Dhx36作為冠心病診斷標志物的用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于冠心病診斷的分子標志物，該分子標志物是DHX36基因及其編碼蛋白。本發(fā)明通過實驗證明正常人和冠心病患者的血液中DHX36基因及其編碼蛋白的表達水平存在顯著差異，因此通過檢測受試者血液中DHX36基因及其編碼蛋白的表達水平即可判斷該受試者是否患有冠心病。本發(fā)明的分子標志物還可以用于判斷冠心病患者的預后，從而為醫(yī)生定制個體化的治療方案提供參考。
【專利說明】
DHX36作為冠心病診斷標志物的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及冠心病診斷、預測預后領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測DHX36異常 為手段的冠心病診斷、預測預后方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著經(jīng)濟和社會的發(fā)展，心血管疾病尤其是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心?。?Coronary Artery Disease;CAD)的發(fā)病率正在逐年上升。對于發(fā)達國家，還有大多數(shù)的發(fā) 展中國家來講，CAD已經(jīng)成為成年人發(fā)病和死亡的主要原因。近年來，對于CAD的流行趨勢以 及越來越嚴峻的不良預后的現(xiàn)狀，各國衛(wèi)生組織均給予了高度的關(guān)注。在中國，由于改革開 放，物質(zhì)生活條件的提高，人均壽命逐漸延長，相應的，心血管疾病尤其是冠心病的發(fā)病率 逐年升高，有人預計，到本世紀的20年代，冠心病有可能會成為威脅人類健康的首位疾病。 近年來對冠心病的診斷方法和治療措施有了重大的突破，尤其是近年來抗血小板藥物、抗 凝藥物、溶栓藥物的更新?lián)Q代，以及經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)措施的日益普及，使大多 數(shù)的冠心病患者的臨床結(jié)局發(fā)生了巨大改善。
[0003] 自從上世紀60年代處Frmainghma的研究結(jié)果被首次公布以來，人們對冠心病的認 識也有了很大的提高，已經(jīng)認識到冠心病不是一種單一的疾病，而是一種多因素疾病，由多 種危險因素共同決定其流行趨勢及發(fā)病特點。當然，在冠心病的發(fā)病機制當中，傳統(tǒng)的危險 因素如吸煙、不良飲食習慣、血壓升高、血糖升高等等起著舉足輕重的作用，近年認為，個體 遺傳背景的差異也是導致冠心病發(fā)生的一種重要機制。因此從基因?qū)用嫔蠈ふ遗c冠心病的 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子標志物，有助于冠心病的預防、診斷和藥物的個性化治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過檢測DHX36基因或蛋白表達差異來診斷冠心 病的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過檢測DHX36基因或蛋白表達差異來預測冠心 病預后的方法。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了檢測DHX36基因或DHX36蛋白的產(chǎn)品在制備冠心病診斷工具中的用 途。
[0008] 本發(fā)明還提供了檢測DHX36基因或DHX36蛋白的產(chǎn)品在制備預測冠心病預后工具 中的用途。
[0009] 進一步，所述檢測DHX36基因或DHX36蛋白的產(chǎn)品包括檢測DHX36基因或DHX36蛋白 的表達水平的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合DHX36基因的核酸或者能夠結(jié)合DHX36蛋白的物 質(zhì)（例如抗體）。所述核酸能夠檢測DHX36基因的表達水平;所述物質(zhì)能夠檢測DHX36蛋白的 表達水平。
[0010]本發(fā)明的檢測DHX36基因的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能： 如PCR、如Southern雜交、Northern雜交、點雜交、焚光原位雜交(FISH)、DNA微陣列、ASO法、 高通量測序平臺等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。
[0011]包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過化學合成來獲得，或通過從生物材料制備含有 期望核酸的基因，然后使用設計用于擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。
[0012]進一步，所述PCR方法為已知方法，例如，ARMS (Ampl if i cat ion Refractory Mutation System，擴增不應突變系統(tǒng))法、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。擴增 的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(SPR法）、PCR-RFLP法、原位RT-PCR 法、PCR-SS0 (序列特異性寡核苷酸）法、PCR-SSP法、AMPFLP (可擴增片段長度多態(tài)性）法、 MVR-PCR法、和PCR-SSCP (單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來檢測。
[0013] 上面所述的核酸包括擴增DHX36基因的引物，產(chǎn)品中包括的引物可以通過通過化 學合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來適當?shù)卦O計，并通過 化學合成來制備。
[0014] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述核酸為QPCR實驗中使用的擴增引物，所述引物 的序列如SEQ ID N0.1 (正向序列）和SEQ ID N0.2(反向序列）所示。
[0015] 上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學合成來制備，通過使用本 領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來恰當設計，并通過化學合成來制備，或者可以通 過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設計用于擴增期望核酸序列的引物擴 增它來制備。
[0016] 本發(fā)明的檢測DHX36蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如， 可以包括ELI SA、放射免疫測定法、免疫組織化學法、Wes tern印跡等。
[0017] 本發(fā)明的檢測DHX36蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合DHX36蛋白的抗體或其片段。可以 使用任何結(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合靶蛋白質(zhì)即可。 本發(fā)明的檢測產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的。抗體片段指保留抗 體對抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽。抗體片段可以包括 F(at/ )2、Fat/、Fab、單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V區(qū)（雙抗 體）、或含有CDR的肽。本發(fā)明的檢測DHX36蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的 氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞。
[0018] 抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個或部分靶 蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免 疫動物后，從經(jīng)過免疫的動物獲得免疫細胞并融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然后從雜交 瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的DHX36蛋白或其部分對獲得的抗體實 施抗原特異性純化來獲得針對DHX36蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w:用與上 文相同的抗原免疫動物，從經(jīng)過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用 上述抗原對血清實施抗原特異性純化。可以通過用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗 體的序列信息來獲得抗體片段。
[0019] 標記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域普遍知道的方法來實施。例如，可 以如下熒光標記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用DMS0、緩沖劑、等準 備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標記可使用商品化的標記試劑盒，諸 如生物素標記試劑盒，如生物素標記試劑盒-NH2、生物素標記試劑盒-SH (DojindoLaboratories);堿性磷酸酶標記試劑盒諸如堿性磷酸酶標記試劑盒-NH2、堿性磷 酸酶標記試劑盒-SH(Dojindo Laboratories);過氧化物酶標記試劑盒諸如過氧化物酶標 記試劑盒-NH2、過氧化物酶標記試劑盒-NH2(Dojindo Laboratories);藻膽蛋白標記試劑 盒諸如藻膽蛋白標記試劑盒-NH2、藻膽蛋白標記試劑盒-SH、B-藻紅蛋白標記試劑盒-NH2， B-藻紅蛋白標記試劑盒-SH、R-藻紅蛋白標記試劑盒-NH2、R-藻紅蛋白標記試劑盒SH (DojindoLaboratories);焚光標記試劑盒諸如焚光素標記試劑盒-NH2、HiLyte Fluor(TM) 555標記試劑盒_NH2、HiLyte Fluor(TM)647標記試劑盒_NH2(Dojindo Laboratories);及 DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗體 標記試劑盒、Qdot(TM)抗體標記試劑盒（Invitrogen Corporation)和EZ-標記物蛋白質(zhì)標 記試劑盒(Funakoshi Corporation)。為了正確標記，可以使用適宜的儀器來檢測經(jīng)過標記 的抗體或其片段。
[0020] 在本發(fā)明中，"預后"是指冠心病患者在通過手術(shù)處理等抑制或緩解冠心病后的過 程或結(jié)果。在本說明書中，預后可以是通過手術(shù)處理抑制或緩解冠心病后1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20年或更久時的生機狀態(tài)。預后可以通過檢查生物標志物即0!?36蛋白或編碼 DHX36蛋白的基因來預測。預后預測可以這樣進行:根據(jù)生物標志物的有或無，或者升高或 降低，確定患者的預后是良好還是不良，或者確定良好預后或不良預后的概率。
[0021] 在本發(fā)明中，"預后良好"是指在通過手術(shù)處理等為患者抑制或緩解冠心病之后， 患者長時期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更長)沒有危急狀況。預后良好最優(yōu)選的狀態(tài) 是長期無疾病的存活。
[0022]在本發(fā)明中，"預后不良"是指患者在通過手術(shù)處理等抑制或緩解冠心病后的短時 期(例如1、2、3、4、5年或更短）內(nèi)發(fā)生致命狀況。
[0023]預測預后是指預測患者狀況的過程或結(jié)果，并不意味著能以100%的準確度預測 患者狀況的過程或結(jié)果。預測預后是指確定某些過程或結(jié)果的可能性是否增加，而并不意 味著通過與某些過程或結(jié)果不發(fā)生的情況比較來確定發(fā)生某些過程或結(jié)果的可能性。如本 發(fā)明而言，本發(fā)明中DHX36基因或DHX36蛋白的水平升高或降低的患者中，與不顯示該特征 的患者相比，更有可能觀察到特定過程或結(jié)果。
[0024] 進一步，所述檢測DHX36基因或DHX36蛋白的產(chǎn)品可以是檢測DHX36基因或DHX36蛋 白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通 量測序平臺。
[0025]利用前面所述的檢測產(chǎn)品檢測受試者樣本中的DHX36基因或DHX36蛋白的表達水 平，與正常人相比，受試者樣本中的DHX36基因或DHX36蛋白的表達水平升高，則診斷該受試 者為冠心病患者或該受試者的預后差。
[0026] 作為依照本發(fā)明的檢測產(chǎn)品的樣本，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品 或流體。樣本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定;例如，它可以包括組織、血液、血漿、 血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材 料。
[0027] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣本來自受試者的血液。
[0028]本發(fā)明還提供了一種診斷冠心病的工具，所述工具能夠檢測受試者樣本中DHX36 基因或DHX36蛋白的表達水平。所述工具包括能夠結(jié)合DHX36基因的核酸或者能夠結(jié)合 DHX36蛋白的物質(zhì)（例如抗體）。所述核酸能夠檢測DHX36基因的表達水平;所述物質(zhì)能夠檢 測DHX36蛋白的表達水平。
[0029] 進一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。
[0030] 進一步，所述診斷冠心病的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序 平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷冠心病的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一 個人的基因表達譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表 達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知DHX36基因的異 常與冠心病相關(guān)也屬于DHX36基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0031] 本發(fā)明還提供了一種預測冠心病預后的工具，所述工具能夠檢測受試者樣本中 DHX36基因或DHX36蛋白的表達水平，所述預測冠心病預后工具包括能夠結(jié)合DHX36基因的 核酸或者能夠結(jié)合DHX36蛋白的物質(zhì)（例如抗體）。所述核酸能夠檢測DHX36基因的mRNA水 平;所述物質(zhì)能夠檢測DHX36蛋白的表達水平。
[0032]進一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。
[0033] 進一步，所述預測冠心病預后的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量 測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷冠心病的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展， 對一個人的基因表達譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基 因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知DHX36基因 的異常與冠心病相關(guān)也屬于DHX36基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0034] 本發(fā)明的檢測產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗DHX36抗體或其片段所識別的氨基酸的 數(shù)目沒有特別限制，只要抗體能夠結(jié)合DHX36即可。當抗體作為治療藥物時，優(yōu)選的是它能 夠識別盡可能多的氨基酸，只要它能抑制DHX36功能?？贵w或其片段識別的氨基酸的數(shù)目是 至少一個，更優(yōu)選至少三個?？贵w的免疫球蛋白類別不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、 IgD或IgY。
[0035] 本發(fā)明的檢測產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗DHX36抗體的其他性質(zhì)同前面所述。
[0036] 進一步，所述受試者樣本可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣 本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定;例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴 液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材料。在本發(fā)明 的具體實施方案中，所述樣本來自受試者的血液。
[0037] 本發(fā)明還提供了一種診斷冠心病或預測冠心病預后的方法，所述方法包括如下步 驟：
[0038] (1)獲取冠心病受試者的樣品；
[0039] (2)檢測受試者樣品中DHX36基因或蛋白的表達水平；
[0040] (3)將測得的DHX36基因或蛋白的表達水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來。
[00411 (4)與對照相比，DHX36基因或蛋白的表達水平升高，則該受試者被診斷為冠心病， 或該受試者被確定為預后不良。
[0042]在本發(fā)明的上下文中，"診斷冠心病"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有冠心病、也 包括判斷受試者是否存在患有冠心病的風險。
[0043]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0044]本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了 一種診斷冠心病的分子標志物，使用該分子標志物可以在冠心病 發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。
[0045]另外，通過預測患者的預后，本發(fā)明能夠提供有意義的信息來為患者決定治療方 案策略。
【附圖說明】
[0046]圖1顯示利用基因芯片檢測DHX36基因在冠心病患者與正常人中的表達情況；
[0047]圖2顯示利用QPCR檢測DHX36基因在冠心病患者與正常人中的表達情況；
[0048] 圖3顯示利用Western blot檢測DHX36蛋白在冠心病患者與正常人中的表達情況。
[0049]具體的實施方式
[0050]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0051 ] 實施例1 DHX36基因的差異表達 [0052] 1、研究對象：
[0053]收集冠心病患者5例，正常人5例。
[0054]冠心病組的納入標準：按照世界衛(wèi)生組織制定的缺血性心臟病的診斷標準，選擇 經(jīng)冠狀動脈造影證實有一支或多支血管狹窄程度多50%的冠心病患者。對照組的入選標準 為：1)在流行病學調(diào)查時篩選年齡、性別、民族均與CAD組相匹配，經(jīng)過問卷調(diào)查、體格檢查、 心臟超聲檢查及心電圖檢查及相關(guān)實驗室檢查沒有冠心病的臨床表現(xiàn)及主要危險因素的 體檢者；2)住院行健康體檢并行冠狀動脈造影檢查排除冠心病并年齡、性別、民族與CAD組 匹配者;符合以上任何一條者入選為對照組。兩組在納入研究前簽署知情同意書。
[0055]剔除標準:CAD組-臨床資料不全者及同時合并以下疾病之一者予以剔除。（如：先 天性心臟病者、主動脈夾層、多臟器功能衰竭、風濕性心臟病以及具有精神障礙不能配合 者）。對照組:有精神障礙者或經(jīng)多普勒檢查證實有頸動脈斑塊或狹窄者，予以剔除。
[0056] 2、血液中總RNA的提取
[0057] (1)勾衆(zhòng)處理（Homogenization)
[0058] 要求研究對象空腹至少12h，于次日清晨7:00~8:00室溫下，抽取10ml靜脈血于乙 二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，加入3倍體積紅細胞裂解液，混勻后室溫放置10分鐘，10，OOOrpm 離心1分鐘。徹底吸棄上清，收集白細胞沉淀。每100-200μ1血液收集的白細胞沉淀加入lml TRIzol〇
[0059] (2)分層（Phase Separation)
[0060] a.樣品加入TRI zo 1后，室溫放置5min，使樣品充分裂解。
[00611 b.每lml TRIzol加入200μ1氯仿，劇烈振蕩混勻后室溫放置3-5min使其自然分相。 [0062] (3)RNA沉淀（RNA Precipitation)
[0063] a. 4°C12,000rpm離心10_15min。樣品會分成三層:黃色的有機相，中間層和無色 的水相，RNA主要在水相中，把水相(通?？晌?50μ1)轉(zhuǎn)移到新管中。
[0064] b ·在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置lOjOminj-C 12，000rpm離心 10min，棄上清，RNA沉淀于管底。
[0065] (4)RNA漂洗（RNA Wash)
[0066] a. RNA沉淀中加入lml 75%乙醇（用RNase-free水配制），溫和振蕩離心管，懸浮 沉淀。每lml TRIzol加入lml 75%乙醇。
[0067] b. 41€5,000-8,000印111離心卜21^11，棄上清;短暫快速離心，用移液器小心吸棄上 清，室溫放置1-2分鐘晾干沉淀。
[0068] (5)溶解RNA(Redissolving the RNA)
[0069] 沉淀中加入50-100μ1 RNase-f ree水，輕彈管壁，以充分溶解RNA，-70 °C保存。
[0070] 3、RNA質(zhì)量和純度檢測
[0071] RNA質(zhì)量:通過RNA完整性來表示，可用普通瓊脂糖凝膠電泳（電泳條件：1.2 %膠； 0.5 X TBE電泳緩沖液;150v，15分鐘)檢測完整性。
[0072] RNA純度：0D260/0D280比值是衡量RNA樣品中蛋白質(zhì)污染程度的指標。高質(zhì)量的 RNA樣品，0D260/0D280值（1 OmM Tri s，pH7 · 5)在2 · 0左右。
[0073] 4、測序:將上述RNA送交上海伯豪生物技術(shù)有限公司采用Solexa測序技術(shù)對樣品 進行測序。
[0074] 5、數(shù)據(jù)分析
[0075] 5.1原始數(shù)據(jù)處理
[0076]測序儀產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，我們稱之為原始序 列數(shù)據(jù)，結(jié)果以FASTQ文件格式存儲。由于原始序列數(shù)據(jù)可能包含低質(zhì)量序列、接頭序列等 雜質(zhì)序列數(shù)據(jù)，不能直接用于生物信息分析，所以原始序列數(shù)據(jù)必需經(jīng)過數(shù)據(jù)處理轉(zhuǎn)換為 高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)，利用Tophat(version:2.0.6)軟件的spliced mapping算法對高質(zhì)量序列 數(shù)據(jù)進行基因組比對，采用基因組版本為SscrofalO.2。
[0077] 5.2差異基因的篩選
[0078] 基因表達量的計算使FPKM法。根據(jù)基因的表達量(FPKM值)計算該基因在不同樣本 間的差異表達倍數(shù)。差異表達基因定義為FDRS0.01且倍數(shù)差異在2倍及以上的基因。
[0079] 6、結(jié)果
[0080] 結(jié)果顯示（如圖1所示），與正常人相比，冠心病患者血液中DHX36基因的mRNA水平 顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈〇. 05)。
[0081 ]實施例2 QPCR實驗驗證冠心病患者和正常人中差異表達的基因 [0082] 1、研究對象：
[0083] 篩選標準同實施例1，冠心病患者和正常人各50例。
[0084] 2、血液中總RNA的提取
[0085] 步驟同實施例1。
[0086] 3、逆轉(zhuǎn)錄
[0087]用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lyg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用25μ1反應體系，每個樣品 取1 yg總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入以下組分：DEPC水，5 X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液， 10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo (1Τ，20〇υ/μ1 M-MLV，模板尺祖。42。(：孵育 lh，72°C10min，短暫離心。
[0088] 4、QPCR
[0089] (1)引物設計
[0090] 根據(jù)Genbank中DHX36基因和GAroH基因的編碼序列設計QPCR擴增引物，由上海生 工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。具體引物序列如下：
[0091] DHX36 基因：
[0092] 正向引物為5'-GGCTTATCTATCACCTAA-3'（SEQ ID N0.3);
[0093] 反向引物為5'-AATACAATCCACTCATCT-3'（SEQ ID N0.4),
[0094] GATOH 基因：
[0095] 正向引物為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'（SEQ ID N0.5);
[0096] 反向引物為5'-CATGGGTGGAATCATATTGGAA-3'（SEQ ID N0.6)。
[0097] (2)按照表1配制PCR反應體系：
[0098] 其中，SYBR Green聚合酶鏈式反應體系購自Invitrogen公司。
[0099] 表1 PCR反應體系
[0100]
[0101] (3汗0?反應條件：95°(：1〇11^11，（95°(：158,6〇1€4〇8)*45個循環(huán)。以5￥81?6代611作為 熒光標記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和電泳確 定目的條帶，△△ CT法進行相對定量。
[0102] 5、統(tǒng)計學方法
[0103]結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標準差的方式來表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng) 計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0.05時具有統(tǒng)計學意義。
[0104] 6、結(jié)果
[0105] 結(jié)果如圖2所示，與正常人相比，冠心病患者血液中DHX36基因的mRNA水平顯著增 加，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈〇.05)，結(jié)果同基因芯片實驗。
[0106] 實施例3 DHX36蛋白差異表達檢測 [0107] 1、研究對象
[0108] 同實施例2。
[0109] 2、單核細胞分離
[0110]無菌采集靜脈血l〇ml，注入盛肝素的無菌小瓶中，加蓋后立即輕輕搖勻。用無菌吸 管加入等體積的HBSS(NaCl 8.0g，Na2HP〇4 0.132g，KH2P〇4 0.06g，KCl 0.4g，酚紅lml， NaHC03 0.35g，D-葡萄糖1.0g，溶于1000ml雙蒸水），以降低紅細胞的凝聚。吸取8ml淋巴細 胞分層液置50ml離心管中，將稀釋血液沿管壁緩慢加入，保持界面清楚，勿使兩者相混，在 20°C2 000r/min離心30min，小心吸取分層液與血衆(zhòng)交接部位混池的灰白色層，即淋巴細胞 層，加入另一支離心管中，用5倍體積的HBSS洗滌2次，依次以2 000r/min、l 500r/min在室 溫下離心10min，以便去除大部分混雜的血小板，用10ml雙蒸水與細胞團塊混合lmin，使殘 余紅細胞裂解，然后迅速加入等量1.8%NaCl溶液，2 000r/min離心，去上清，經(jīng)細胞計數(shù)后 用HBSS溶液調(diào)整細胞至1 X 106個/ml備用。
[0111] 3、單核細胞總蛋白質(zhì)提取
[0112] 將上述實驗所得細胞懸液(濃度為1X106個/ml)室溫1 OOOr/min離心10min，棄上 清后加入1〇〇μ1裂解緩沖液，4°C震蕩lh，用超聲波儀破碎細胞，每次10s，共10次，于4°C12 OOOr/min離心lh;取上清用Brandford法定量蛋白，分裝成2.5yg/yl，-80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0113] 4、Western blot檢測
[0114] 將提取的蛋白進行SDS-PAGE電泳，之后進行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯 色。
[0115] 5、統(tǒng)計學處理
[0116] 將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進行分析，以β-actin為內(nèi)參，將目的白條 帶的灰度值進行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0.05時具有統(tǒng) 計學意義。
[0117] 6、結(jié)果
[0118]結(jié)果如圖3所示，與正常人相比，冠心病患者血液中DHX36蛋白含量高，差異具有統(tǒng) 計學意義(P〈〇.〇5)。
[0119]上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 檢測DHX36基因或DHX36蛋白的產(chǎn)品在制備診斷冠心病或預測冠心病預后的工具中 的應用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述檢測DHX36基因或DHX36蛋白的產(chǎn)品包 括檢測DHX36基因或DHX36蛋白的表達水平的產(chǎn)品。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，利用所述產(chǎn)品檢測受試者樣本中的DHX36 基因或DHX36蛋白的表達水平，與正常人相比，受試者樣本中的DHX36基因或DHX36蛋白的表 達水平升高，則診斷該受試者為冠心病患者或該受試者的預后差。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述受試者樣本的來源是血液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合DHX36 基因的核酸或者能夠結(jié)合DHX36蛋白的物質(zhì);所述核酸能夠檢測DHX36基因的表達水平;所 述物質(zhì)能夠檢測DHX36蛋白的表達水平。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，所述核酸是實時定量PCR中使用的特異擴 增DHX36基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。7. -種診斷冠心病或預測冠心病預后的工具，其特征在于，所述工具包括能夠檢測受 試者樣本中的DHX36基因或DHX36蛋白的表達水平的工具。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的工具，其特征在于，所述工具包括能夠結(jié)合DHX36基因的核酸 或者能夠結(jié)合DHX36蛋白的物質(zhì);所述核酸能夠檢測DHX36基因的表達水平;所述物質(zhì)能夠 檢測DHX36蛋白的表達水平。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的工具，其特征在于，所述核酸是實時定量PCR中使用的特異擴 增DHX36基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項所述的工具，其特征在于，所述受試者樣本的來源是血 液。
【文檔編號】C12Q1/68GK105907870SQ201610382158
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】肖武, 任建廷, 楊承剛
【申請人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司