用于鑒定狼山雞種特異性的snp標記及測定snp位點的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于鑒定狼山雞種特異性的SNP標記及測定SNP位點的方法。采用特異性SNP位點進行鑒定。本發(fā)明根據(jù)結(jié)果得到的是與其他雞種相比存在差異的一些SNP位點。根據(jù)這些SNP位點的差異，可以把黑羽狼山雞在不同雞種中鑒別出來。應(yīng)用這種分子標記鑒定雞種，操作相對簡單，特異性高而且重復(fù)性高，為家禽品種資源的正確保存和合理利用增添了新的科學依據(jù)。
【專利說明】
用于鑒定狼山雞種特異性的SNP標記及測定SNP位點的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及動物育種學、分子遺傳學和分子生物學領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 狼山雞(Langshan Chicken)，屬兼用型品種，因產(chǎn)地的游覽勝地--狼山而得名； 1989年被《中國家禽品種志》收錄，2000年被列入國家級畜禽品種資源保護名錄。狼山雞是 我國古老的優(yōu)良地方品種，并在世界家禽品種中負有盛名。原產(chǎn)地為江蘇省南通市如東縣， 現(xiàn)全國各地均有飼養(yǎng)。該雞曾于19世紀后葉輸往英國，繼而又從英國傳入美、德、法、日等 國，載入各國的家禽品種志，并參與當代著名雞種奧品頓、澳洲黑等雞種的育成。狼山雞體 型較大，頭昂尾翹，背部較凹，呈"U"字型。頭部短圓，俗稱蛇頭大眼。羽毛多呈黑色，少數(shù)呈 白色，偶見黃色。喙呈黑褐色，尖端稍淡。單冠，冠齒5個~6個，冠、肉髯、耳葉均為紅色。虹彩 以黃色為主，間有黃褐色。皮膚呈白色。脛呈黑色。 狼山雞屠體潔白美觀、肉質(zhì)鮮美，具有較好的產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)，在我國為數(shù)不多的黑 羽地方雞種中具有明顯特色，是培育黑色雞種的良好素材。狼山雞作為一種優(yōu)良雞種，不管 是為其保種，還是建立家系和品系工作，都要對雞種進行明確鑒定和分類。
[0003] 長期以來，主要是以常規(guī)形態(tài)學標記分析手段進行動物品種分類和真?zhèn)舞b定。形 態(tài)學標記分析簡便、經(jīng)濟，但由于形態(tài)學特征常常受環(huán)境因素的影響，具有表型可塑性和遺 傳可變性，容易導(dǎo)致不正確的分類與鑒定;并且形態(tài)學方法無法鑒定許多群體中普遍存在 的隱存分類單元，應(yīng)用分子生物學技術(shù)將有利于品種鑒定。形態(tài)學鑒定的局限性和不斷縮 減的分類學家隊伍，使分類學的發(fā)展面臨巨大的挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明本專利利用簡化基因組測序手段對不同雞種進行測序，通過對不同雞種間 的DNA序列進行篩查比對，找到含特異性SNP位點的雞種序列，并對這段序列設(shè)計引物進行 PCR擴增和重測序驗證，以期通過分子生物學技術(shù)手段，找到一種分子標記，可以對不同雞 種進行更精確的分類。
[0005] 為此本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種狼山雞種的鑒定方法，采用特異性SNP位點進 行鑒定。
[0006]所述SNP位點包括以下位點：
應(yīng)用時采用其中的一個位點或者幾個位點進行狼山雞種的鑒定。
[0007] -種測定SNP位點的方法，按照以下步驟進行： 1) 提取若干不同雞種的DNA，進行簡化基因組測序，選取Gallus_gallus. WASHUC2.70 作為參考基因組； 2) SNP位點檢測:獲得每份種質(zhì)資源平均原始reads，通過與參考基因組比對，過濾低深 度和低完整度，獲得位于ddRAD標簽上的SNP; 3) 特異性SNP位點篩選:利用perl script程序?qū)@些SNP位點進行比對，找到特異性存 在于狼山雞中的SNP位點，并對這些SNP位點進行質(zhì)控，最終篩選得到滿足這些條件的特異 性SNP位點。
[0008] 3)步驟后進行引物設(shè)計和PCR擴增和檢測； 所述PCR擴增和檢測:PCR擴增總體積為20仙:1 uL DNA模板，其濃度為100 ngAiL，2 μ L 10XPCR Buffer，1.5 yL dNTP，濃度為 10 m mol/L，上下游引物各 1 yL，濃度為 10 ρ mol/yL，Taq酶為0.2 yL，濃度為5 U/yL，ddH20 13.3 yL;PCR 擴增程序：95 °C預(yù)變性5 min，94 °C變性40 s，適宜退火溫度40 s，72 °C延伸40 s，35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min， 4 °C保存?zhèn)溆?把PCR產(chǎn)物進行測序驗證。
[0009] 所述引物設(shè)計： 對篩選得到的特異性SNP位點在參考基因組中進行染色體定位，獲得包含這些SNPs位 點的一段序列。利用不同雞種DNA作為模板，使用Oligo等軟件設(shè)計引物進行PCR擴增，引物 序列為：
[0010]所述3)步驟中，質(zhì)控要求保證所有SNP最小檢出率大于85%且保證發(fā)生突變的等位 基因頻率為100%。
[0011] 所述1)步驟中，雞種包括黑羽狼山雞、藏雞、河南斗雞、絲羽烏骨雞、文昌雞、清遠 麻雞、安義瓦灰雞、邊雞、壽光雞、汶上蘆花雞、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、崇仁麻雞、金湖烏鳳雞、瓢雞、 大圍山微型雞、惠陽胡須雞、茶花雞、仙居雞、固始雞、白耳黃雞、大骨雞、北京油雞、蕭山雞、 鹿苑雞、隱性白羽雞、淮南麻黃雞、瑯琊雞、麻城綠殼蛋雞、如皋黃雞。
[0012] 所述1)步驟中：對每個雞品種采集30個樣本，其中公雞10只，母雞20只；翅靜脈采 血0.4 ml，加入0. 5 m ol/L Na2 EDTA抗凝劑2 uL，加入裂解液4 ml后于4°C保存?zhèn)溆茫?利用苯酚抽提法提取DNA，進行簡化基因組測序，選取Gal lus_gal lus. WASHUC2.70作為參 考基因組。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點是:本發(fā)明根據(jù)結(jié)果得到的是與其他雞種相比存在差異的一些SNP 位點。根據(jù)這些SNP位點的差異，可以把黑羽狼山雞在不同雞種中鑒別出來。應(yīng)用這種分子 標記鑒定雞種，操作相對簡單，特異性高而且重復(fù)性高，為家禽品種資源的正確保存和合理 利用增添了新的科學依據(jù)。
【具體實施方式】
[0014] 材料與方法： 實驗材料： 選取藏雞、河南斗雞、絲羽烏骨雞、文昌雞、清遠麻雞、安義瓦灰雞、邊雞、壽光雞、汶上 蘆花雞、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、崇仁麻雞、金湖烏鳳雞、瓢雞、大圍山微型雞、惠陽胡須雞、茶花雞、 仙居雞、固始雞、狼山雞、白耳黃雞、大骨雞、北京油雞、蕭山雞、鹿苑雞、隱性白羽雞、淮南麻 黃雞、瑯琊雞、麻城綠殼蛋雞、如皋黃雞29種不同地方雞種，這些雞種均來自中國農(nóng)業(yè)科學 研究院家禽科學研究所國家地方禽種資源基因庫。其中每個雞種采集30個樣品。
[0015] 簡化基因組測序： 對每個雞品種采集30個樣本，其中公雞10只，母雞20只。翅靜脈采血0.4 ml，加入0. 5 m ol/L Na2 EDTA抗凝劑2 uL，加入裂解液4 ml后于4°C保存?zhèn)溆?；利用苯酚抽提法提?DNA，進行簡化基因組測序，選取Gallus_gallus. WASHUC2 · 70作為參考基因組。
[0016] SNP位點檢測： 對870份雞進行簡化基因組技術(shù)測序，獲得每份種質(zhì)資源平均原始reads，通過與參考 基因組比對，過濾低深度和低完整度，獲得ddRAD標簽。在與參考基因組比對的基礎(chǔ)上，過濾 低完整度和低深度，可以檢測到位于ddRAD標簽上的SNP。
[0017] 特異性SNP位點篩選： 得到了存在于不同雞種上的SNP位點，利用perl script程序?qū)@些SNP位點進行比對， 找到特異性存在于狼山雞中的SNP位點，并對這些SNP位點進行質(zhì)控(保證SNP檢出率100%且 保證發(fā)生突變的等位基因頻率為100%)，最終篩選得到滿足這些條件的特異性SNP位點。 [0018]引物設(shè)計： 對篩選得到的特異性SNP位點在參考基因組中進行染色體定位，獲得包含這些SNPs位 點的一段序列。利用不同雞種DNA作為模板，使用Oligo等軟件設(shè)計引物進行PCR擴增，引物 序列為：
PCR擴增和檢測： PCR擴增總體積為20 yL:l yL DNA模板，其濃度為 100 ng/yL，2 yL 10XPCR Buffer， 1.5 yL dNTP，濃度為10 m mol/L，上下游引物各1 yL，濃度為10 p mol/yUTaq酶為0.2 μ L，濃度為5 UAiL，ddH20 13.3 uMPCR擴增程序:95 °C預(yù)變性5 min，94 °C變性40 s，適宜 退火溫度40 s，72 °C延伸40 s，35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min，4 °C保存?zhèn)溆?把PCR產(chǎn)物 送入上海生工生物工程股份有限公司進行測序驗證。
[0019]結(jié)果： 通過簡化基因組測序，發(fā)現(xiàn)了狼山雞特異性SNP位點較為豐富且與其他雞種相比存在 差異的一段序列，設(shè)計引物PCR擴增并進行重測序驗證。發(fā)現(xiàn)黑羽狼山雞與其他雞種在這段 序列上存在特異性差異，差異在于在這段序列上黑羽狼山雞存在特異性的12個SNP位點，其 他雞種在此區(qū)域無這些SNP位點。因此，這些SNP位點可以作為一種鑒定狼山雞特異性的分 子標記。應(yīng)用這種分子標記鑒定雞種，操作相對簡單，特異性高而且重復(fù)性高，也為家禽品 種資源的正確保存和合理利用增添了新的科學依據(jù)。
【主權(quán)項】
1. 一種狼山雞種的鑒定方法，其特征在于，采用特異性SNP位點進行鑒定。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種狼山雞種的鑒定方法，其特征在于，所述SNP位點包括W 下位點：應(yīng)用時采用其中的一個位點或者幾個位點進行狼山雞種的鑒定。3. -種測定如權(quán)利要求2所述的SNP位點的方法，其特征在于，按照W下步驟進行： 1) 提取若干不同雞種的DNA，進行簡化基因組測序，選取Gal lus_gal Ius. WAS冊C2.70 作為參考基因組； 2. SNP位點檢測：獲得每份種質(zhì)資源平均原始reads,通過與參考基因組比對，過濾低深 度和低完整度，獲得位于ddRAD標簽上的SNP; 3) 特異性SNP位點篩選:利用perl script程序?qū)\些SNP位點進行比對，找到特異性存 在于狼山雞中的SNP位點，并對運些SNP位點進行質(zhì)控，最終篩選得到滿足運些條件的特異 性SNP位點。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的測定SNP位點的方法，其特征在于，3)步驟后進行引物設(shè)計和 PCR擴增和檢測； 所述PCR擴增和檢測:PCR擴增總體積為20 yL:l yL DNA模板，其濃度為100 ng/yL，2 y L IOXPCR Buffer，1.5 yL dNTP，濃度為10 m mol/L，上下游引物各1化，濃度為10 P mol/yL，Taq酶為0.2化，濃度為5 U/yL，ddH20 13.3化;PCR擴增程序：95 °C預(yù)變性5 min，94 °C變性40 S，適宜退火溫度40 s，72 °C延伸40 s，35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min， 4 °C保存?zhèn)溆?把PCR產(chǎn)物進行測序驗證。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的測定SNP位點的方法，其特征在于，所述引物設(shè)計： 對篩選得到的特異性SNP位點在參考基因組中進行染色體定位，獲得包含運些SNPs位 點的一段序列； 壬||田末同7應(yīng)壬由。~14化擊照? /(擊田…1-。。竺：恤化巧'^+曰1物1*；世分；口(-口壬廣+齒引物I良列為.6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的測定SNP位點的方法，其特征在于，所述3)步驟中，質(zhì)控要求保 證SNP檢出率100%且保證發(fā)生突變的等位基因頻率為100%。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的測定SNP位點的方法，其特征在于，所述1)步驟中，雞種包括黑 羽狼山雞、藏雞、河南斗雞、絲羽烏骨雞、文昌雞、清遠麻雞、安義瓦灰雞、邊雞、壽光雞、議上 蘆花雞、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、崇仁麻雞、金湖烏鳳雞、瓢雞、大圍山微型雞、惠陽胡須雞、茶花雞、 仙居雞、固始雞、白耳黃雞、大骨雞、北京油雞、蕭山雞、鹿苑雞、隱性白羽雞、淮南麻黃雞、巧 挪雞、麻城綠殼蛋雞、如皋黃雞。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的測定SNP位點的方法，其特征在于，所述1)步驟中：對每個雞品 種采集30個樣本，其中公雞10只，母雞20只；翅靜脈采血0.4 ml,加入0. 5 m ol/L Na2 EDTA抗凝劑2化，加入裂解液4 ml后于4°C保存?zhèn)溆茫焕帽嚼页樘岱ㄌ崛NA，進行簡化 基因組測序，選取Gallus_galIus. WAS皿C2.70作為參考基因組。
【文檔編號】C12Q1/68GK105907867SQ201610354470
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】韓威, 李國輝, 王洪志, 朱云芬, 張會永, 殷建玫, 盛中偉, 鄒劍敏, 王克華, 蘇軍, 蘇一軍
【申請人】江蘇省家禽科學研究所