈使用37°C預熱的沖洗灌流液灌流沖洗，灌注速度為8mL/ min，時間為5分鐘，所述沖洗灌流液的配方為15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KC1， 0.7mM/L Na2HP〇4· 12H20,3mM/L CaCl2,2%雙抗和1%兩性霉素。上述灌流結束后，小心地 剝離血管外膜，將剩余組織移至復合酶消化液中消化4h。消化完畢的主動脈使用37°C預熱 的D-Hanks溶液吹打洗脫，過70um篩網(wǎng)，進行離心洗滌，然后進行重懸并再次離心，最后用無 血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到大鼠主動脈平滑肌細胞，然后用0.2%臺盼蘭計數(shù)活細胞 數(shù)。制得主動脈平滑肌細胞重懸液，加入到T25培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，接種密度為0.5*10 6/瓶。 置于37度，5%C02的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每3天更換新的培養(yǎng)基，每天于顯微鏡下觀察細胞 生長情況，記錄并拍攝照片。如圖1所示，可見培養(yǎng)的細胞飽滿圓潤，活性較好，且分離度較 高。圖2-圖4的熒光顯微照片亦顯示了培養(yǎng)的細胞的良好形態(tài)和活性。
[0047]對比實施例
[0048] 對比實施例采用傳統(tǒng)的組織塊消化法，獲得主動脈組織后，沖洗組織，在無菌操作 下剪碎，并使用Π 膠原酶消化過夜，使用緩沖液吹打組織，分散細胞，過篩網(wǎng)，進行離心洗 滌，然后進行重懸并再次離心，最后用無血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到大鼠主動脈平滑肌 細胞，細胞計數(shù)后，加入到T25培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，接種密度為0.5*10 6/瓶，置于37度，5 % C02 的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)并觀察。
[0049] 上述的實施例和對比例實驗，
【申請人】進行了多次實驗，并進行了相關指標的比較 和數(shù)據(jù)統(tǒng)計。如表1所示：
[0050] 表 1
[0051]
[0052] 由此可以看出，本發(fā)明的原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法獲得細胞總 量大，分離度高，活率高，而且細菌、真菌和其他細胞的污染概率低，同時還能夠進行傳代培 養(yǎng)，為血管疾病相關研究提供了良好的細胞培養(yǎng)基礎。
[0053] 以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權項】
1. 一種原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1:清洗和預灌流 將離體的大鼠主動脈使用含有2 %雙抗的37 °C預熱的D-Hanks溶液沖洗后，剝離血管內(nèi) 膜，灌注37 °C預熱的預灌流液，所述預灌流液配方為15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0·7mM/LNa2HP04·12H20,0·6mM/L的EGTA，2%雙抗和l%兩性霉素 ； 步驟2:沖洗灌流 將步驟1處理后的大鼠主動脈使用37°C預熱的沖洗灌流液灌流沖洗，所述沖洗灌流液 的配方為 15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HP〇4· 12H20,3mM/L CaCl2，2 %雙抗和I %兩性霉素； 步驟3:復合酶消化 將步驟2處理后的大鼠主動脈置于37°C預熱的復合酶消化液中消化，其中復合酶消化 液中包括質(zhì)量比為1: 1: 1:1的I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶； 步驟4:分離培養(yǎng)平滑肌細胞 將步驟3消化完畢的主動脈使用37°C預熱的D-Hanks溶液吹打洗脫，過70um篩網(wǎng)，進行 離心洗滌，然后進行重懸并再次離心，最后用無血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到大鼠主動脈 平滑肌細胞，使用含10 % -20 %胎牛血清、2 %雙抗的培養(yǎng)基在37 °C 5 % CO2的培養(yǎng)箱中進行 培養(yǎng)。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟1中預灌流的速度為2_8mL/min，預灌流時間為5-8分鐘。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟2中沖洗灌流的速度為5-10mL/min，沖洗灌流時間為3-5分鐘。4. 根據(jù)權利要求1所述的一種原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟2和步驟3之間還包括剝離血管外膜的步驟。5. 根據(jù)權利要求1所述的一種原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟3中復合酶消化時間為4-6h。6. 根據(jù)權利要求1所述的一種原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟4的培養(yǎng)基選自DMEM培養(yǎng)基、Wi 11 iams 'medium E培養(yǎng)基或DMEM/F12培養(yǎng)基。7. 根據(jù)權利要求6所述的一種原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟4的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。8. 根據(jù)權利要求1所述的一種原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述雙抗為青霉素和鏈霉素。9. 一種根據(jù)權利要求1-8任意一項所述的原代大鼠主動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)方法 所培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細胞。
【文檔編號】C12N5/071GK105907698SQ201610218198
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月8日
【發(fā)明人】王曉冰, 楊國峰
【申請人】王曉冰, 楊國峰