一種高均一度大分子量Levan型果聚糖的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高均一度大分子量Levan型果聚糖的制備方法，利用現(xiàn)代分子酶工程技術對果糖基蔗糖轉移酶進行分子改造，獲得果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R，成功在大腸桿菌中進行原核表達，通過對表達的蛋白純化，將純化的酶與底物蔗糖反應，經(jīng)乙醇沉淀得到Levan型果聚糖樣品。本發(fā)明采用的果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R制備Levan型果聚糖時，底物蔗糖的濃度可以達到40％，通過凝膠色譜法確定了其分子量的大小為2×106Da，屬于大分子多糖，且Levan型果聚糖均一性好，分散度為2.06，優(yōu)于目前生物法制備Levan型果聚糖。
【專利說明】
一種局均一度大分子量Levan型果聚糖的制備方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及一種高均一度大分子量Ievan型果聚糖的制備方法。
【背景技術】
[0002]Levan型果聚糖是兩種主要類型的果聚糖之一，是天然存在的果糖均聚物，其主鏈由重復的β_(2，6)_糖苷鍵連接，支鏈由β-(2，I)-糖苷鍵連接。Levan型果聚糖在許多領域都有廣泛的應用，在食品工業(yè)中，果聚糖可以作為果糖源，乳化劑，包封劑和風味改良劑，由于果聚糖具有難以消化的特性，而且具有低熱量和致齲性，此外還可以作為益生元來刺激益生菌在腸道菌群的增殖，因此果聚糖被用作糖替代物;在醫(yī)藥行業(yè)，果聚糖可以作為一種免疫調節(jié)劑，血漿的替代品，延長藥物效果并作為膽固醇在腸道中的吸附劑;果聚糖還具有保濕作用，可以應用到化妝品中；此外，由運動發(fā)酵單胞菌果糖基蔗糖轉移酶生成的果聚糖還具有抗腫瘤，抗病毒活性。
[0003]Levan型果聚糖可以通過果糖基鹿糖轉移酶(Levansucrase，EC2.4.1.10)從鹿糖通過轉糖基反應產(chǎn)生。果糖基蔗糖轉移酶屬于糖苷水解酶(GH68)家族，該家族還包括β-呋喃果糖苷酶和菊糖蔗糖酶，這三種酶都是以蔗糖作為其優(yōu)先選擇的底物供體，其分子結構主要由N末端的信號肽，催化中心和C末端區(qū)三個部分構成。絕大部分的果糖基蔗糖轉移酶都包括了三個保守區(qū)，由三個不同的氨基酸殘基構成，它們分別是親核基團，酸/堿催化基團和過渡態(tài)穩(wěn)定基團，是該酶行使催化功能的最重要的區(qū)域。
[0004]目前可以產(chǎn)生果糖基蔗糖轉移酶的微生物包括芽孢桿菌(Bacillus)、運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、多黏類芽抱桿菌(PaenibaciIIus polymyxa)、金山乳桿菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、粘性放線菌(Actinomyces viscosus)和假單胞菌(Pseudomonas)等。運動發(fā)酵單胞菌是革蘭氏陰性細菌，主要是拿來作為生產(chǎn)乙醇的菌株，近年來研究其生產(chǎn)果糖基蔗糖轉移酶也越來越多，野生型的運動發(fā)酵單胞菌可以產(chǎn)生大分子量的果聚糖，但是重組蛋白的和底物反應產(chǎn)生的果聚糖的分子量卻相對較小，有的只能合成寡聚糖。果聚糖的化學合成以及從植物中提取均一度高的果聚糖都非常的困難，微生物發(fā)酵產(chǎn)果聚糖是目前工業(yè)上應用的最廣泛的方法，但是其發(fā)酵產(chǎn)物的分子量往往變化較大，而且催化效率不高。因此，提供可以產(chǎn)均一度高的大分子果聚糖的果糖基蔗糖轉移酶對于Levan型果聚糖工業(yè)化生產(chǎn)和應用具有十分重要的意義。
[0005]目前中國發(fā)明專利201310403373.9公開了一種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體T305A，是利用現(xiàn)代分子酶工程技術對來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的左聚糖蔗糖酶氨基酸序列進行分子改造，通過易錯PCR和活力篩選，獲得突變體T305A，將其基因插入PSE380構建重組載體，導入大腸桿菌宿主表達。該突變體酶與野生型酶相比，在以蔗糖為底物轉糖苷形成左聚糖反應中的底物濃度耐受性顯著提高，達到最高轉化率時的底物濃度由野生型酶的10%提高到突變體酶的25%。在該發(fā)明中沒有提到該專利能夠制造均一、高分子量的Levan型果聚糖，而且果糖基蔗糖轉移酶對底物耐受只能耐受25%濃度的底物。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種高均一度大分子量Levan型果聚糖的制備方法，以克服現(xiàn)有方法底物耐受性不高，產(chǎn)生的果聚糖的分子量卻相對較小，有的只能合成寡聚糖的問題，改善酶法制備Levan型果聚糖的效果。
[0007]為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過以下方式來實現(xiàn):
[0008]—種高均一度大分子量Levan型果聚糖的制備方法，包括以下步驟:
[0009](I)構建果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R
[0010]設計利用引物F: H280R為5 ’ -CTCTTTACGATCAGCCGTGATTCGACTTATG-3 ’，引物R:H280R為5 ’ -CATAAGTCGAATCACGGCTGATCGTAAAGAG-3 ’，并以質粒pET_32a_lev為模板，根據(jù)Dpn I法定點突變的反應原理，構建果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R，設定PCR程序；
[0011]PCR擴增反應體系為:1yL Primer STAR Max，IyL引物F:H280R，IyL引物R:H280R，2yL模板pET-32a-lev，反應總體積為20yL ；
[0012]PCR 擴增條件為:94°C 預變性 3min，94°C 變性 30s;54°C 褪火 30s;72°C 延伸 3min45s;共進行30個循環(huán)反應;然后于72°C繼續(xù)延伸1min;
[0013]PCR產(chǎn)物驗證、回收后，經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切消化，克隆到PGEX-4T-1質粒，轉入E.coli BL21(DE3)；
[0014](2)果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R的表達與純化
[0015]將步驟(I)中構建好的含有的果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R的野生型和突變型重組菌株的菌液，分別轉接到含有一定濃度氨芐青霉素的200ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3?4h，當0D_達到0.6?0.8時，加入終濃度為0.2?0.5mmol/L的誘導劑IPTG，在28°C的溫度下誘導培育4h左右，并在12000rpm的轉速下離心5min收集菌體，利用向沉淀中加入細胞裂解緩沖液，并在冰上超聲破碎2min至菌液澄清，再將離心管放入轉速為12000rpm、溫度為4°C的離心機中，離心1min，取上清移至另一干凈離心管；
[0016]重組菌株經(jīng)誘導劑IPTG培養(yǎng)過夜后收集濕菌體，破碎收集含有果糖基蔗糖轉移酶的粗酶液，然后將粗酶液加載到含目His標簽的純化柱中，通過含有20mmol/L的PB、500mmol/L 的 NaCl 和 20mmol/L 的咪唑緩沖液 I 和含有 20mmol/L 的 PB、500mmol/L 的 NaCl 和500mmol/L的咪唑緩沖液II，緩沖液I和緩沖液II的酸堿度pH為7.4，進行梯度洗脫，層析結束后對洗脫的收集液，進行SDS-PAGE驗證；
[0017](3)酶法合成制備Levan型果聚糖
[0018]將步驟(2)中純化的果糖基蔗糖轉移酶與25?40%濃度的蔗糖反應，添加pH為6.0的檸檬酸緩沖液，保持反應的溫度為40?50 0C，反應時間為48h，利用sevag法去除蛋白，加入三倍體積于果糖基蔗糖轉移酶反應液的酒精，在4 °C低溫條件下使多糖沉淀并收集沉淀，再利用濃度為60?80%的乙醇溶液洗滌兩次后，將沉淀再用三級水溶解收集，經(jīng)凍干機冷凍獲得粉末狀的Levan型果聚糖。
[0019]進一步的，所述步驟(2)中的氨芐青霉素的濃度為30?60yg/mL。
[0020]所述步驟(2)中冰上超聲破碎的超聲波需求功率為120W，且超聲破碎為每隔2s時間超聲破碎I S。
[0021]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有的有益效果:
[0022]1、采用果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R制備Levan型果聚糖時，底物蔗糖的濃度可以達到40% ；
[0023]2、本發(fā)明克隆得到了果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R，并成功在BL21(DE3)大腸桿菌中進行原核表達，通過對表達的蛋白純化，將純化的酶與底物蔗糖反應經(jīng)乙醇沉淀得到多糖樣品，通過凝膠色譜法確定了其分子量的大小為2X 16Da,屬于大分子多糖；
[0024]3.本發(fā)明制備的Levan型果聚糖均一性好，分散度為2.06，優(yōu)于目前生物法制備Levan型果聚糖。
【具體實施方式】
[0025]下面結合具體實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0026]—種高均一度大分子量Levan型果聚糖的制備方法，包括以下步驟:
[0027](I)構建果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R
[0028]設計利用引物F: H280R為5 ’ -CTCTTTACGATCAGCCGTGATTCGACTTATG-3 ’，引物R:H280R為5 ’ -CATAAGTCGAATCACGGCTGATCGTAAAGAG-3 ’，并以質粒pET_32a_lev為模板，根據(jù)Dpn I法定點突變的反應原理，構建果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R，設定PCR程序；
[0029]PCR擴增反應體系為:1yL Primer STAR Max，IyL引物F: H280R，IyL引物R:H280R，2yL 模板 pET-32a-lev，反應總體積為 20yL ；
[0030]PCR 擴增條件為:94°C 預變性 3min，94°C 變性 30s;54°C 褪火 30s;72°C 延伸 3min45s;共進行30個循環(huán)反應;然后于72°C繼續(xù)延伸1min;
[0031 ] PCR產(chǎn)物驗證、回收后，經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切消化，克隆到PGEX-4T-1質粒，轉入E.coli BL21(DE3)；
[0032](2)果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R的表達與純化
[0033]將步驟(I)中構建好的含有的果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R的野生型和突變型重組菌株的菌液，分別轉接到含有濃度為30?60yg/mL的氨芐青霉素的200ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3?4h，當0D_達到0.6?0.8時，加入終濃度為0.2?0.5mmol/L的誘導劑IPTG，在28 °C的溫度下誘導培育4h左右，并在12000rpm的轉速下離心5min收集菌體，利用向沉淀中加入細胞裂解緩沖液，并在冰上超聲破碎2min至菌液澄清，所述冰上超聲破碎的超聲波需求功率為120W，且超聲破碎為每隔2s時間超聲破碎ls，再將離心管放入轉速為12000rpm、溫度為4°C的離心機中，離心1min，取上清移至另一干凈離心管；
[0034]重組菌株經(jīng)誘導劑IPTG培養(yǎng)過夜后收集濕菌體，破碎收集含有果糖基蔗糖轉移酶的粗酶液，然后將粗酶液加載到含目Hi s標簽的純化柱中，通過含有20mmol/L的PB、500mmol/L 的 NaCl 和 20mmol/L 的咪唑緩沖液 I 和含有 20mmol/L 的 PB、500mmol/L 的 NaCl 和500mmol/L的咪唑緩沖液II，緩沖液I和緩沖液II的酸堿度pH為7.4，進行梯度洗脫，層析結束后對洗脫的收集液，進行SDS-PAGE驗證；
[0035](3)酶法合成制備Levan型果聚糖
[0036]將步驟(2)中純化的果糖基蔗糖轉移酶與25?40%濃度的蔗糖反應，添加pH為6.0的檸檬酸緩沖液，保持反應的溫度為40?50 0C，反應時間為48h，利用sevag法去除蛋白，加入三倍體積于果糖基蔗糖轉移酶反應液的酒精，在4 °C低溫條件下使多糖沉淀并收集沉淀，再利用濃度為60?80%的乙醇溶液洗滌兩次后，將沉淀再用三級水溶解收集，經(jīng)凍干機冷凍獲得粉末狀的Levan型果聚糖。
[0037]對合成制備的Levan型果聚糖進行分析與鑒定
[0038]分別取I%的蔗糖、I %的Levan型果聚糖以及I %的葡萄糖為標準品，利用二苯胺為顯色劑，展開劑為正丁醇:冰乙酸:水為2?3:1?2:1?2，放置在溫度為80°C的烘箱中1min，觀察顯色情況。
[0039]選取純化后凍干的Levan型果聚糖粉末，配制成濃度為5mg/ml的溶液，經(jīng)過0.45um濾膜過濾去除雜質，采用凝膠色譜法測定其相對分子質量，色譜條件為色譜柱Ultrahydrogel?Linear 300mmX 7.8mmX 2，流動相為0.lmol/L的NaN03溶液，流速為0.QmT,/min，色譜柱溫度為45°C，測定Levan型果聚糖的分子量為2X 106Da。
[0040]精確稱取20mg純化的Levan型果聚糖粉末置于棕色安瓿瓶中，加入lmol/L H2SO4后真空封管，在90°C溫度下持續(xù)反應4h，待果聚糖完全水解后冷卻，用Ba⑶3中和，離心，重復多次，直到H2SO4溶液完全除盡;取其上清液經(jīng)過孔徑為0.45um的濾膜過濾后，用高效液相色譜法進行分析，并以果糖，葡萄糖作為標準品，其中色譜條件:色譜柱為CarboPac PA20 (3mmX 150mm,6μηι)，流速為0.5mL/min；采用梯度洗脫的方法，混合流動相為250mmol/L的NaOH溶液、lmol/L的NaAc溶液及超純水，其中梯度洗脫過程為:在O?21min內，NaOH溶液1.8%、NaAc溶液0% ;在21?30min內，NaOH溶液1.8%、NaAc溶液從5%上升到20% ;在30?50min內，NaOH溶液80%、NaAc溶液O %。
[0041]以上所述僅是本發(fā)明的實施方式，再次聲明，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進，這些改進也列入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1.一種高均一度大分子量Levan型果聚糖的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)構建果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R 設計利用引物F: H280R為5 ’ -CTCTTTACGATCAGCCGTGATTCGACTTATG-3 ’，引物R: H280R為5 ’-CATAAGTCGAATCACGGCTGATCGTAAAGAG-3 ’，并以質粒pET_32a_lev為模板，根據(jù)Dpn I法定點突變的反應原理，構建果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R，設定PCR程序； PCR擴增反應體系為:1yL Primer STAR Max，IyL引物F:H280R，IyL引物R:H280R，2yL模板pET-32a-lev，反應總體積為20yL ； PCR擴增條件為:94°C預變性3min，94°C變性30s ； 54 °C褪火30s ； 72°C延伸3min45s;共進行30個循環(huán)反應;然后于72°C繼續(xù)延伸1min; PCR產(chǎn)物驗證、回收后，經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切消化，克隆到PGEX-4T-1質粒，轉入E.coli BL21(DE3)； (2)果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R的表達與純化 將步驟(I)中構建好的含有的果糖基蔗糖轉移酶突變體H280R的野生型和突變型重組菌株的菌液，分別轉接到含有一定濃度氨芐青霉素的200ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3?4h，當0D_達到0.6?0.8時，加入終濃度為0.2?0.5mmol/L的誘導劑IPTG，在28°C的溫度下誘導培育4h左右，并在12000rpm的轉速下離心5min收集菌體，利用向沉淀中加入細胞裂解緩沖液，并在冰上超聲破碎2min至菌液澄清，再將離心管放入轉速為12000rpm、溫度為4°C的離心機中，離心1min，取上清移至另一干凈離心管； 重組菌株經(jīng)誘導劑IPTG培養(yǎng)過夜后收集濕菌體，破碎收集含有果糖基蔗糖轉移酶的粗酶液，然后將粗酶液加載到含目His標簽的純化柱中，通過含有20mmol/L的TO、500mmol/L的NaCl 和 20mmol/L 的咪唑緩沖液 I 和含有 20mmol/L 的 PB、500mmol/L 的 NaCl 和 500mmol/L 的咪唑緩沖液11，緩沖液I和緩沖液11的酸堿度PH為7.4，進行梯度洗脫，層析結束后對洗脫的收集液，進行SDS-PAGE驗證； (3)酶法合成制備Levan型果聚糖 將步驟(2)中純化的果糖基蔗糖轉移酶與25?40%濃度的蔗糖反應，添加pH為6.0的檸檬酸緩沖液，保持反應的溫度為40?50°C，反應時間為48h，利用sevag法去除蛋白，加入三倍體積于果糖基蔗糖轉移酶反應液的酒精，在4°C低溫條件下使多糖沉淀并收集沉淀，再利用濃度為60?80%的乙醇溶液洗滌兩次后，將沉淀再用三級水溶解收集，經(jīng)凍干機冷凍獲得粉末狀的Levan型果聚糖。2.根據(jù)權利要求1所述的一種高均一度大分子量Levan型果聚糖的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中的氨芐青霉素的濃度為30?60yg/mL。3.根據(jù)權利要求1所述的一種高均一度大分子量Levan型果聚糖的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中冰上超聲破碎的超聲波需求功率為120W，且超聲破碎為每隔2s時間超聲破碎I S。
【文檔編號】C12N15/70GK105907815SQ201610357450
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】徐輝, 曹毅, 喬代蓉, 曹瑜, 尚慧毅
【申請人】四川大學