一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，采用特制的復(fù)合酶進(jìn)行長(zhǎng)期消化，使得獲得細(xì)胞總量大，分離度高，活率高；由于采集方式的不同，杜絕了心臟內(nèi)殘留血液的污染和影響，使得本發(fā)明的方法獲得的心肌細(xì)胞細(xì)菌、真菌和其他細(xì)胞的污染概率極低，同時(shí)還能夠進(jìn)行傳代培養(yǎng)，為以心肌培養(yǎng)為基礎(chǔ)的相關(guān)研究提供了良好的細(xì)胞培養(yǎng)解決方案。
【專利說明】
一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培 養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 心肌細(xì)胞是機(jī)體最具有能量的細(xì)胞，屬于高含氧細(xì)胞，擁有大量的線粒體。心肌細(xì) 胞占心臟體積的75%，但數(shù)目?jī)H為心臟總細(xì)胞量的三分之一。雖然分化的心肌細(xì)胞很難增 殖，然而，通過Ras/MEK通路的a-Ι腎上腺素的刺激，心臟可出現(xiàn)過度肥厚。所有心肌細(xì)胞的 胞膜都可以自發(fā)性地產(chǎn)生有節(jié)律的去極化和復(fù)極化。心肌細(xì)胞的收縮屬于肌源性的，不依 賴神經(jīng)的刺激。心肌細(xì)胞中存在一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)系統(tǒng)，可以調(diào)節(jié)心臟有節(jié)律的舒縮。心 衰時(shí)心肌收縮功能的缺失，會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞的肥大和凋亡。更好地理解和研究心臟網(wǎng)絡(luò)信 號(hào)系統(tǒng)的功能，將有助于深入了解心肌細(xì)胞死亡的內(nèi)在機(jī)制，而心肌細(xì)胞的培養(yǎng)，是上述研 究的基礎(chǔ)。
[0003] 目前，國內(nèi)外已經(jīng)有大量的研究者進(jìn)行了小鼠/大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)和藥理學(xué)特 性方面的研究，既往的研究多采用胰酶消化法培養(yǎng)。其缺點(diǎn)在于：
[0004] 首先，胰酶對(duì)心肌組織細(xì)胞的傷害極大，很難控制消化時(shí)間和吹打的力度，容易導(dǎo) 致的結(jié)果往往是，細(xì)胞活力差，死細(xì)胞特別多，貼壁細(xì)胞很少，且很少有細(xì)胞能觀察到搏動(dòng)。 即使有部分細(xì)胞搏動(dòng)，占總細(xì)胞數(shù)的比例也很低，多數(shù)都是心肌成纖維細(xì)胞。且伴隨細(xì)胞的 傳代，心肌細(xì)胞的數(shù)目會(huì)越來越少，心肌成纖維的占比會(huì)越來越大，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0005] 其次，由于心臟采集過程的特殊性，即使是外部沖洗加上心臟自身節(jié)律性收縮排 出心臟內(nèi)大部分血液，但是仍不足以清楚血液污染，所以在去心肌細(xì)胞組織塊時(shí)，往往混入 少量血液，而此部分血液大大增加了后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)過程中各種細(xì)菌、細(xì)胞、真菌污染的可能 性。為了完全克服此部分血液污染的影響，本領(lǐng)域技術(shù)人員常用心臟灌流的方法，然而小 鼠/大鼠的心臟灌流操作難度負(fù)責(zé)、耗時(shí)長(zhǎng)，并不適合應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出的一種針對(duì)大鼠或小鼠的心肌細(xì)胞，不 但可以杜絕心臟內(nèi)剩余血液的污染，同時(shí)還可以得到高純度、高活率、高活性的原代小鼠或 大鼠心肌細(xì)胞的分尚培養(yǎng)方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為：
[0008] -種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0009] 步驟1:心臟的預(yù)處理
[0010] 清理離體的心臟，并利用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗；
[0011] 步驟2:取心肌細(xì)胞
[0012] 使用活檢針刺入步驟1處理后的心臟的左心室壁，切取心肌細(xì)胞；
[0013] 步驟3:酶消化
[0014] 將步驟2獲得的心肌細(xì)胞置于復(fù)合酶消化液中消化，其中復(fù)合酶消化液中包括質(zhì) 量比為1:1:1:1的I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶；
[0015] 步驟4:分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞
[0016]將步驟3消化完畢的心肌細(xì)胞過70um篩網(wǎng)，進(jìn)行離心洗滌，然后進(jìn)行重懸并再次離 心，最后用無血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到心肌細(xì)胞，使用含10%-20%胎牛血清、2%雙 抗的培養(yǎng)基在37 °C 5 % C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0017]為了優(yōu)化上述分離培養(yǎng)方法，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：
[0018] 優(yōu)選地，上述步驟1中清理離體的心臟的操作為使用眼科剪剝除心臟周圍的殘留 心包和結(jié)締組織。
[0019] 優(yōu)選地，上述步驟2中使用的活檢針為半自動(dòng)或全自動(dòng)活檢針。
[0020] 優(yōu)選地，上述步驟3中復(fù)合酶消化液中各個(gè)酶的初始濃度均為lmg/ml。
[0021] 優(yōu)選地，上述步驟3中酶消化過程為使用4°C復(fù)合酶消化液消化4_20h;或者使用37 °C預(yù)熱的復(fù)合酶消化液消化10min-2h。
[0022] 優(yōu)選地，上述步驟4的培養(yǎng)基選自DMEM培養(yǎng)基、Williams'medium E培養(yǎng)基或DMEM/ F12培養(yǎng)基;更優(yōu)選為DMEM培養(yǎng)基。
[0023]優(yōu)選地，上述雙抗為1 %青鏈霉素。
[0024] 另一方面，本發(fā)明還提供一種根據(jù)上述的原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方 法所培養(yǎng)的小鼠或大鼠心肌細(xì)胞。
[0025] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：
[0026] 首先，針對(duì)心肌細(xì)胞分離過程的特殊性，沖洗后直接采用活檢針在心室壁內(nèi)采集 心肌細(xì)胞，不但成功的避免了心臟內(nèi)殘存血液的污染，更使得獲得的心肌細(xì)胞純度大大提 升，基本無其他細(xì)胞的參雜。其次，本發(fā)明的原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，使 用的為
【申請(qǐng)人】特殊制備的復(fù)合酶消化液，復(fù)合酶消化液由I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠 原酶和Dispase酶組成，并使用4°C條件過夜消化(4-20h)，相比傳統(tǒng)單一的膠原酶預(yù)熱消 化，不但避免了對(duì)組織過度消化過度吹打所導(dǎo)致的細(xì)胞活性低、得率差的問題，而且消化的 更均勻透徹。綜上所述，本發(fā)明的的原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，能夠獲得高 純度、高活率、高活性同時(shí)污染風(fēng)險(xiǎn)極低的原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞分化好、 細(xì)胞活力高，具有較大的推廣意義。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法得到的小鼠心肌細(xì)胞顯微照片（10X);
【具體實(shí)施方式】
[0028] 本發(fā)明提供了一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟： [0029] 步驟1:心臟的預(yù)處理
[0030]清理離體的心臟，并利用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗；
[0031] 步驟2:取心肌細(xì)胞
[0032] 使用活檢針刺入步驟1處理后的心臟的左心室壁，切取心肌細(xì)胞；
[0033]步驟3:酶消化
[0034]將步驟2獲得的心肌細(xì)胞置于復(fù)合酶消化液中消化，其中復(fù)合酶消化液中包括質(zhì) 量比為1:1:1:1的I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶；
[0035]步驟4:分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞
[0036]將步驟3消化完畢的心肌細(xì)胞過70um篩網(wǎng)，進(jìn)行離心洗滌，然后進(jìn)行重懸并再次離 心，最后用無血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到心肌細(xì)胞，使用含10%-20%胎牛血清、2%雙 抗的培養(yǎng)基在37 °C 5 % C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0037] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 本實(shí)施例采用SD大鼠，使用本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法分離心肌細(xì)胞，具體步驟如下：
[0040] 1.大鼠心臟的獲取
[0041 ]首先處死新生大鼠（頸椎脫白），酒精浸泡5分鐘，在解剖顯微鏡下，打開胸腔，充分 暴露心臟。用鑷子夾緊心臟根部，靠近心房部位的血管，將完整的心臟剪取下來，盡量不要 夾到心室部分的組織，因?yàn)樾募〖?xì)胞對(duì)鉗夾非常敏感，易導(dǎo)致鉗夾部位的心肌細(xì)胞死亡。清 理心包和其他附帶的結(jié)締組織，并利用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗。
[0042] 2.取心肌細(xì)胞
[0043]在解剖顯微鏡下，使用小型的活檢針刺入處理后的心臟的左心室壁內(nèi)，然后切取 內(nèi)部心肌細(xì)胞。此步驟的操作還可以是，第一次刺入后，移除切取得到的心肌細(xì)胞，然后再 沿著原來的路徑切取內(nèi)部的心肌細(xì)胞，此舉可以將心臟外的包膜細(xì)胞也排除。
[0044] 3.酶消化
[0045] 多次執(zhí)行上述切取步驟，獲得足夠的心肌細(xì)胞后，將獲得心肌細(xì)胞加入復(fù)合酶消 化液中消化，其中復(fù)合酶消化液中包括質(zhì)量比為1:1:1:1的I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠 原酶和Dispase酶，4種酶的初始濃度均為lmg/ml。在4度冰箱過夜，便于酶與組織充分結(jié)合， 使組織松散，細(xì)胞容易剝離。這樣可以避免消化過程中，對(duì)組織的吹打過于頻繁和過于粗 暴，對(duì)細(xì)胞造成極大的傷害。第2天，將組織從冰箱中取出，稍微吹打幾次，放入37度水浴15 分鐘，再次輕微吹打不超過5次，過70um篩網(wǎng)。
[0046] 4.離心純化
[0047]取過篩后的細(xì)胞濾液，根據(jù)體積加入對(duì)等的PBS，400g離心5分鐘，即可獲得純化的 小鼠或大鼠心肌細(xì)胞，然后用0.2 %臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。
[0048] 5.培養(yǎng)基配制
[0049] 由于心肌細(xì)胞的特殊性，在原代培養(yǎng)、傳代和復(fù)蘇的第一天，用含20%胎牛血清、 1 %青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。其它時(shí)間，用含10%胎牛血清、1 %青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。
[0050] 6.二維培養(yǎng)
[0051] 將純化的小鼠或大鼠心肌細(xì)胞用上述培養(yǎng)基重懸，制得心肌細(xì)胞重懸液，加入到 T25培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，接種密度為0.5*106/瓶。置于37度，5 % C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。為 了充分去除可能存在的心肌成纖維細(xì)胞，根據(jù)差速貼壁的原理，分別在細(xì)胞接種后的1小時(shí) 和2小時(shí)，將細(xì)胞懸液更換至新的培養(yǎng)瓶，這樣便可在第3個(gè)培養(yǎng)瓶中獲得純化的心肌細(xì)胞。 第2天更換培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、1 %青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。每3天更換新的培養(yǎng)基， 每天于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，至細(xì)胞融合度達(dá)70 %~80 %，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0052] 7.傳代培養(yǎng)
[0053] 當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70 %~80 %時(shí)，每瓶細(xì)胞加0.25 %胰酶-EDTA 1ml，在37度培養(yǎng)箱 中孵育消化2分鐘。顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、間隙增大時(shí)，用含血清的培養(yǎng)基終止消化， 并將細(xì)胞吹打下來。400g離心5分鐘，獲得的細(xì)胞再加入含20%胎牛血清、1 %青鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基，接種于T25培養(yǎng)瓶中，接種密度為0.5*106/瓶。置于37度，5%C02的培養(yǎng)箱中繼 續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。第2天更換培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。每3天更換 新的培養(yǎng)基，每天于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
[0054] 8.細(xì)胞形態(tài)觀察
[0055]使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，如圖1所示，心肌細(xì)胞分離度較好、活力較高、生長(zhǎng)良 好。
[0056] 9.其他相關(guān)指標(biāo)測(cè)定
[0057]培養(yǎng)期間測(cè)定細(xì)菌及真菌污染情況、細(xì)胞污染情況、統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活率等。
[0058] 對(duì)比實(shí)施例
[0059] 對(duì)比實(shí)施例采用傳統(tǒng)的組織塊消化法，分離獲得心臟后，剝離去除其他連帶組織， 使用含有雙抗的PBS沖洗，待心臟將殘存的血液栗出大部分后，再次清洗。然后在無菌操作 下將心臟剪碎，并使用II膠原酶37°C消化2h，使用緩沖液吹打組織，分散細(xì)胞，過篩網(wǎng)，進(jìn)行 離心洗滌，然后進(jìn)行重懸并再次離心，最后用無血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到小鼠心肌細(xì) 胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加入到T25培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，接種密度為0.5*10 6/瓶，置于37度，5 % C02的 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)并觀察和測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。
[0060] 上述的實(shí)施例和對(duì)比例實(shí)驗(yàn)，
【申請(qǐng)人】進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行了相關(guān)指標(biāo)的比較 和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。如表1所示：
[0061] 表 1
[0062]
[0UOJJ N叮甲堉人便用小畝進(jìn)仃J右卞伏頭脫，頭脫結(jié)米N入畝TON，1 止明小及明的方 法對(duì)大鼠和小鼠的心肌分離培養(yǎng)的良好效果真實(shí)有效。
[0064]綜上所述，本發(fā)明的原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，采用特制的復(fù)合 酶進(jìn)行長(zhǎng)期消化，使得獲得細(xì)胞總量大，分離度高，活率高；由于采集方式的不同，杜絕了心 臟內(nèi)殘留血液的污染和影響，使得本發(fā)明的方法獲得的心肌細(xì)胞細(xì)菌、真菌和其他細(xì)胞的 污染概率極低，同時(shí)還能夠進(jìn)行傳代培養(yǎng)，為以心肌培養(yǎng)為基礎(chǔ)的相關(guān)研究提供了良好的 細(xì)胞培養(yǎng)解決方案。
[0065]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1:心臟的預(yù)處理 清理離體的心臟，并利用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗； 步驟2:取心肌細(xì)胞 使用活檢針刺入步驟1處理后的心臟的左心室壁，切取心肌細(xì)胞； 步驟3:酶消化 將步驟2獲得的心肌細(xì)胞置于復(fù)合酶消化液中消化，其中復(fù)合酶消化液中包括質(zhì)量比 為1: 1: 1:1的I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶； 步驟4:分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞 將步驟3消化完畢的心肌細(xì)胞過70um篩網(wǎng)，進(jìn)行離心洗滌，然后進(jìn)行重懸并再次離心， 最后用無血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到心肌細(xì)胞，使用含10%-20%胎牛血清、2%雙抗的 培養(yǎng)基在37 °C 5 % CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟1中清理離體的心臟的操作為使用眼科剪剝除心臟周圍的殘留心包和結(jié)締組織。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟2中使用的活檢針為半自動(dòng)或全自動(dòng)活檢針。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟3中復(fù)合酶消化液中各個(gè)酶的初始濃度均為lmg/ml。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟3中酶消化過程為使用4 °C復(fù)合酶消化液消化4-20h。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟3中酶消化過程為使用37°C預(yù)熱的復(fù)合酶消化液消化10min-2h。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟4的培養(yǎng)基選自DMEM培養(yǎng)基、Wi 11 iams 'medium E培養(yǎng)基或DMEM/F12培養(yǎng)基。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟4的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述雙抗為1 %青鏈霉素。10. -種根據(jù)權(quán)利要求1-9任意一項(xiàng)所述的原代小鼠或大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法 所培養(yǎng)的小鼠或大鼠心肌細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/077GK105907708SQ201610218220
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年4月8日
【發(fā)明人】王曉冰, 楊國峰
【申請(qǐng)人】王曉冰, 楊國峰