一種酰氯化修飾磁性二氧化硅微球固定化漆酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種酰氯化修飾磁性二氧化硅微球固定化漆酶的制備方法，屬于漆酶制備技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用二氧化硅大孔材料制得的磁性二氧化硅微球載體，由于磁性二氧化硅微粒表面富有羧基基團(tuán)，可以與三氯化磷反應(yīng)，將羧基基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)轷Ｂ然鶊F(tuán)，反應(yīng)后磁鐵分離、清洗、干燥，得到酰氯化修飾后磁性二氧化硅微球，將其加入緩沖液配制的漆酶溶液中，振蕩過(guò)濾，緩沖液沖洗濾渣后即可得到酰氯化修飾磁性二氧化硅微球固定化漆酶。實(shí)例證明，本發(fā)明制得的固定化載體材料在保持漆酶催化活性、穩(wěn)定性的同時(shí)易于分離，且價(jià)格低廉、制備方便，最終制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶活力高達(dá)280U/mL，總產(chǎn)量提升至89％以上，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
【專利說(shuō)明】
一種酰氯化修飾磁性二氧化硅微球固定化漆酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明公開(kāi)了一種酰氯化修飾磁性二氧化硅微球固定化漆酶的制備方法，屬于漆酶制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶是一種含銅多酚氧化酶，不僅存在于高等植物中，而且一些多孔菌和腐生菌以及昆蟲(chóng)和細(xì)菌等也能產(chǎn)漆酶，且大多數(shù)由真菌分泌，在大多數(shù)真菌中，白腐菌是目前公認(rèn)的最強(qiáng)、最主要的木質(zhì)素降解者，能使木質(zhì)素最終礦化為C02和H20。漆酶能催化氧化多種有機(jī)物，包括苯酚、甲氧基酚、氨基酚等難以降解的芳香族化合物，同時(shí)分子氧被還原成水，最近研究表明，漆酶在造紙工業(yè)中有著重要的作用，可以降解木漿中的木質(zhì)素，并能夠脫除造紙工業(yè)污水中的大量污染物，由于漆酶在催化木質(zhì)素、木質(zhì)素前體物質(zhì)分子及其結(jié)構(gòu)相似物等許多環(huán)境污染物的降解中具有特殊的作用，近年來(lái)，有關(guān)漆酶的研究受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注，顯示出較大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。
[0003]但由于漆酶易溶于水，在水中游離的漆酶不可回收也不能長(zhǎng)期保存，且在高溫或其他極端環(huán)境下漆酶的穩(wěn)定性不易保持，因而限制了漆酶的實(shí)際應(yīng)用。固定化技術(shù)在保持游離漆酶的專一、高效的催化活性的同時(shí)，更是提高漆酶重復(fù)利用性、操控性和穩(wěn)定性的有效手段，常用的固定化載體包括活性炭、殼聚糖、多孔硅膠以及微濾膜等多種材料，但現(xiàn)有的固定化材料存在固定化效率低、加工工藝復(fù)雜、分離困難以及操作性不高等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題:針對(duì)目前游離的漆酶不能長(zhǎng)期保存，高溫下穩(wěn)定性差，因此限制了其實(shí)際應(yīng)用，而常用的固定化技術(shù)雖能保持漆酶的催化活性，提高利用性和穩(wěn)定性，但使用的固定化載體材料固定化效率低，分離困難以及工藝復(fù)雜的現(xiàn)狀，提供了一種利用二氧化硅大孔材料制得的磁性二氧化硅微球載體，由于磁性二氧化硅微粒表面富有羧基基團(tuán)，可以與三氯化磷反應(yīng)后，將羧基基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)轷Ｂ然鶊F(tuán)，反應(yīng)后用磁鐵分離，清洗分離物并冷凍干燥，得到酰氯化修飾磁性二氧化硅微球，并加入用緩沖液配制的漆酶溶液，振蕩過(guò)濾，并用緩沖液沖洗濾渣，即可得到酰氯化修飾磁性二氧化硅微球固定化漆酶。本發(fā)明制得的固定化載體材料在保持漆酶催化活性、穩(wěn)定性的同時(shí)易于分離，且價(jià)格低廉、制備方便，最終制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶活力高達(dá)280U/mL，總產(chǎn)量也提升至89 %以上，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
[0005]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(I)稱取30?50g塊狀二氧化硅大孔材料，將其放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%鹽酸中浸泡I?2h，浸泡后過(guò)濾取出，將酸處理后的塊狀二氧化硅大孔材料放入聚四氟乙烯內(nèi)襯反應(yīng)釜中，按固液比I: 5加入混合有機(jī)溶劑，設(shè)置溫度為80?120 0C，保溫?cái)嚢璺磻?yīng)10?12h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過(guò)濾得二氧化硅大孔材料分別用丙酮和去離子水清洗3?5次;所述的混合有機(jī)溶劑是由γ-(2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷和正己烷按體積比1:2混合； (2)將上述清洗后的二氧化硅大孔材料按固液比1:3與去離子水混合，并加入0.5?
0.8g納米四氧化三鐵磁性顆粒、15?20mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%十二烷基苯磺酸鈉溶液，混合后超聲分散20?30min，超聲后向分散液中加入50?70mL玉米油和玉米油質(zhì)量2?5%失水山梨醇脂肪酸酯，混合后在12000?150001'/111；[11轉(zhuǎn)速下乳化5?10111；[11;
(3)上述乳化結(jié)束后向乳化混合液中加入30?40mL戊二醛，在200?400r/min轉(zhuǎn)速下攪拌固定反應(yīng)5?6h，固定反應(yīng)后在8000?8500r/min轉(zhuǎn)速下離心分離得沉淀物，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%失水山梨醇脂肪酸酯溶液清洗2?3次，將清洗后沉淀物放入烘箱中在50?60°C下干燥6?8h，得磁性二氧化硅微球載體；
(4)將上述磁性二氧化硅微球載體按固液比1:2加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%三氯化磷溶液中，在室溫下攪拌反應(yīng)15?20min，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵進(jìn)行分離，將分離物用去離子水清洗4?6次，清洗后再用磁鐵分離并冷凍干燥，即可得到酰氯化修飾后磁性二氧化硅微球；
(5)將上述酰氯化修飾后磁性二氧化硅微球按固液比1:3加入用緩沖液配置的漆酶溶液中，在15?35°C下振蕩反應(yīng)6?Sh，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾，將濾渣用pH4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液沖洗3?5次，即可得到酰氯化修飾磁性二氧化硅微球固定化漆酶;所述的緩沖液配置的漆酶溶液是有pH為4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和濃度為lmg/mL的漆酶液按體積比1:2混合。
[0006]本發(fā)明的應(yīng)用方法是:按固液比1:1000?3000，將本發(fā)明制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶倒入廢水中，充分混合均勻，曝氣處理2?3h，之后檢測(cè)水源，可測(cè)得廢水中的COD從原來(lái)的3000?5000mg/L降低到了400?550mg/L，去除率高達(dá)90%以上，效果極其顯著。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，方法獨(dú)特，在保持漆酶催化活性、穩(wěn)定性的條件下使得工藝簡(jiǎn)便，固定化載體材料易于分離；
(2)本發(fā)明使得制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶活力高達(dá)280U/mL，總產(chǎn)量也提升至89%以上；
(3)本發(fā)明制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶應(yīng)用廣泛，可用于紡織印染、造紙、能源再生、飼料、廢水處理等方面。
【具體實(shí)施方式】
[0008]首先稱取30?50g塊狀二氧化硅大孔材料，將其放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%鹽酸中浸泡I?2h，浸泡后過(guò)濾取出，將酸處理后的塊狀二氧化硅大孔材料放入聚四氟乙烯內(nèi)襯反應(yīng)釜中，按固液比1: 5加入混合有機(jī)溶劑，設(shè)置溫度為80?120 °C，保溫?cái)嚢璺磻?yīng)10?12h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過(guò)濾得二氧化硅大孔材料分別用丙酮和去離子水清洗3?5次;所述的混合有機(jī)溶劑是由γ-(2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷和正己烷按體積比1:2混合;然后將上述清洗后的二氧化硅大孔材料按固液比1:3與去離子水混合，并加入0.5?0.8g納米四氧化三鐵磁性顆粒、15?20mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%十二烷基苯磺酸鈉溶液，混合后超聲分散20?30min，超聲后向分散液中加入50?70mL玉米油和玉米油質(zhì)量2?5%失水山梨醇脂肪酸酯，混合后在12000?15000r/min轉(zhuǎn)速下乳化5?1min;隨后上述乳化結(jié)束后向乳化混合液中加入30?40mL戊二醛，在200?400r/min轉(zhuǎn)速下攪拌固定反應(yīng)5?6h，固定反應(yīng)后在8000?8500r/min轉(zhuǎn)速下離心分離得沉淀物，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%失水山梨醇脂肪酸酯溶液清洗2?3次，將清洗后沉淀物放入烘箱中在50?60 0C下干燥6?Sh，得磁性二氧化硅微球載體;接下來(lái)將上述磁性二氧化硅微球載體按固液比1:2加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%三氯化磷溶液中，在室溫下攪拌反應(yīng)15?20min，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵進(jìn)行分離，將分離物用去離子水清洗4?6次，清洗后再用磁鐵分離并冷凍干燥，即可得到酰氯化修飾后磁性二氧化硅微球;最后將上述酰氯化修飾后磁性二氧化硅微球按固液比I: 3加入用緩沖液配置的漆酶溶液中，在15?35°C下振蕩反應(yīng)6?Sh，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾，將濾渣用pH4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液沖洗3?5次，即可得到酰氯化修飾磁性二氧化硅微球固定化漆酶;所述的緩沖液配置的漆酶溶液是有PH為4.5磷酸氫二鈉-梓檬酸緩沖液和濃度為lmg/mL的漆酶液按體積比1:2混合。
[0009]實(shí)例I
首先稱取30g塊狀二氧化硅大孔材料，將其放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%鹽酸中浸泡Ih，浸泡后過(guò)濾取出，將酸處理后的塊狀二氧化硅大孔材料放入聚四氟乙烯內(nèi)襯反應(yīng)釜中，按固液比1:5加入混合有機(jī)溶劑，設(shè)置溫度為80 °C，保溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過(guò)濾得二氧化硅大孔材料分別用丙酮和去離子水清洗3次;所述的混合有機(jī)溶劑是由γ-(2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷和正己烷按體積比I: 2混合;然后將上述清洗后的二氧化硅大孔材料按固液比1:3與去離子水混合，并加入0.5g納米四氧化三鐵磁性顆粒、15mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%十二烷基苯磺酸鈉溶液，混合后超聲分散20min，超聲后向分散液中加入50mL玉米油和玉米油質(zhì)量2%失水山梨醇脂肪酸酯，混合后在12000r/min轉(zhuǎn)速下乳化5min;隨后上述乳化結(jié)束后向乳化混合液中加入301111^戊二醛，在2001'/1]1；[11轉(zhuǎn)速下攪拌固定反應(yīng)511，固定反應(yīng)后在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離得沉淀物，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%失水山梨醇脂肪酸酯溶液清洗2次，將清洗后沉淀物放入烘箱中在50 °C下干燥6h，得磁性二氧化硅微球載體;接下來(lái)將上述磁性二氧化硅微球載體按固液比1: 2加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%三氯化磷溶液中，在室溫下攪拌反應(yīng)15min，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵進(jìn)行分離，將分離物用去離子水清洗4次，清洗后再用磁鐵分離并冷凍干燥，即可得到酰氯化修飾后磁性二氧化硅微球;最后將上述酰氯化修飾后磁性二氧化硅微球按固液比1:3加入用緩沖液配置的漆酶溶液中，在15°C下振蕩反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾，將濾渣用PH4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液沖洗3次，即可得到酰氯化修飾磁性二氧化硅微球固定化漆酶;所述的緩沖液配置的漆酶溶液是有pH為4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和濃度為lmg/mL的漆酶液按體積比1:2混合。
[0010]本實(shí)例操作簡(jiǎn)單易行，使用時(shí)，按固液比1:1000，將本發(fā)明制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶倒入廢水中，充分混合均勻，曝氣處理2h，之后檢測(cè)水源，可測(cè)得廢水中的COD從原來(lái)的3000mg/L降低到了300mg/L，去除率高達(dá)90%，效果極其顯著。
[0011]實(shí)例2
首先稱取40g塊狀二氧化硅大孔材料，將其放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%鹽酸中浸泡1.5h，浸泡后過(guò)濾取出，將酸處理后的塊狀二氧化硅大孔材料放入聚四氟乙烯內(nèi)襯反應(yīng)釜中，按固液比1:5加入混合有機(jī)溶劑，設(shè)置溫度為100°C，保溫?cái)嚢璺磻?yīng)llh，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過(guò)濾得二氧化硅大孔材料分別用丙酮和去離子水清洗4次;所述的混合有機(jī)溶劑是由γ-(2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷和正己烷按體積比1:2混合;然后將上述清洗后的二氧化硅大孔材料按固液比1:3與去離子水混合，并加入0.65g納米四氧化三鐵磁性顆粒、ISmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%十二燒基苯磺酸鈉溶液，混合后超聲分散25min，超聲后向分散液中加入60mL玉米油和玉米油質(zhì)量4%失水山梨醇脂肪酸酯，混合后在13500r/min轉(zhuǎn)速下乳化8min;隨后上述乳化結(jié)束后向乳化混合液中加入35mL戊二醛，在300r/min轉(zhuǎn)速下攪拌固定反應(yīng)5.5h，固定反應(yīng)后在8300r/min轉(zhuǎn)速下離心分離得沉淀物，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%失水山梨醇脂肪酸酯溶液清洗2次，將清洗后沉淀物放入烘箱中在55 0C下干燥7h，得磁性二氧化硅微球載體;接下來(lái)將上述磁性二氧化硅微球載體按固液比1:2加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%三氯化磷溶液中，在室溫下攪拌反應(yīng)18min，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵進(jìn)行分離，將分離物用去離子水清洗5次，清洗后再用磁鐵分離并冷凍干燥，即可得到酰氯化修飾后磁性二氧化硅微球;最后將上述酰氯化修飾后磁性二氧化硅微球按固液比1:3加入用緩沖液配置的漆酶溶液中，在25°C下振蕩反應(yīng)7h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾，將濾渣用PH4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液沖洗4次，即可得到酰氯化修飾磁性二氧化硅微球固定化漆酶;所述的緩沖液配置的漆酶溶液是有pH為4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和濃度為lmg/mL的漆酶液按體積比1:2混合。
[0012]使用時(shí)，按固液比1:2000，將本發(fā)明制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶倒入廢水中，充分混合均勻，曝氣處理2.5h，之后檢測(cè)水源，可測(cè)得廢水中的COD從原來(lái)的4000mg/L降低到了 350mg/L，去除率高達(dá)91.2%,效果極其顯著。
[0013]實(shí)例3
首先稱取50g塊狀二氧化硅大孔材料，將其放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%鹽酸中浸泡2h，浸泡后過(guò)濾取出，將酸處理后的塊狀二氧化硅大孔材料放入聚四氟乙烯內(nèi)襯反應(yīng)釜中，按固液比1:5加入混合有機(jī)溶劑，設(shè)置溫度為120°C，保溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過(guò)濾得二氧化硅大孔材料分別用丙酮和去離子水清洗5次;所述的混合有機(jī)溶劑是由γ-(2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷和正己烷按體積比1: 2混合;然后將上述清洗后的二氧化硅大孔材料按固液比1:3與去離子水混合，并加入0.8g納米四氧化三鐵磁性顆粒、20mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%十二燒基苯磺酸鈉溶液，混合后超聲分散30min，超聲后向分散液中加入7 OmL玉米油和玉米油質(zhì)量5%失水山梨醇脂肪酸酯，混合后在15000r/min轉(zhuǎn)速下乳化I Omin;隨后上述乳化結(jié)束后向乳化混合液中加入40mL戊二醛，在400r/min轉(zhuǎn)速下攪拌固定反應(yīng)6h，固定反應(yīng)后在8500r/min轉(zhuǎn)速下離心分離得沉淀物，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%失水山梨醇脂肪酸酯溶液清洗3次，將清洗后沉淀物放入烘箱中在60 0C下干燥Sh，得磁性二氧化硅微球載體;接下來(lái)將上述磁性二氧化硅微球載體按固液比1: 2加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%三氯化磷溶液中，在室溫下攪拌反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵進(jìn)行分離，將分離物用去離子水清洗6次，清洗后再用磁鐵分離并冷凍干燥，即可得到酰氯化修飾后磁性二氧化硅微球;最后將上述酰氯化修飾后磁性二氧化硅微球按固液比I: 3加入用緩沖液配置的漆酶溶液中，在35°C下振蕩反應(yīng)Sh，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾，將濾渣用PH4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液沖洗5次，即可得到酰氯化修飾磁性二氧化硅微球固定化漆酶;所述的緩沖液配置的漆酶溶液是有pH為4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和濃度為lmg/mL的漆酶液按體積比1:2混合。
[0014]使用時(shí)，按固液比1:3000，將本發(fā)明制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶倒入廢水中，充分混合均勻，曝氣處理3h，之后檢測(cè)水源，可測(cè)得廢水中的COD從原來(lái)的5000mg/L降低到了550mg/L，去除率高達(dá)89%，效果極其顯著。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種酰氯化修飾磁性二氧化硅微球固定化漆酶的制備方法，其特征在于具體制備步驟為: (1)稱取30?50g塊狀二氧化硅大孔材料，將其放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%鹽酸中浸泡1?2h，浸泡后O過(guò)濾取出，將酸處理后的塊狀二氧化硅大孔材料放入聚四氟乙烯內(nèi)襯反應(yīng)釜中，按固液比1: 5加入混合有機(jī)溶劑，設(shè)置溫度為80?120 0C，保溫?cái)嚢璺磻?yīng)10?12h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過(guò)濾得二氧化硅大孔材料分別用丙酮和去離子水清洗3?5次;所述的混合有機(jī)溶劑是由γ-(2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷和正己烷按體積比1:2混合； (2)將上述清洗后的二氧化硅大孔材料按固液比1:3與去離子水混合，并加入0.5?.0.8g納米四氧化三鐵磁性顆粒、15?20mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%十二烷基苯磺酸鈉溶液，混合后超聲分散20?30min，超聲后向分散液中加入50?70mL玉米油和玉米油質(zhì)量2?5%失水山梨醇脂肪酸酯，混合后在12000?150001'/111；[11轉(zhuǎn)速下乳化5?10111；[11; (3 )上述乳化結(jié)束后向乳化混合液中加入30?40mL戊二醛，在200?400r/min轉(zhuǎn)速下攪拌固定反應(yīng)5?6h，固定反應(yīng)后在8000?8500r/min轉(zhuǎn)速下離心分離得沉淀物，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%失水山梨醇脂肪酸酯溶液清洗2?3次，將清洗后沉淀物放入烘箱中在50?60°C下干燥.6?8h，得磁性二氧化硅微球載體； (4)將上述磁性二氧化硅微球載體按固液比1:2加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%三氯化磷溶液中，在室溫下攪拌反應(yīng)15?20min，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵進(jìn)行分離，將分離物用去離子水清洗4?6次，清洗后再用磁鐵分離并冷凍干燥，即可得到酰氯化修飾后磁性二氧化硅微球； (5)將上述酰氯化修飾后磁性二氧化硅微球按固液比1:3加入用緩沖液配置的漆酶溶液中，在15?35°C下振蕩反應(yīng)6?Sh，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾，將濾渣用pH4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液沖洗3?5次，即可得到酰氯化修飾磁性二氧化硅微球固定化漆酶;緩沖液配置的漆酶溶液是有pH為4.5磷酸氫二鈉-梓檬酸緩沖液和濃度為lmg/mL的漆酶液按體積比1: 2混入口。
【文檔編號(hào)】C12N11/14GK105907744SQ201610469755
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月26日
【發(fā)明人】周榮, 張明, 王統(tǒng)軍
【申請(qǐng)人】周榮