能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種如SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列的融合基因。本發(fā)明還公開一種如SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列的融合基因所編碼的蛋白。本發(fā)明還公開一種能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗，其特征在于，所述亞單位疫苗包含如上所編碼的蛋白。本發(fā)明提供的亞單位疫苗不僅能夠激發(fā)B細胞免疫產(chǎn)生抗體，更能夠充分激發(fā)T細胞免疫，T細胞免疫對PRRSV這類對免疫系統(tǒng)有抑制作用的病毒的清除是非常重要的，從而能夠有效保護豬只，減少被藍耳病病毒感染，用于防治豬藍耳病。
【專利說明】
能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)和農(nóng)學(xué)的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種能夠誘導(dǎo)針對 豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗，用于預(yù)防豬呼吸和免疫系統(tǒng)綜合征(PRRS，俗稱藍耳 病)。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬藍耳病(PRRS)是一種具有高度傳染性和高度破壞性的疾病，呈地域性爆發(fā)和流 行性，是養(yǎng)豬業(yè)頭號傳染病威脅。隨著社會的發(fā)展和人民生活水平的提高，對肉、蛋、奶等畜 牧養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)品的需求越來越高。而基于我們的傳統(tǒng)和生活習(xí)慣，豬肉又是占了需求中的重 中之重。生豬養(yǎng)殖業(yè)在市場需求的刺激下迅速蓬勃發(fā)展，已經(jīng)逐漸形成了集約化，規(guī)?；?養(yǎng)殖模式。
[0003] 這種模式在提高效率和節(jié)約成本的同時，也帶來了由于養(yǎng)殖密度過大等原因造成 的各種傳染病多發(fā)。例如，養(yǎng)豬業(yè)最常見的豬生殖與呼吸綜合癥(俗稱)藍耳病等病毒性疾 病。藍耳病是由豬生殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)引起的。該病毒傳染性極強，可通過空氣， 接觸，體液，血液等多種方式傳播，且感染后死亡率極高。被感染的斷奶前仔豬的死亡率高 達80-100%。
[0004]由于PRRSV的基因組DNA復(fù)制不具有嚴格的糾錯機制，所以病毒在全世界各地傳播 時，隨著時間的推移和空間距離的增大，產(chǎn)生出了各種變種亞型。已知在中國主要流行的的 藍耳病亞型-中國高致病性亞型(HP-PRRSV)就是PRRSV北美亞型病毒的在進入中國之后，由 于基因突變產(chǎn)生的一個變種。
[0005] 藍耳病病毒具有很強的種屬特異性，只感染豬類，各種品種、不同年齡和性別的豬 只均可感染，但以妊娠期母豬和斷奶前一月齡以內(nèi)的仔豬最易感染?；疾∝i和無臨床癥狀 的病毒攜帶者是本病的重要傳染源。傳染途徑多樣化，包括接觸感染、體液傳播、空氣傳播 和精液傳播，藍耳病病毒可以穿透血胎屏障，因此孕豬可以通過胎盤垂直傳播給仔豬。易感 豬與帶毒豬直接接觸或與污染有PRRSV的豬舍、運輸工具、水源和食物接觸均可受到感染。 豬群一旦感染藍耳病，用常規(guī)方法就很難清除。持續(xù)性感染是PRRS流行病學(xué)的重要特征， PRRSV可在感染豬體內(nèi)存在很長時間。
[0006] 在國內(nèi)，接種傳統(tǒng)的滅活病毒疫苗和減毒疫苗是防治藍耳病等的主要方式。
[0007] 目前的減毒苗主要分為兩類，第一類是源自經(jīng)典毒株的減毒苗，例如哈獸研、海 利、大北農(nóng)和易邦生產(chǎn)的CH1R株苗，南農(nóng)高科和瑞普生產(chǎn)的R98株和勃林格VR2332株等。該 類苗毒力相對較低，雖然注射后在豬群中持續(xù)存在，但是不容易產(chǎn)生病毒復(fù)活感染的現(xiàn)象。 缺點是與目前流行毒株親緣關(guān)系較遠;對高致病性藍耳病僅僅有部分同源性，保護力不足。 第二類是源自高致病性藍耳病病毒的弱毒苗，目前有江西株和湖南株兩種，源自變異的高 致病性藍耳病毒株，分離自2006年。這一類弱毒苗與現(xiàn)在國內(nèi)流行毒株同源性較高，相對于 滅活苗的免疫保護效率更高，表現(xiàn)為可降低感染壓力，減輕病毒血癥，減少排毒，防止由藍 耳病引起的呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)疾病，防止由藍耳病引起的繁殖障礙。但是弱毒苗的缺點也 十分明顯:殘余毒力較強，對于種豬和低日齡仔豬應(yīng)用安全性不確定，并且在豬體內(nèi)存在時 間長，容易發(fā)生毒力返強，在這種情況下，減毒疫苗非但不能治病，反而成了助紂為虐的特 洛伊木馬，協(xié)助病毒攻破豬的免疫系統(tǒng)。存在免疫抑制作用，接種毒力偏強的PRRS弱毒疫苗 可能導(dǎo)致免疫抑制，主要表現(xiàn)為持續(xù)免疫某種PRRS弱毒疫苗一定時期后，豬群繼發(fā)感染加 重，豬場生產(chǎn)水平持續(xù)惡化。這是許多豬場認為免疫PRRS疫苗無效甚至有害的根源。
[0008] 目前國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)預(yù)防和治療藍耳病等病毒性傳染病還依賴大量使用化學(xué)藥物，例 如病毒靈(鹽酸嗎啉胍)等。而化藥除了治療病毒性傳染病特異性差、副作用強等缺點外，另 一個重要缺陷就是存在藥物殘留，目前藥物殘留已成為豬肉安全最大的隱患之一。人吃了 含藥物和激素殘留的豬肉食品，能誘發(fā)兒童提前發(fā)育、女性乳腺癌、卵巢癌等疾病，還會引 起過敏反應(yīng)。藥物殘留也可能導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性，經(jīng)常食用低劑量藥物殘留的食品可 使細菌產(chǎn)生耐藥性并破壞人體腸道的菌群平衡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的之一是提供一種融合基因。
[0010] 本發(fā)明的目的之二是提供一種根據(jù)融合基因所編碼的蛋白。
[0011]本發(fā)明的目的之三是提供一種能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫 苗，所述亞單位疫苗包含所編碼的蛋白，所述亞單位疫苗不僅能夠激發(fā)B細胞免疫產(chǎn)生抗 體，更能夠充分激發(fā)T細胞免疫，T細胞免疫對PRRSV這類對免疫系統(tǒng)有抑制作用的病毒的清 除是非常重要的，從而能夠有效保護豬只，減少被藍耳病病毒感染，用于防治豬藍耳病。 [0012]本發(fā)明公開了一種如SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列的融合基因。
[0013] 一種如SEQ ID No. 1所示的多核苷酸序列的融合基因所編碼的蛋白。
[0014] 一種能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗，其特征在于，所述亞單 位疫苗包含所編碼的蛋白。
[0015] 優(yōu)選的是，其中，上述所編碼的蛋白包括：
[0016] 豬藍耳病病毒(PRRSV)GP5蛋白T-細胞抗原表位部分連續(xù)多核苷酸序列和豬藍耳 病病毒(PRRSV)GP4蛋白T-細胞抗原表位部分連續(xù)多核苷酸序列相拼接的第一部分，白喉毒 素 DT的部分連續(xù)多核苷酸序列的第二部分和轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號肽的第三部分；
[0017] 其中，
[0018]所述第一部分的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0019] 所述第二部分的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0020] 所述第三部分的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0021] 優(yōu)選的是，其中，上述所編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0022] 優(yōu)選的是，其中，所述第一部分的多核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0023] 所述第二部分的多核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述第三部分的多 [0024] 核苷酸序列如SEQ ID No .8所示。
[0025]優(yōu)選的是，其中，所述亞單位疫苗的有效濃度為200_300ug/劑。
[0026] 一種能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗，其特征在于，所述亞單 位疫苗包含根據(jù)如SEQ ID No.9所示的多核苷酸序列所編碼的蛋白，所編碼的蛋白包括：
[0027]銅綠假單胞菌外毒素的細胞結(jié)合和轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域的部分連續(xù)多核苷酸序列的第一 部分，豬藍耳病病毒(PRRSV)GP5蛋白T-細胞抗原表位部分連續(xù)多核苷酸序列和豬藍耳病病 毒(PRRSV)GP4蛋白Τ-細胞抗原表位部分連續(xù)多核苷酸序列相拼接的的第二部分和轉(zhuǎn)運結(jié) 構(gòu)域-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號肽的第三部分；
[0028]其中，
[0029]所述第一部分的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0030] 所述第二部分的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示；
[0031] 所述第三部分的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0032] 應(yīng)用上述能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗防治豬藍耳病。
[0033] -種上述的能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗防治豬藍耳病的 方法，其特征在于，輔以佐劑。
[0034]優(yōu)選的是，其中，所述佐劑為無機佐劑、白油佐劑以及福氏佐劑。其中，所述無機佐 劑包括氫氧化鋁佐劑、明礬佐劑等；所述白油佐劑可為油包水型白油佐劑（例如：法國 SEPPIC MONTANIDE ISA11R VG)，或者水包油型白油佐劑（例如：法國SEPPIC M0NTANIDE ISA61 VG)，優(yōu)選油包水型白油佐劑（例如：法國SEPPIC MONTANIDE ISA 11R VG)。
[0035]本發(fā)明的有益效果是：
[0036]本申請發(fā)明人通過對在全國四個有代表性的不同地域的PRRSV生物樣本進行亞型 分析和全基因組序列分析，進行T-細胞抗原表位篩選，來針對性地篩選特異性的、高效的病 毒抗原。根據(jù)序列分析和T-細胞、B-細胞抗原表位篩選的結(jié)果，有針對性地設(shè)計特異性抗原 序列。并加入白喉桿菌外毒素或者銅綠假單胞菌外毒素的細胞結(jié)合和轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域序列，使 得PRRSV的T-細胞抗原能夠進入被免疫豬只的細胞內(nèi)部，激發(fā)細胞免疫。在疫苗表達基因的 3 ' -末端加入RDEL-KKDLKDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號肽，構(gòu)建PM-PRRSV-KDEL新型藍耳病基因工程 亞單位疫苗。所述亞單位疫苗能夠進入動物細胞內(nèi)部，并且通過信號肽的引導(dǎo)，長期停留在 動物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，使得疫苗蛋白可以進入被免疫豬只細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，經(jīng)過處理后能 夠被MHC-I呈遞，在激發(fā)體液免疫的同時，還能有效激發(fā)細胞毒性T-細胞的免疫應(yīng)答，從而 使得B細胞和T細胞協(xié)同作戰(zhàn)，能對免疫系統(tǒng)進行全面性的保護，安全且無抗體依賴性增強 (ADE)作用，可對中國多發(fā)的藍耳病病毒亞型能有效免疫和殺滅。市場前景廣闊。
[0037]本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義
[0038]除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實踐或測試中可使用與本文所述者 類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。
[0039] 術(shù)語"亞單位疫苗"意指通過化學(xué)分解或有控制性的蛋白質(zhì)水解方法，提取細菌、 病毒的特殊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，篩選出的具有免疫活性的片段制成的疫苗。
[0040] 術(shù)語"表達載體"意指在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達元件（如啟動子、 RBS、終止子等），使目的基因能夠表達的載體。如本申請中提及的表達載體pET-15b是一個 具有典型表達結(jié)構(gòu)的大腸桿菌高效表達載體。其中，目的基因為本申請中的指導(dǎo)編碼 PRRSV-DT-ER融合蛋白或者PRRSV-PE-ER融合蛋白的融合基因。
[0041] 術(shù)語"多核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷(DNA)、核 糖核苷或核糖核苷酸(RNA)及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸 的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的 核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包括 PNA(肽核酸）、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指 定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取 代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個或一個以上所選(或 所有）密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代 (Batzer等人，Nucleic Acid Res · 19:5081 (1991) ;Ohtsuka等人，J.Biol ·Chem. 260:2605-2608(1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
[0042] 術(shù)語"氨基酸"意指構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，賦予蛋白質(zhì)特定的分子結(jié)構(gòu)形態(tài)，使 他的分子具有生化活性。蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)重要的活性分子，包括催化新陳代謝的酵素和 酶。不同的氨基酸脫水縮合形成肽(蛋白質(zhì)的原始片段），是蛋白質(zhì)生成的前體。
[0043] 術(shù)語"外源蛋白"和"蛋白"意指氨基酸殘基的聚合物。所述術(shù)語適用于天然產(chǎn)生氨 基酸聚合物以及其中一個或一個以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。
[0044] 術(shù)語"PCR"意指聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR。聚合酶鏈 反應(yīng)(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫 延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度 高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可 用于疾病的診斷或任何有DNA、RNA的地方.聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain React ion，簡 稱PCR)又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術(shù)。
[0045]術(shù)語"引物"意指一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點，除非特定限制，否 則所述術(shù)語涵蓋自然中生物的DNA復(fù)制和聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)中人工合成的引物(通常為 DNA引物）。之所以需要引物是因為在DNA合成中DNA聚合酶僅僅可以把新的核苷酸加到已有 的DNA鏈上。除非特定限制，否則上游引物為在DNA復(fù)制時，作為DNA模板3'端的復(fù)制起始點 的引物，下游引物為在DNA復(fù)制時，作為DNA|旲板5端的復(fù)制起始點的引物。
[0046] 術(shù)語"緩沖液"意指一類當(dāng)往某些溶液中加入一定量的酸和堿時，有阻礙溶液pH變 化作用的溶液。
【附圖說明】
[0047] 圖1為本發(fā)明所述的亞單位疫苗中包含的所編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)簡圖，其中，A為第 一部分，B為第二部分，C為第三部分；
[0048] 圖2為本發(fā)明實施例1中的基因克隆的過程簡圖，用于構(gòu)建融合基因；
[0049] 圖3為本發(fā)明實施例1的疫苗融合蛋白的純化過程中進行的跑SDS-PAGE蛋白膠后 的考馬斯亮藍染色照片，其中，1.蛋白分子量標準，2.全細胞裂解液，3. Ni-IDA親和層析未 結(jié)合流穿液，4.低濃度咪唑漂洗流穿液，5.Ni-IDA純化的疫苗蛋白，經(jīng)過DEAE-sephaorse離 子交換層析和羥基磷灰石層析純化的疫苗蛋白；
[0050] 圖4為本發(fā)明實施例3中應(yīng)用本發(fā)明所述的能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答 的亞單位疫苗進行豬只攻毒保護實驗的結(jié)果對比圖。
【具體實施方式】
[0051] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實施。
[0052] 實施例1:
[0053] 1)編碼疫苗融合蛋白的基因克隆和原核表達
[0054]將編碼PRRSV T-細胞抗原-白喉毒素 DT-細胞結(jié)合和轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號 肽(簡稱PRRSV-DT-ER)融合蛋白（如圖1所示）的基因序列分段擴增，用多片段同源重組的方 法克隆到大腸桿菌高效表達載體pET-15b中（如圖2所示）。
[0055]引物設(shè)計：用引物1:5' -GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCGCTGGCGGCGCTGATTTG-3 '（5 '-端為與pET15b Ndel酶切位點以及上游同源的序列，3 '端為GP5同源序列）和引物2:5'_ ATGAGCTACC TACTGA AATTGCCAAC AGAATGGCAA-3'（5'_端為與白喉毒素 DT-細胞結(jié)合和轉(zhuǎn)運 結(jié)構(gòu)域同源的序列，3'端為PRRSV GP4同源序列）來擴增合成的PRRSV GP5和GP4的優(yōu)選T-細 胞抗原表位編碼序列（通過人工合成原始序列）；用引物3:5'_ CTGTTGGCAATTTCAGTAGGTAGCTCATTGTC-3'（5'_端為PRRSV GP4同源序列，3'端為與DT細胞結(jié) 合和轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域同源的序列）和引物4 : 5 ' - GCTTTGTTAGCAGCCGGATCCCAGTTCATCTTTCAGATCTTTTTTCAG TTCATCGCGGCTTTTGATTTCAAAAAATA-3'（5'_端為與pET 15b Bamm酶切位點以及下游同源的 序列，中間的36個堿基編碼ER定位信號肽，3 '端為與白喉毒素 DT-細胞結(jié)合和轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域同 源的序列）來PCR擴增DT細胞結(jié)合和轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域以及ER定位信號肽。PCR產(chǎn)物經(jīng)過膠回收純 化以后，再使用閃電克隆試劑盒(金福賽(北京)生物科技），通過同源重組的方法，與Ndel/ BamM酶切過的pET-15b載體連接，得到表達編碼PRRSV-DT-ER疫苗融合蛋白的克隆。
[0056]上述引物1的序列表示在序列表中為，如SEQ ID No. 11所示的多核苷酸序列；上述 引物2的序列表示在序列表中為，如SEQ ID No.12所示的多核苷酸序列；上述引物3的序列 表示在序列表中為，如SEQ ID No.13所示的多核苷酸序列；上述引物4的序列表示在序列表 中為，如SEQ ID No. 14所示的多核苷酸序列。
[0057] 2)疫苗融合蛋白的原核表達和純化：
[0058] 將表達疫苗融合蛋白的pET-15b-DT-Epit〇pe-KDEL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌株 BL21/DE3感受態(tài)細胞，37°C溫箱培養(yǎng)過夜。接種一個單菌落到50毫升LB液體培養(yǎng)基或其他 適于大腸桿菌生長的培養(yǎng)基+50ug/ml羧節(jié)青霉素，37°C，250rpm震蕩培養(yǎng)過夜。接種25ml過 夜培養(yǎng)菌液到1.5L預(yù)熱到37°C的、100ug/ml氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中（六瓶，每瓶1.5L， 共9L)，37°C，150-250rpm震蕩培養(yǎng)至0D600到達0 · 6。在每1 · 5升菌液中加入7 · 5毫升100mM IPTG，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)8-16小時誘導(dǎo)蛋白表達。結(jié)束培養(yǎng)，4700rpm離心10分鐘收集細胞。將所 有細胞用約2000ml預(yù)冷的雙蒸水重懸，再次離心洗滌細胞。去掉上清，將細胞凍存于-80°C。
[0059] 3)疫苗融合蛋白的純化：大腸桿菌中表達的疫苗蛋白是存在于胞內(nèi)的，通過跑 SDS-PAGE蛋白膠并進行考馬斯亮藍染色發(fā)現(xiàn)（如圖3所示），疫苗蛋白主要以包涵體的形式 存在。收集表達疫苗蛋白的菌體，用lxHis Binding緩沖液（20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl，5mM咪唑，ImM PMSF)吸打重懸細胞，重懸后加入Complete蛋白酶抑制劑以防止疫苗蛋 白降解，然后將含有主要含有目的疫苗蛋白的組分加入Complete蛋白酶抑制劑，利用疫苗 基因序列前端的His標簽進行親和層析柱純化。用超聲破碎儀或者高壓均質(zhì)機等方法破碎 大腸桿菌細胞，13000rpm離心20分鐘。小心地將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，不要碰到沉淀。 用包涵體重懸緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.5,2mM EDTA，10mM DTT，6M Gu-HCl)將沉淀重新 吸打溶解。用3倍體積的超純水沖洗100ml的Ni-IDA介質(zhì)柱，再用三倍體積的lxHis Binding 緩沖液平衡Ni-IDA介質(zhì)柱，然后把重懸的包涵體緩慢上樣到Ni-IDA介質(zhì)柱進行親和層析純 化，漂洗后加上1 OmM到500mM的咪唑梯度來洗脫蛋白，分別收集每一個洗脫峰。然后使用弱 陰離子交換樹脂DEAE_sepharose(30升發(fā)酵產(chǎn)物菌體需要約300ml的DEAE-Sepharose柱料） 去除絕大部分的內(nèi)毒素和其他雜質(zhì)，最后使用羥基磷灰石介質(zhì)濃縮和去除DNA污染，最后得 到純度達到99%以上的，藥品級別的疫苗蛋白。
[0060] 實施例2
[0061] 1)表達PRRSV疫苗融合蛋白畢赤氏酵母菌株的構(gòu)建及疫苗在畢赤氏酵母中的分泌 表達和純化
[0062] 畢赤氏酵母是真核生物，能夠?qū)Ρ磉_的外源蛋白進行翻譯后修飾，有助于提高疫 苗蛋白的免疫原性和幫助形成正確的空間結(jié)構(gòu)。
[0063] 設(shè)計引物，用PCR的方法，將實施例1中的PRRSV-DT-ER序列從pET-15b中擴增出來， 再用閃電克隆試劑盒克隆到酵母質(zhì)粒PPIC9K的Notl/EcoRI位點中，經(jīng)測序確認后，用SacI 限制性內(nèi)切酶線性化PPIC9K-PRRSV-DT-ER質(zhì)粒，用電擊法轉(zhuǎn)換畢赤氏酵母GS115感受態(tài)細 胞，在YM基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上篩選PRRSV-DT-ER序列整合到GS115酵母基因組中的陽性克隆。 然后將各個陽性克隆涂到Y(jié)PD+100到400ug/ml G-418抗生素平板上，篩選多拷貝插入，表達 量尚的克隆。
[0064] 2)疫苗融合蛋白的真核表達和純化：
[0065]通過甲醇誘導(dǎo)A0X1啟動子驅(qū)動的疫苗蛋白在畢赤氏酵母中的表達。畢赤氏酵母表 達的疫苗蛋白是分泌到胞外的，所以可以直接離心或過濾去除菌體，取上清，超濾濃縮后直 接上柱純化。用Ni-NTA(鎳柱）（30升發(fā)酵產(chǎn)物菌體需要約200ml的鎳柱填料進行純化)進行 第一步親和層析純化，可以用溫和條件來進行鎳柱純化。第二步用弱陰離子交換樹脂DEAE-sepharose去除絕大部分的內(nèi)毒素和其他雜質(zhì)，最后使用羥基磷灰石介質(zhì)濃縮和去除DNA污 染，最后得到純度達到99%以上的，藥品級別的疫苗蛋白。
[0066] 實施例3:
[0067] 使用本發(fā)明所提供的豬藍耳病基因工程重組蛋白疫苗進行豬只攻毒保護實驗。10 只無特定病原（SPF)的月齡仔豬被分為兩組，第一組五只為疫苗組，第二組為對照組，分別 飼養(yǎng)在環(huán)境相同的兩個通風(fēng)良好，帶有空氣過濾設(shè)施的恒溫恒濕培養(yǎng)室內(nèi)。配合佐劑，第一 組的每只豬分別注射250微克PRRSV基因工程重組蛋白疫苗，而對照組的仔豬分別注射lml 的無菌生理鹽水。2周后，進行第二次增強免疫，所用方法和注射劑量與第一次免疫相同。第 二次免疫兩周后，兩組仔豬都用鼻內(nèi)滴注的方式接種3 X105TCID5Q的高藍藍耳病病毒 JXwn06培養(yǎng)物(在Marc-145中細胞培養(yǎng)）。
[0068] 病毒接種后一周內(nèi)，每天定時測量體溫作為感染程度的一個指標，結(jié)果如表1所 示；
[0069] 表1:仔豬接種病毒后一周內(nèi)體溫的變化
[0070]
[0071] 從表1的結(jié)果可以看到，未接種疫苗的對照組，豬只都出現(xiàn)了不同程度的發(fā)熱。以 體溫達到40.5°C為界，對照組豬只在第三天后已經(jīng)開始全面有發(fā)熱現(xiàn)象，而且其中兩只在 第6、7天相繼死亡。而疫苗接種組的五只仔豬，在接種病毒三天后均未出現(xiàn)明顯發(fā)熱，只是 體溫較接種前略有升高。到第四天，才有一只出現(xiàn)發(fā)熱現(xiàn)象，到第7天也只有兩只有發(fā)熱現(xiàn) 象，說明接種本發(fā)明所述疫苗能有效緩解PRRSV感染所帶來的發(fā)熱癥狀。
[0072]為了檢測病毒接種后PRRSV在仔豬血液中的感染情況，分別在病毒接種前和接種 后5日抽血，用血液RNA提取試劑盒去除血液中的紅細胞，離心收集白細胞，再用柱離心法提 取血液白細胞總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法檢測仔豬血液中藍耳病 病毒的核酸含量。檢測方法為用相對突變較少的PRRSV核殼蛋白N(0RF7編碼)為目的基因， 以豬alpha肌動蛋白ACTA1作為內(nèi)參基因，計算攻毒實驗組豬只與對照組豬只的相對病毒核 酸含量。血液中？1?^￥病毒核酸相對含量計算公式為 ：2~[(01^7^4(^1^)棚齟-(01^7^-ACTAkt)^鎺]。結(jié)果如圖4所示。通過qRT-PCR檢測攻毒組與對照組的PRRSV核酸含量，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，病毒接種前，實驗組和對照組均未檢測出藍耳病病毒;而當(dāng)病毒接種后第五天，未注射 疫苗的仔豬都不同程度感染了 PRRSV，而注射了 PRRSV基因工程重組蛋白疫苗的實驗仔豬則 只有一頭出現(xiàn)感染，一頭有疑似低濃度感染，另外三頭均無病毒感染。該實驗說明，通過接 種本發(fā)明所述的PRRSV基因工程重組蛋白疫苗能夠有效地保護仔豬抵抗藍耳病病毒的侵 染。
[0073]豬藍耳病最顯著的病理特征是肺部的病變，主要的病變特征為:病豬的肺部與橫 膈肌或胸膜粘連，肺臟紅色胰樣肉變，與正常組織界限明顯，間質(zhì)增寬，肺組織表面結(jié)節(jié)狀 增生，組織壞死水腫，病灶切開后切面多汁，氣管、支氣管內(nèi)充滿出血性泡沫狀黏液及黏膜 滲出物。為檢驗疫苗的保護效果，在攻毒試驗進行兩周后，將所有仔豬進行肺部解剖，在兩 周之前已經(jīng)死亡的仔豬也進行肺部解剖，進行病理觀察，病變程度從輕到重，分別用數(shù)字1-5來表不，結(jié)果如表2所;^。
[0074]表 2
[0075]
[0076]
[0077] 肺部病理解剖結(jié)果顯示，未接種疫苗的對照組的仔豬都發(fā)生了嚴重的典型藍耳病 肺部病變，而接種疫苗的仔豬一只輕度病變，一只中度病變，而3只未見明顯病變。
[0078] 通過分子生物學(xué)、免疫學(xué)和病理解剖學(xué)的實驗說明，與對照組相比，通過接種本發(fā) 明所述的PRRSV基因工程重組蛋白疫苗，能夠有效地保護仔豬抵抗藍耳病病毒的侵染，大大 提高豬只的健康狀況。
[0079]盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列 運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地 實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限 于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【主權(quán)項】
1. 一種如SEQ ID No. 1所示的多核苷酸序列的融合基因。2. -種如SEQ ID No. 1所示的多核苷酸序列的融合基因所編碼的蛋白。3. -種能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗，其特征在于，所述亞單位 疫苗包含如權(quán)利要求2所編碼的蛋白。4. 如權(quán)利要求3所述的能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗，如權(quán)利要 求2所編碼的蛋白包括： 豬藍耳病病毒GP5蛋白T-細胞抗原表位部分連續(xù)多核苷酸序列和豬藍耳病病毒GP4蛋 白T-細胞抗原表位部分連續(xù)多核苷酸序列相拼接的第一部分，白喉毒素 DT的部分連續(xù)多核 苷酸序列的第二部分和轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號肽的第三部分； 其中， 所述第一部分的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示； 所述第二部分的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示； 所述第三部分的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。5. 如權(quán)利要求4所述的能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗，其特征在 于，所編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。6. 如權(quán)利要求4所述的能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗，其特征在 于，所述第一部分的多核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述第二部分的多核苷酸序列如 SEQ ID No.7所示，所述第三部分的多核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。7. 如權(quán)利要求3所述的能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗，其特征在 于，所述亞單位疫苗的有效濃度為200-300ug/劑。8. 應(yīng)用如權(quán)利要求2所編碼的蛋白制備能夠防治豬藍耳病的亞單位疫苗。9. 一種如權(quán)利要求3所述的能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗的使用 方法，其特征在于，輔以佐劑。10. 如權(quán)利要求9所述的能夠誘導(dǎo)針對豬藍耳病毒的免疫應(yīng)答的亞單位疫苗的使用方 法，其特征在于，所述佐劑為無機佐劑、白油佐劑以及福氏佐劑。
【文檔編號】A61P31/14GK105907776SQ201610333073
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】楊波, 楊建
【申請人】金福賽（北京）生物科技有限公司