一種改良的nk細胞培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改良的NK細胞培養(yǎng)方法，本發(fā)明的培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)的NK細胞的數(shù)量足，擴增快，一般外周血培養(yǎng)15天，能夠達到70億個細胞；本發(fā)明通過培養(yǎng)基中添加乙酰化α葡聚糖作為激活調(diào)動劑，成功激活了NK細胞，促使其分泌IL2、IL12和IFN?γ，而IL2、IL12和IFN?γ在NK細胞活化后維持其活性和擴增速率起到關(guān)鍵的作用，使其更具有臨床應用價值；此外，本發(fā)明方法獲得NK細胞的純度高，對流式細胞儀的檢測結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)CD3?CD56+的NK細胞數(shù)達到80％以上，滿足臨床應用的要求。
【專利說明】
一種改良的NK細胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種改良的NK細胞培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)是機體重要的免疫細胞，主要分布于外 周血中，占 PBMC的5%-10%，淋巴結(jié)和骨髓中也有NK活性，但水平較外周血低。NK細胞是一 群異質(zhì)性、多功能的免疫細胞，是人類的眾多免疫細胞中的一種，表現(xiàn)為自然細胞毒活性的 殺傷細胞。主要作用消滅攻擊人類身體的病毒、細菌、癌細胞等。發(fā)揮作用的方式分為:直接 殺傷、釋放穿孔素、NK細胞毒因子和TNF等。每個人的身體里至少有50億個NK細胞，多則達到 1000億個。但NK細胞的數(shù)量和其活動力不是成正比的。即使NK細胞顯示有足夠的數(shù)量，但是 不激活他們，他們的工作效率也是非常低的。
[0003] 目前，國內(nèi)外已經(jīng)有大量的研究者進行了人NK細胞的培養(yǎng)和生物治療方面的研 究，但多數(shù)研究都是單純利用IL-2和IL-12等白介素類細胞因子去培養(yǎng)，但是這樣獲得的結(jié) 果往往有兩個弊端，要么是數(shù)量上不去，達不到治療性回輸所需的量，要么是純度上不去， 達不到應有的效果。因為白介素類細胞因子都不是強烈的NK細胞活化劑，缺乏強有力的活 化作用。但是，當NK細胞被充分活化后，白介素類細胞因子對NK細胞的活性維持和增殖發(fā)揮 了極為重要的作用。因此，獲得高數(shù)量高純度的NK細胞，首先需要充分活化NK細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提供一種區(qū)別于傳統(tǒng)培養(yǎng)法的人NK細胞的 培養(yǎng)方法，使之簡單易行。本發(fā)明中培養(yǎng)獲得的人NK細胞被活化，NK細胞分泌的IL2、IL12和 IFN- γ的表達水平更高，細胞純度高，生長良好，細胞增殖更快，且細胞得率和存活率均大 大提尚。
[0005] 為了實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為：
[0006] -種改良的ΝΚ細胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0007] 步驟1:用PBS稀釋單克隆抗體CD16和CD2獲得抗體稀釋液，然后用抗體稀釋液過夜 包被細胞培養(yǎng)容器；
[0008] 步驟2:分離單個核細胞；
[0009] 步驟3:將步驟2獲得的單個核細胞接種到培養(yǎng)容器中，從接種時間開始計時，每隔 3天更換新鮮的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)18天后收集細胞;所述的細胞培養(yǎng)基中含有乙?；疗暇?糖。
[0010]為了優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：
[0011]優(yōu)選地，上述的乙?；疗暇厶菨舛葹?0mg/ml。
[0012] 優(yōu)選地，上述的細胞培養(yǎng)基，還含有10%knockout血清替代品和500U/ml的IL-2。 [0013] 優(yōu)選地，上述的10 % knockout血清替代品還可以替換成人血小板裂解物。
[0014] 優(yōu)選地，上述的細胞培養(yǎng)基為CellGro SCGM或RPMI-1640培養(yǎng)基。
[0015] 優(yōu)選地，上述的培養(yǎng)容器為細胞培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)板，更優(yōu)選為T75細胞培養(yǎng)瓶。
[0016] 優(yōu)選地，上述步驟2的接種細胞密度為2X 106/ml。
[0017] 另一方面，本發(fā)明還提供根據(jù)上述的細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的NK細胞及其在制備 抗腫瘤藥物中的應用。
[0018] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：
[0019] (1)傳統(tǒng)的方法NK細胞擴增慢，數(shù)量很難滿足臨床需求，而利用本發(fā)明的培養(yǎng)方法 分離培養(yǎng)的NK細胞的數(shù)量足，擴增快，一般外周血培養(yǎng)15天，能夠達到70億個細胞；
[0020] (2)傳統(tǒng)的方法NK細胞活性低，NK細胞的數(shù)量和其活性不成正比，而本發(fā)明通過培 養(yǎng)基中添加乙?；疗暇厶亲鳛榧せ钫{(diào)動劑，成功激活了 NK細胞，促使其分泌IL2、IL12和 IFN-γ，而IL2、IL12和IFN-γ在ΝΚ細胞活化后維持其活性和擴增速率起到關(guān)鍵的作用，使 其更具有臨床應用價值；
[0021 ] (3)與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明方法獲得NK細胞的純度高，對流式細胞儀檢測結(jié)果進 行分析，發(fā)現(xiàn)⑶3TD56+的NK細胞數(shù)達到80 %以上。
【附圖說明】
[0022]圖1為實施例一中分離培養(yǎng)的NK傳代細胞的顯微鏡圖（10X);
[0023]圖2為實施例一中分離培養(yǎng)的NK傳代細胞的顯微鏡圖（20X);
[0024]圖3為實施例一中分離培養(yǎng)的NK傳代細胞的顯微鏡圖（40X)。
【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。
[0026] 實施例1
[0027] 1.本方法與常規(guī)方法的細胞擴增倍數(shù)的比較
[0028] 本實施例中實驗組分離培養(yǎng)NK細胞的細胞培養(yǎng)方法，具體步驟如下：
[0029] 步驟1.取肝素抗凝的靜脈血60ml，分2支取單個核細胞(PBMC)。具體步驟如下：向 50ml離心管中加入15ml淋巴細胞分離液，再貼著管壁，緩慢加入30ml靜脈血，避免破壞淋巴 細胞分離液的水相。400g，離心20分鐘。將上層血漿小心吸出至新的50ml離心管中，56°C加 熱25分鐘，充分滅活補體，待用。將中間層的白膜層，即單個核細胞層吸出至新的15ml離心 管中，用0.01M的PBS充分洗滌3次，洗滌時，200g離心5分鐘，棄上清，所得即為PBMC。
[0030] 步驟2 ·將離心所得的PBMC用上述培養(yǎng)基重懸，即：用含10 ^knockout血清替代品 和乙?；疗暇厶堑?640培養(yǎng)基重懸，細胞密度調(diào)整為2 X106/ml，將細胞重懸液轉(zhuǎn)移到T75 培養(yǎng)瓶中，每3天更換新的培養(yǎng)基，并利用顯微鏡觀察細胞形態(tài)(如附圖1-3)。
[0031] 本實施例實驗對象分為實驗組和常規(guī)組兩組。其中，常規(guī)組按傳統(tǒng)的技術(shù)培養(yǎng)。分 別在第0、6、12及18天從兩組取培養(yǎng)細胞，用臺盼藍染色后計數(shù)，將計數(shù)當天的細胞總數(shù)除 以培養(yǎng)前的細胞數(shù)(即第〇天），數(shù)值即為細胞的擴增倍數(shù)。以此方法可以動態(tài)比較兩組細胞 的擴增情況，結(jié)果如表1所示:在培養(yǎng)的第6、12、18天，本法的細胞擴增倍數(shù)均顯著高于常規(guī) 組，Ρ〈0·05 〇
[0032]
[0033] 表1本方法與常規(guī)方法的細胞擴增倍數(shù)的比較
[0034]由表1可以分析得出，傳統(tǒng)的方法培養(yǎng)NK細胞，成本高，工藝復雜，效果不理想，并 且細胞擴增慢，數(shù)量很難滿足臨床需求，而利用本發(fā)明的培養(yǎng)方法工藝相對簡單，分離培養(yǎng) 的NK細胞的數(shù)量足，擴增快，能夠滿足臨床需求。
[0035] 實施例2
[0036] 1.本方法與常規(guī)方法的細胞純度的比較
[0037] 本實施例實驗對象分為實驗組和常規(guī)組兩組。其中，實驗組按實施例1中的細胞培 養(yǎng)方法培養(yǎng)NK細胞。常規(guī)組按傳統(tǒng)的技術(shù)培養(yǎng)。在第18天分別從兩組培養(yǎng)體系取細胞培養(yǎng) 液，PBS洗滌兩次，洗滌后調(diào)整細胞濃度為2X10 5/ml，加入流式抗體，4C避光30min，洗掉多余 抗體，PBS重懸后，對細胞表型進行流式檢測。所用抗體來自美國BD公司，結(jié)果如表2所示，常 規(guī)組的〇03飛056 +的疆細胞占50.16±1.02%，本方法的003飛056 +的疆細胞占82.86± 1.83%，兩組有顯著性差異(P<0.05)。
[0038]
[0039] 表2本方法與常規(guī)方法的細胞純度的比較
[0040]由表2可以分析得出，傳統(tǒng)方法獲得的NK細胞的純度低，很大程度上限制了NK細胞 的應用，而本發(fā)明方法獲得NK細胞的純度高，通過流式細胞儀的檢測，CD3-CD56+的NK細胞數(shù) 達到80%以上，純度達到了臨床應用的要求，對其臨床上的應用有著重要的指導意義。
[0041 ] 實施例3
[0042] 1.本方法與常規(guī)方法的細胞分泌的IL2、IL12、IFN- γ的分泌水平比較
[0043] 本實施例實驗對象分為實驗組和常規(guī)組兩組。其中，實驗組按實施例1中的細胞培 養(yǎng)方法培養(yǎng)ΝΚ細胞。常規(guī)組按傳統(tǒng)的技術(shù)培養(yǎng)。在第18天分別從兩組培養(yǎng)體系取100毫升細 胞培養(yǎng)液，用常規(guī)方法濃縮之后，用試劑盒檢測其中的IL2、IL12、IFN- γ含量，所有試劑盒 購買自武漢博士德生物工程有限公司。實驗結(jié)果如表3所示，實驗組細胞分泌的IL2、IL12、 IFN- γ含量顯著高于常規(guī)組含量(單位μg/ml)。
[0044]
[0045] 表3本方法與常規(guī)方法的細胞分泌的IL2、IL12、IFN- γ的分泌水平比較
[0046] 由表3可以分析得出，與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明通過培養(yǎng)基中添加乙?；疗暇厶?作為激活調(diào)動劑，成功激活了ΝΚ細胞，促使其分泌IL2、IL12和IFN- γ，而IL2、IL12和IFN- γ 在NK細胞活化后維持其活性和擴增速率起到關(guān)鍵的作用，使其更具有臨床應用價值。
[0047]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種改良的NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1:用I3BS稀釋單克隆抗體CD16和CD2獲得抗體稀釋液，然后用抗體稀釋液過夜包被 細胞培養(yǎng)容器； 步驟2:分離單個核細胞； 步驟3:將步驟2獲得的單個核細胞接種到培養(yǎng)容器中，從接種時間開始計時，每隔3天 更換新鮮的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)18天后收集細胞;所述的細胞培養(yǎng)基中含有乙?；疗暇厶恰?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良的NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的乙酰化α葡 聚糖濃度為l〇mg/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良的NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的細胞培養(yǎng) 基，還含有10 % knockout血清替代品和500U/ml的IL-2。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良的NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的細胞培養(yǎng)基 為〇6116仰5061或1^]\〇-1640培養(yǎng)基。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良的NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)容器為 細胞培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)板。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良的NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)容器為 T75細胞培養(yǎng)瓶。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良的NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟3的接種 細胞密度為2 X IO6Ail。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項所述方法培養(yǎng)得到的NK細胞。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的NK細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】A61K35/17GK105907714SQ201610277828
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】王曉冰
【申請人】王曉冰