一種同時檢測單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌和金黃色葡萄球菌的試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種可同時檢測單核細胞增多性李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌的一管多重擴增內(nèi)標PCR試劑盒，該試劑盒包含：PCR反應預混液及對照品；檢測方法是：首先采集樣品，進行增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)后提取DNA，制備PCR反應管，置于PCR儀上進行PCR擴增，得PCR擴增產(chǎn)物進行檢測結(jié)果判定。優(yōu)點是：該試劑盒一次反應可以同時快速檢測上述四種細菌。與現(xiàn)有的檢測方法相比，該方法使用方便、可靠性好、檢測周期短、靈敏度高、特異性強、成本低廉、操作步驟簡單，適用于高通量操作、標準化操作，而且可以指示因樣品處理過程中存在聚合酶抑制因子及操作失誤導致的假陰性結(jié)果，防止結(jié)果誤判，有助于提高食品安全檢測的水平及食源性疾病的預防和控制。
【專利說明】
一種同時檢測單増李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌和金黃色葡萄球菌的試劑盒
技術(shù)領域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其涉及一種可同時檢測包括單核細胞增多性李斯特菌(以下簡稱“單增李斯特菌”)、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌4種食源性致病菌的含擴增內(nèi)標的多重體系的試劑盒，可以在一個反應管中同時對單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌的樣品進行鑒別檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]食源性疾病(foodborne disease)涵蓋范圍非常廣泛，在全世界范圍無論發(fā)達國家還是發(fā)展中國家都是嚴重的公共衛(wèi)生問題。監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，2011年，中國每6.5人中就有一人曾經(jīng)發(fā)生過食源性疾病。食源性疾病的全球發(fā)病率難以估計，但據(jù)報告，僅2005年就有180萬人死于腹瀉病。這些病例的大部分可歸因于食品和飲用水污染，而食源性致病菌是是主要的根源。
[0003]2012年9月25日，衛(wèi)生部公布了《食品中致病菌限量》征求意見稿，提出了沙門氏菌、大腸桿菌等主要致病菌在多類食品中的限量要求，同時宣布該標準將在正式發(fā)布后6個月施行。單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌是幾種最常見的食源性致病菌，它們能夠直接或間接污染食品及水源，人經(jīng)口感染可導致腸道傳染病的發(fā)生及食物中毒以及畜禽傳染病的流行。目前，對這幾種常見的食源性致病菌的常用方法主要有傳統(tǒng)生物學方法、膠體金試紙條檢測、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等。傳統(tǒng)生物學方法耗時比較長、檢測步驟比較復雜，膠體金試紙條檢測價格比較昂貴、檢測靈敏度偏低，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)價格昂貴、操作需要一定技術(shù)，因此需要建立一種操作簡單、快速、敏感、特異的檢測方法，特別是對大量樣品的高通量、快速、同時檢測。多重PCR方法是一種操作簡單、敏感性高、特異性強的分子生物學檢測方法，除具有普通PCR的優(yōu)點之外，還可以在一個反應體系中同時擴增兩份或者多份DNA樣本的不同目的基因片段，特別適合用于食源性致病菌多重體系的快速診斷。本發(fā)明在多重PCR方法的基礎上又增加了一對擴增內(nèi)標引物，可以有效排除因為樣品處理過程中存在對DNA聚合酶活性具有抑制作用的物質(zhì)或操作失誤等原因而導致的結(jié)果呈現(xiàn)假陰性，可以提高檢測結(jié)果的準確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種可同時檢測單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌4種食源性致病菌的含擴增內(nèi)標的多重體系的試劑盒，其優(yōu)點是操作簡單、敏感性高、特異性強，適合高通量的快速檢測，能夠避免因為樣品處理過程中存在DNA聚合酶的抑制因子得到假陰性結(jié)果而導致的誤判。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
一種同時檢測單核細胞增多性李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特殊之處在于: 該試劑盒包含:無菌去離子水、PCR反應預混液、對照品和DNA染料；
所述PCR反應預混液含有PCR反應緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、Taq DNA聚合酶，檢測用引物；
所述PCR反應緩沖液中含Mg2+的濃度為0.8 mM，脫氧核糖核苷三磷酸的濃度為0.12mM，Taq DNA聚合酶的濃度為0.03 U/μΙ；
所述檢測用引物為如下10條引物的混合物，其序列和產(chǎn)物片段長度分別為:
擴增內(nèi)標 27F序列:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R序列:TACGGYTACCTTTGTTACGACTT，擴增產(chǎn)物片段長度約1500 bp(見序列表11、12、13、14和15);
單增李斯特菌 inlAF 序列:ATGCTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAG , inlAR 序列:TCGCTATCGCCAGTTGTAGGGAGTG，擴增產(chǎn)物片段長度為826 bp(見序列表16)；
蠟樣芽孢桿菌hb I AF序列:AAGAATCCTGATGTGAATTTTGAGG，hb I AR序列:CCCTTGCTACTCCGACTATAATACC，擴增產(chǎn)物片段長度為544 bp(見序列表17)；
阪崎克羅諾桿菌grxBF序列:AGCGGGAAGAGGATGAAATCGGTGG，grxBR序列:GGATATTGTGCGTTACGTGGATGGG，擴增產(chǎn)物片段長度為333 bp(見序列表18)；
金黃色葡萄球菌nucF序列GCGATTGATGGTGATACGGTT，nucR序列:AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC，擴增產(chǎn)物片段長度為279 bp(見序列表19)；
所述對照品分為陰性對照品和陽性對照品，陰性對照品模板為無菌去離子水，陽性對照品模板為各對引物相應的擴增產(chǎn)物連接至T載體后獲得的質(zhì)?；蚪M混合物。
[0006]本發(fā)明的具體使用方法是:
(1)樣品采集:無菌采集可疑乳及乳制品樣品；
(2)增菌培養(yǎng):將采集的可疑乳及乳制品樣品混合均勻后無菌取樣，液體乳及乳制品直接量取，固體奶制品放入無菌研缽、組織研磨器或均質(zhì)袋內(nèi)均質(zhì)2?5 min，加入預熱至45°C的無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37± I °(:振蕩培養(yǎng)6?8 h，得到增菌液；
(3)DNA提取:取培養(yǎng)后的增菌液，振蕩混勻，取Iml于離心管中1000?1500 r/mim離心I?2 min，除去較大塊的碎片，取上清8000?12000 r/mim離心I?2 min，傾去上清液，倒置于吸水紙上不同的位置，吸干殘留液體，再用無菌去離子水重懸、洗滌沉淀，8000?12000r/mim離心I?2 min，棄上清，用少量無菌去離子水重懸沉淀，沸水浴5?10 min，冰浴5?10min，1000?5000 r/mim離心5?10 min，上清液即為樣品模板DNA，調(diào)整濃度至約為10?30ng/μ I備用，或-20 °C保存；
(4)PCR反應管制備:所有操作均需在冰上進行;先將PCR反應預混液置于冰上融化，吸取50 μ?置于PCR反應管中，再加入I μ?樣品模板DNA，用手指輕彈制備好的PCR反應管或用微量移液器吹打混勻，瞬時高速離心2 s ；按照陰性對照品、實際檢測樣品、陽性對照品的順序分別制備PCR反應管；
(5)擴增檢測:將制備的陰性對照品、樣品模板DNA和陽性對照品的PCR反應管置于PCR儀上，進行PCR擴增，反應程序為:95°C預變性5 min;95°C變性40 s，56.7°C退火40 s，72°C延伸70 S，進行35個循環(huán);72°C延伸10 min,4 °C保存;擴增得到PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，判定檢測結(jié)果；
(6)檢測結(jié)果判定:將Ig瓊脂糖溶于100 ml的0.5XTBE電泳緩沖液中，然后加入5 μ?DNA染料，混勻煮沸，傾倒凝膠板;凝膠冷卻凝固后，用微量移液器吸取PCR產(chǎn)物5 μ?加入凝膠孔中進行電泳;電泳結(jié)束后取出凝膠置于紫外燈下觀察、拍照，判定結(jié)果:(a)陽性對照的凝膠孔有5條電泳條帶而陰性對照的凝膠孔無任何條帶，則PCR反應檢測成功；(b)若陰性對照有條帶，說明PCR反應管制備過程中有交叉污染，結(jié)果不可靠，建議重新進行PCR檢測；(c)陽性對照有5條帶，陰性對照沒有條帶，被檢樣品的凝膠孔只出現(xiàn)I條約1500 bp的電泳條帶與陽性對照的凝膠孔相應位置的條帶大小一致，則結(jié)果判斷為陰性;(d)被檢樣品的凝膠孔出現(xiàn)兩條以上電泳條帶，且與陽性對照的凝膠孔中相應位置的條帶大小一致，而陰性對照無條帶，則判定為與相應條帶大小對應的目的細菌呈陽性;單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌和金黃色葡萄球菌4種細菌相對應的特異性條帶大小分別為826 bp,544bp,333 bp和279 bp; (e)陽性對照的凝膠孔有5條電泳條帶，陰性對照的凝膠孔無任何條帶，而被檢樣品的凝膠孔在1500 bp位置沒有電泳條帶，說明樣品處理過程中存在酶抑制劑，建議換其他方法進行樣品處理；(f)陽性對照沒有條帶，說明試劑盒失效，本次檢測結(jié)果無效。
[0007]本發(fā)明的有益效果:檢測用引物均是根據(jù)該細菌的特異性基因或特異片段而設計的特征性引物，組裝成試劑盒后可以用于食品中目的細菌的快速檢測、流行病學調(diào)查、藥物療效監(jiān)測等方面。與現(xiàn)有的檢測方法相比，該方法使用方便、可靠性好、檢測周期短、靈敏度高、特異性強、成本低廉、操作步驟簡單，適用于高通量操作、標準化操作，而且可以檢測因為樣品處理過程中存在DNA聚合酶的抑制因子得到假陰性結(jié)果而導致的誤判，對提高食品安全檢測水平具有重要意義。
【附圖說明】
[0008]圖1:檢測成功的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果。陰性對照無條帶，而陽性對照在約1500bp、826 bp、544 bp、333 bp和279 bp處分別有5條電泳條帶，說明檢測成功。檢樣I只在約1500 bp處有I條擴增內(nèi)標條帶，與陽性對照相應位置條帶大小一致，在其他位置無條帶，說明檢樣I中單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌4種細菌均為陰性;第2泳道在1500 bp和826 bp處有2個條帶與陽性對照位置一致，說明檢樣I單增李斯特菌呈陽性;第3泳道在1500 bp和544 bp處有2個條帶與陽性對照位置一致，說明檢樣3蠟樣芽孢桿菌呈陽性;第4泳道在1500 bp和333 bp處有2個條帶與陽性對照位置一致，說明檢樣4阪崎克羅諾桿菌呈陽性;第5在1500 bp和279 bp處有2個條帶與陽性對照位置一致，說明檢樣5金黃色葡萄球菌呈陽性。
[0009]圖2:檢測過程中發(fā)生交叉污染而導致檢測失敗的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果。陰性對照有電泳條帶出現(xiàn)，說明樣品處理過程中被交叉污染，檢測結(jié)果不可信，需要重新進行檢測。
[0010]圖3:樣品處理過程中存在抑制DNA聚合酶活性的物質(zhì)或操作失誤而導致檢測失敗的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果。陰對照無條帶，陽性對照有5條電泳條帶，而檢樣I在約1500 bp處無擴增內(nèi)標條帶，說明樣品處理過程中存在抑軸)NA聚合酶活性的物質(zhì)或操作失誤，檢測結(jié)果不可信，需要重新進行處理后檢測。
[0011]圖4:對應實施例1的部分實際樣品檢測結(jié)果。
[0012]圖1到圖4中，M: 250 bp DNA分子量標準；陽:陽性對照；陰:陰性對照；1-13:對應實施例I的部分實際樣品(圖中的編號是按順序排列，不同圖中的同一個數(shù)字編號可能并非同一份樣品)。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1
(a)樣品采集:根據(jù)符合規(guī)定的標準及采樣方法，從不同的農(nóng)貿(mào)市場、超市等無菌采集蔬菜、水產(chǎn)品、肉及肉制品、乳及乳制品、蛋類及蛋制品等各種食品樣品；
(b)樣品的增菌培養(yǎng):將無菌采集的樣品無菌取樣25g，放入無菌研缽或者組織研磨器內(nèi)勾楽，或置于無菌均質(zhì)袋內(nèi)均質(zhì)2 min，加入225 ml無菌的含1%氯化鈉的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基于37°C條件培養(yǎng)8-12 h，得到增菌液；
(c)DNA提取:取培養(yǎng)后的增菌液，振蕩混勾后，取Iml于離心管中1000 r/mim離心Imin，除去較大塊的碎片，取上清10000 r/mim離心2 min，傾去上清液，倒置于吸水紙上不同的位置，吸干殘留液體，再用無菌去離子水重懸、洗滌沉淀，10000 r/mim離心2 min，棄上清，用少量無菌去離子水重懸沉淀，再采用商品化的試劑盒提取DNA或者采取反復凍融法提取DNA，即直接沸水浴，冰浴，離心，取上清液，得樣品模板DNA，用無菌蒸餾水調(diào)整至濃度約為10 ng/μ?，直接進行PCR擴增或于-20°C冷凍保存?zhèn)溆茫?br> (d)PCR反應管制備:所有操作均需在冰上進行;先將PCR反應預混液置于冰上融化，吸取50 μ?置于無菌PCR反應管中，再加入I μ?樣品模板DNA，用手指輕彈制備好的PCR反應管或用微量移液器吹打混勻，瞬時高速離心2 s ；按照陰性對照品、實際檢測樣品、陽性對照品的順序分別制備PCR反應管；
(e)擴增檢測:將制備的陰性對照品、樣品模板DNA和陽性對照品的PCR反應管置于PCR儀上，進行PCR擴增，得PCR擴增產(chǎn)物;反應程序為:95 °C預變性5 min ； 95 °C變性40 s，56.7 °C退火40 s，72°C延伸70 S，進行35個循環(huán);72°C延伸10 min,4 °C保存;
(f)檢測結(jié)果判定:將Ig瓊脂糖溶于100 ml的0.5 X TBE電泳緩沖液中，然后加入5 μ?DNA染料，混勻煮沸，傾倒凝膠板;凝膠冷卻凝固后，用微量移液器吸取PCR產(chǎn)物5 μ?加入凝膠孔中進行電泳;電泳結(jié)束后取出凝膠置于紫外燈下觀察、拍照，判定結(jié)果:(a)陽性對照的凝膠孔有5條電泳條帶而陰性對照的凝膠孔無任何條帶，則PCR反應檢測成功；(b)若陰性對照有條帶，說明PCR反應管制備過程中有交叉污染，結(jié)果不可靠，建議重新進行PCR檢測；(c)陽性對照有5條帶，陰性對照沒有條帶，被檢樣品的凝膠孔只出現(xiàn)I條約1500 bp的電泳條帶與陽性對照的凝膠孔相應位置的條帶大小一致，則結(jié)果判斷為陰性;(d)被檢樣品的凝膠孔出現(xiàn)2條或2條以上電泳條帶，且與陽性對照的凝膠孔中相應位置的條帶大小一致，而陰性對照無條帶，則判定為與相應條帶大小對應的目的細菌呈陽性;單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌和金黃色葡萄球菌4種細菌相對應的特異性條帶大小分別為826 bp、544 bp、333 bp和279 bp; (e)陽性對照的凝膠孔有5條電泳條帶，陰性對照的凝膠孔無任何條帶，而被檢樣品的凝膠孔在1500 bp位置沒有電泳條帶，說明樣品處理過程中存在酶抑制劑，建議換其他方法進行樣品處理；(f)陽性對照沒有條帶，說明試劑盒失效，本次檢測結(jié)果無效。
【主權(quán)項】
1.一種同時檢測單核細胞增多性李斯特菌(以下簡稱“單增李斯特菌”)、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是:該試劑盒包含:無菌去離子水、PCR反應預混液、對照品和DNA染料;所述PCR反應預混液含有PCR反應緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、Taq DNA聚合酶，檢測用引物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是:所述PCR反應緩沖液中含Mg2+的濃度為0.8 mM;所述脫氧核糖核苷三磷酸的濃度為0.12 mM;所述Taq DNA聚合酶的濃度為1.5 U/反應管。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是:所述檢測用引物為如下10條引物的混合物，其序列分別為: 擴增內(nèi)標27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R TACGGYTACCTTTGTTACGACTT ； 單增李斯特菌 inlAF: ATGCTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAG，inlAR: TCGCTATCGCCAGTTGTAGGGAGTG ； 蠟樣芽孢桿菌 hb IAF: AAGAATCCTGATGTGAATTTTGAGG，hblAR: CCCTTGCTACTCCGACTATAATACC； 阪崎克羅諾桿菌 grxBF: AGCGGGAAGAGGATGAAATCGGTGG，grxBR: GGATATTGTGCGTTACGTGGATGGG ； 金黃色葡萄球菌 nucF: GCGATTGATGGTGATACGGTT，nucR: AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種同時檢測單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是:所述檢測用引物的濃度分別為: 擴增內(nèi)標引物27?和14921?均為0.1 μΜ，單增李斯特菌特征引物inlAF和inlAR均為0.16μΜ，蠟樣芽孢桿菌特征引物hblAF和hblAR均為0.16 μΜ，阪崎克羅諾桿菌特征引物grxBF和grxBR均為0.04 4]\1，金黃色葡萄球菌特征引物]1110?和111101?均為0.04 μΜ。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是:所述對照品分為陰性對照品和陽性對照品，陰性對照品模板為無菌去離子水，陽性對照品模板為各對引物相應的擴增產(chǎn)物連接至T載體后獲得的質(zhì)?；蚪M混合物。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是: 具體操作步驟為: (1)樣品采集:無菌采集可疑乳及乳制品樣品； (2)增菌培養(yǎng):將采集的可疑乳及乳制品樣品混合均勻后無菌取樣，液體乳及乳制品直接量取，固體奶制品放入無菌研缽、組織研磨器或均質(zhì)袋內(nèi)均質(zhì)2?5 min，加入預熱至45°C的無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37± I °(:振蕩培養(yǎng)6?8 h，得到增菌液； (3)DNA提取:取培養(yǎng)后的增菌液，振蕩混勻，取Iml于離心管中1000?1500 r/mim離心I?2 min，除去較大塊的碎片，取上清8000?12000 r/mim離心I?2 min，傾去上清液，倒置于吸水紙上不同的位置，吸干殘留液體，再用無菌去離子水重懸、洗滌沉淀，8000?12000r/mim離心I?2 min，棄上清，用少量無菌去離子水重懸沉淀，沸水浴5?10 min，冰浴5?10min，1000?5000 r/mim離心5?10 min，上清液即為樣品模板DNA，調(diào)整濃度至約為10?30ng/μ I備用，或-20 °C保存； (4)PCR反應管制備:所有操作均需在冰上進行；先將PCR反應預混液置于冰上融化，吸取50 μ?置于PCR反應管中，再加入I μ?樣品模板DNA，用手指輕彈制備好的PCR反應管或用微量移液器吹打混勻，瞬時高速離心2 s ；按照陰性對照品、實際檢測樣品、陽性對照品的順序分別制備PCR反應管； (5)擴增檢測:將制備的陰性對照品、樣品模板DNA和陽性對照品的PCR反應管置于PCR儀上，進行PCR擴增，反應程序為:95°C預變性5 min;95°C變性40 s，56.7°C退火40 s，72°C延伸70 S，進行35個循環(huán);72°C延伸10 min,4 °C保存;擴增得到PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，判定檢測結(jié)果； (6)檢測結(jié)果判定:將Ig瓊脂糖溶于100 ml的0.5XTBE電泳緩沖液中，然后加入5 μ?DNA染料，混勻煮沸，傾倒凝膠板;凝膠冷卻凝固后，用微量移液器吸取PCR產(chǎn)物5 μ?加入凝膠孔中進行電泳;電泳結(jié)束后取出凝膠置于紫外燈下觀察、拍照，判定結(jié)果:(a)陽性對照的凝膠孔有5條電泳條帶而陰性對照的凝膠孔無任何條帶，則PCR反應檢測成功；(b)若陰性對照有條帶，說明PCR反應管制備過程中有交叉污染，結(jié)果不可靠，建議重新進行PCR檢測；(c)陽性對照有5條帶，陰性對照沒有條帶，被檢樣品的凝膠孔只出現(xiàn)I條約1500 bp的電泳條帶與陽性對照的凝膠孔相應位置的條帶大小一致，則結(jié)果判斷為陰性;(d)被檢樣品的凝膠孔出現(xiàn)2條或2條以上電泳條帶，且與陽性對照的凝膠孔中相應位置的條帶大小一致，而陰性對照無條帶，則判定為與相應條帶大小對應的目的細菌呈陽性;單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌和金黃色葡萄球菌4種細菌相對應的特異性條帶大小分別為826 bp、544 bp,333 bp和279 bp; (e)陽性對照的凝膠孔有5條電泳條帶，陰性對照的凝膠孔無任何條帶，而被檢樣品的凝膠孔在1500 bp位置沒有電泳條帶，說明樣品處理過程中存在酶抑制劑，建議換其他方法進行樣品處理；(f)陽性對照沒有條帶，說明試劑盒失效，本次檢測結(jié)果無效。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種同時檢測單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是:樣品的增菌培養(yǎng)基胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基含有1%氯化鈉。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種同時檢測單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是:擴增檢測時的反應程序為:95°C預變性5 min;95°C變性40 s，56.7°C退火40 s，72°C延伸70 s，進行35個循環(huán)；72°C延伸 10 min,4 °C保存。
【文檔編號】C12Q1/68GK105907853SQ201610272863
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】張德福, 勵建榮, 張明, 方亞琴, 李春, 湯軼偉, 高雪, 徐永霞, 白鳳翎, 付緒磊, 趙禹宗
【申請人】渤海大學