檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的TaqMan探針和引物及其應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的TaqMan探針和引物及其應用。檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的TaqMan探針，探針的5’端標記FAM，3’端標記BHQ1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的TaqMan引物，該引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明針對傳毒介體煙粉虱，選取ToCV保守序列設計TaqMan PCR引物及探針，建立快速檢測單頭煙粉虱體內攜帶ToCV病毒的TaqMan實時熒光定量PCR的方法，該擴增方法靈敏度高，特異性強，2小時內便可出結果，快速且檢測結果可靠。
【專利說明】
檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的TaqMan探針和引物及其 應用
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的TaqMan探針和引物及其應 用，屬于生物技術技術領域。
【背景技術】
[0002] 1998年，番前裡綠病毒(Tomato chlorosis virus，ToCV)首次在美國佛羅里達州 的番茄上發(fā)現(xiàn)，目前在全球熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)均有發(fā)生，廣泛分布于歐洲、美洲、中東、 非洲、以及亞洲等眾多國家和地區(qū)。ToCV的寄主范圍十分廣泛，可以侵染來自15個屬的30多 種植物，給農業(yè)生產造成嚴重經濟損失。近年來，在我國臺灣、北京、山東、南京和天津等地 相繼發(fā)現(xiàn)ToCV為害辣椒、番茄作物，部分地區(qū)病株率達到20 % -100 %，作物減產10 % -40 %， ToCV在中國地區(qū)迅猛擴散的態(tài)勢不容忽視。
[0003] ToCV是一種長線形病毒科(01〇8七61'0￥；[1^(1&6)，毛形病毒屬(0；[11；[￥；[1'118)的1?祖病 毒。ToCV侵染植株后，導致感病植株的葉片由下部向上部逐步發(fā)病，發(fā)病初期，葉脈保持綠 色，脈間發(fā)黃，葉片變厚;發(fā)病后期，整個葉片由邊緣向內開始壞死，最后整個植株死亡。目 前尚未育出效果突出的抗ToCV品種，ToCV病害的防治較困難，且病毒傳播媒介本身的防控 也存在很大難度，這使得病害的及時監(jiān)測變得尤為重要。
[0004] ToCV無法通過種子、汁液等方法進行傳毒，僅通過介體煙粉虱(Bemisia tabaci)、 溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum)、紋翅粉虱（Trialeurodes abutilonea)等進行 傳播，在國內主要靠煙粉虱以持久性方式進行傳毒。目前，我國煙粉虱生物型有Q型、B型、 FJ-1型、ZHJ-1型、ZHJ-2型和ZHJ-3型，其中Q型和B型煙粉虱（分別簡稱Q煙粉虱和B煙粉虱） 是兩種重要的入侵性煙粉虱。近年，Q煙粉虱逐漸取代B煙粉虱，在全國范圍內大面積爆發(fā)， 加快了 ToCV的擴散蔓延，且?guī)Ф緹煼凼南x口密度是導致ToCV流行的主要原因。
[0005] 以往對ToCV的研究多集中在感病的植物組織，很少研究傳毒介體煙粉虱。等人們 在植株中觀察或檢測到ToCV時，ToCV往往已在田間流行起來，這時防控已晚。若在作物發(fā)病 前，能有一種方法精準檢測傳毒介體煙粉虱的帶毒情況，從而準確預測作物上的病害發(fā)生 情況，為及時防控ToCV爭取最佳時間，是控制ToCV發(fā)生流行的最好途徑。現(xiàn)有的檢測技術 中，常用方法是血清學檢測法和RT-PCR法，但暫無癥狀的ToCV植株或單頭帶毒煙粉虱，ToCV 的含量很低，用血清學的方法常常會出現(xiàn)漏檢和誤檢的情況;普通RT-PCR的檢測方法，雖然 檢測靈敏度比血清學的方法高，但容易造成樣品的交叉污染，對感病樣品的帶毒量也不能 定量。而TaqMan探針實時熒光定量PCR方法比上述兩種方法的靈敏性都要高，且可以準確定 量樣品中的病毒含量，目前還沒有報道單頭煙粉虱體內檢測ToCV的TaqMan探針實時熒光定 量法。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的 TaqMan探針和引物及利用實時熒光定量PCR檢測煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的方法。
[0007] 術語說明：
[0008] FAM:是6-羧基熒光素，一種常用的熒光基團，用于標記核苷酸和核酸，發(fā)射光呈綠 色。
[0009] BHQ1:是Biosearch Technologies公司的黑洞淬滅基團之一，對于雙標探針、分子 信標和FRET探針非常有效，對綠色至黑色發(fā)射光譜中的所有染料都有極好的光譜重疊效 應。
[0010]本發(fā)明的技術方案如下：
[0011] 檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的TaqMan探針，探針的5 '端標記FAM，3 '端標記 BHQ1，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。該TaqMan探針命名為ToCV-probe6724:
[0012] ToCV-probe6724：5,(FAM)-TAACATTCGGCACTTCC-(BHQ1)3,；
[0013] 檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的TaqMan引物，該引物為一對，上游引物核苷 酸序列如SEQ ID N0.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。上述引物核苷酸序 列如下：
[0014] ToCV-F6680：5，-TTTCTCAAAGGATCAAGCTGTGTT-3 ,；SEQ ID NO.2
[0015] ToCV-R6799:5 '-TGCGCTCCGGTATCAGTCTT-3 '；SEQ ID NO·3
[0016] 利用上述TaqMan探針和引物實時熒光定量PCR快速檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠 病毒的方法，包括如下步驟：
[0017] (1)提取單頭待檢測煙粉虱的RNA，經反轉錄，制得反轉錄產物；
[0018] (2)以步驟（1)制得的反轉錄產物為模板，利用上述TaqMan探針和引物，進行 TaqMan實時熒光定量PCR分析，當有S型擴增曲線和Ct值出現(xiàn)時，則表示待檢測煙粉虱中含 有ToCV，否則，待檢測煙粉虱中不含有ToCV。
[0019] 根據本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)提取單頭待檢測煙粉虱的RNA，步驟如下：
[0020] 1)將單頭待檢測煙粉虱置于含有80~150yL Trizol試劑的容器中，-80°c保存;檢 測時，置于冰上溶化，然后研磨后，加入250~400yL Trizol試劑，震蕩混勻；
[0021 ] 2)加入80~150yL氯仿，震蕩混勾，4 °C離心機13000rpm/min離心15min，取上清；
[0022] 3)上清液中加入200~300yL異丙醇，震蕩混勻，4°C離心機13000rpm/min離心 15min，棄上清；
[0023] 4)加入lmL由RNase free ddH20配制的質量百分比濃度為75%的乙醇溶液，清洗 RNA，4°C離心機13000rpm/min離心5min，棄上清，風干沉淀，制得RNA;
[0024] 5)加入RNase free ddH20,溶解RNA，即得。
[0025] 所述步驟（1)中的反轉錄可采用市售反轉錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time) (Takara:RR047a)進行反轉錄，具體操作步驟 如下：
[0026] ①基因組DNA的去除:在冰上配制反應液，使用10.0 yL的反應體系，如下：
[0027] 5XgDNA Eraser Buffer 2.0yL,gDNA Eraser 1.0yL,All Total RNA 7.0yL, RNase Free ddH2〇補至 10.0 yL;
[0028] 反應條件：42°C2min;
[0029] ②反轉錄:冰上配制反應液，20.0 yL的反應體系，如下：
[0030] Reaction solution from Step 1 10.OyL,5XPrimeScript Buffer2 4.0yL, PrimeScript RT Enzyme MixI1.0yL,RT Primer Mix 1.0yL,RNase Free ddH2〇 4.0yL；
[0031] 反應條件：37。(：15!1^11，851€58，-20。(：保存；
[0032] 根據本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，TaqMan實時熒光定量PCR的擴增體系如下，總 體系20yL:
[0033] 模板2·0μL;2XPremixExTaq(ProbeqPCR)10·0μL ;10μM/μLToCV-F6680 0·4μL; 10μΜ/μL ToCV-F6799 0.4yL；ΙΟμΜ/μL ToCV-probe6724 0.8yL；ddH20 6.4yL；
[0034] 所述TaqMan PCR擴增程序如下：
[0035] 95 °C 30s; 95 °C 5s，57 °C 30s，40 個循環(huán)。
[0036] 根據本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，還包括根據Ct值與標準曲線進行對應，計算 待檢測煙粉虱中ToCV的具體含量;所述標準曲線按如下步驟建立：
[0037] (i)以感染ToCV植株的cDNA為模板，PCR擴增ToCV的基因片段；
[0038] 所述PCR擴增的引物ToCV-F和ToCV-R，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4和SEQ ID NO. 5所示：
[0039] ToCV-F：5'-CTGAAGTTCCTTTGGTGCAA-3,；SEQ ID NO.4
[0040] ToCV-R：5，-CCGCAGTGTAATCGAGAAAA-3,；SEQ ID NO.5 [00411所述PCR擴增的反應體系如下所示，體系總體積20yL:
[0042] 模板2·0μL;2·5mM/μLdNTP2μL;Eχ-Taq0·2μL ;10XEχ-TaqBuf?er2·0μL;10μ M/yL ToCV-F 0.3yL；10mM/yL ToCV-R 0.3yL；ddH20 13.2yL；
[0043] 所述PCR擴增的程序如下：
[0044] 95 °C 預變性 4min; 94°C 變性 40s，55 °C 退火 40s，72 °C 延伸 50s，35 個循環(huán)；72 °C 延伸 10min；4〇Cjx.i^Z10min；
[0045] (ii)將步驟（i)制得的基因片段連接到pMD18-T Vector中，然后轉化至大腸桿菌 感受態(tài)細胞JM109中，篩選并提取陽性克隆的質粒且測序正確后，制得外參陽性質粒；
[0046] 根據以下公式計算含有ToCV片段質粒拷貝數：
[0047] 質?？截悢礎xL=(CX1(T9)X阿氏常數/質粒分子量
[0048]其中C表示質粒濃度，單位ng/μΜ阿氏常數為6.02X 1023;質粒分子量=重組質粒 喊基數 X 660dalton/bp;
[0049] (iii)測定步驟(ii)制得的外參陽性質粒的濃度，按10倍梯度稀釋至109、10 8、107、 106、105、104、10^10^10 1質粒拷貝數ΛΛ，分別進行TaqMan實時熒光定量PCR擴增，得到動力 學擴增曲線，然后制作PCR擴增循環(huán)閾值(Ct值)和初始病毒量對數相關的標準曲線。
[0050] 根據本發(fā)明進一步優(yōu)選的，所述步驟（iii)中，TaqMan實時熒光定量PCR的擴增體 系如下，總體系20yL:
[0051] 模板2·0μL;2XPremixExTaq(ProbeqPCR)10·0μL ;10μM/μLToCV-F6680 0·4μL; 10μΜ/μL ToCV-F6799 0.4yL；ΙΟμΜ/μL ToCV-probe6724 0.8yL；ddH20 6.4yL；
[0052] 所述TaqMan PCR擴增程序如下：
[0053] 95 °C 30s; 95 °C 5s，57 °C 30s，40 個循環(huán)。
[0054] 上述實驗步驟如無特別說明均可參見《分子克隆實驗指南》第三版(北京:科學出 版社，2002)。
[0055] 有益效果
[0056] 1、本發(fā)明針對傳毒介體煙粉虱，選取ToCV保守序列設計TaqMan PCR引物及探針， 建立快速檢測煙粉虱體內攜帶ToCV病毒的TaqMan實時熒光定量PCR的方法，該擴增方法靈 敏度高，特異性強，2小時內便可出結果，快速且檢測結果可靠；
[0057] 2、本發(fā)明可實現(xiàn)對單頭煙粉虱攜帶ToCV的檢測，精確度高；
[0058] 3、利用本發(fā)明可對田間煙粉虱的ToCV帶毒情況進行大規(guī)模調查，精確計算煙粉虱 帶毒率，可有效減少樣品交叉污染，快速高效、靈敏特異，為番茄褪綠病毒的快速診斷、早期 預測預報及科學防控提供技術支撐。
【附圖說明】
[0059] 圖1 ToCV基因片段PCR擴增圖
[0060] 圖中M:2000bp Ladder;l:ToCV基因片段；
[0061 ] 圖2以101~109copies的ToCV-pMD18-T質粒為模板建立的擴增曲線；
[0062]圖中A~I:質粒稀釋倍數依次為102~108倍；
[0063] 圖3以101~109copies的ToCV-pMD18_T質粒為模板建立的標準曲線和線性關系；
[0064] 圖4實驗室ToCV番茄植株上單頭煙粉虱ToCV TaqMan PCR擴增曲線；
[0065] 圖5田間單頭煙粉虱ToCV TaqMan PCR擴增曲線。
【具體實施方式】
[0066] 下面結合實例及附圖對本發(fā)明的技術內容做進一步的說明，但本發(fā)明所保護范圍 不限于此。
[0067] 實施例中所述的RNA提取試劑Trizol采購于Invitrogen公司，cDNA的合成試劑 PrimcScripi rRT reagent Kit和Premix Ex Taq(Probe qPCR)米購于TaKaRa公司，其它試劑 均為普通市售試劑。
[0068] 實施例1
[0069] ToCV檢測的標準曲線的建立，步驟如下：
[0070] (i)以感染ToCV植株的cDNA為模板，PCR擴增ToCV的基因片段；
[0071] 所述PCR擴增的引物是根據GenBank公布的番前ToCV基因序列（Accession number :KC709510.1)，從中選取ToCV外殼蛋白高度保守、特異區(qū)域設計獲得的，引物序列如 下所示：
[0072] ToCV-F：5，-CTGAAGTTCCTTTGGTGCAA-3,；SEQ ID NO.4
[0073] ToCV-R：5，-CCGCAGTGTAATCGAGAAAA-3,；SEQ ID NO.5
[0074] 所述PCR擴增的反應體系如下所示，體系總體積20yL:
[0075] 模板2·0μL;2·5mM/μLdNTP2·0μL;Eχ-Taq0·2μL ;10XEχ-TaqBuf?er2·0μL;10 yM/yL ToCV-F 0.3yL；10mM/yL ToCV-R 0.3yL；ddH20 13.2yL；
[0076] 所述PCR擴增的程序如下：
[0077] 95 °C 預變性 4min; 94°C 變性 40s，55 °C 退火 40s，72 °C 延伸 50s，35 個循環(huán)；72 °C 延伸 10min；4〇Cjx.i^Z10min；
[0078] PCR產物用1.5wt%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果成像膠片在681bp處有一條條帶出 現(xiàn)(如圖1)，對此條帶產物進行測序，序列如SEQ ID NO.6所示。
[0079] (ii)將步驟(i)制得的基因片段通過T-A克隆連接到pMD18-T Vector中，然后轉化 至大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109中，篩選并提取陽性克隆的質粒且測序正確后，制得外參陽性 質粒；
[0080] 根據以下公式計算含有ToCV片段質?？截悢担?br>[0081] 質粒拷貝數AiL = (C X 1 0-9) X阿氏常數/質粒分子量
[0082] 其中C表示質粒濃度，單位ng/μΜ阿氏常數為6.02X 1023;質粒分子量=重組質粒 喊基數 X 660dalton/bp;
[0083]經計算，步驟(ii)制得的外參陽性質粒的質?？截悢禐?.3X 101Qcopies/yL
[0084] (iii)測定步驟(ii)制得的外參陽性質粒的濃度，按10倍梯度稀釋至109、10 8、107、 106、105、104、10 3、102、101質?？截悢?yL，分別進行TaqMan PCR擴增；
[0085] 所述TaqMan探針，結構如下：
[0086] ToCV-probe6724：5,(FAM)-TAACATTCGGCACTTCC-(BHQ1)3,；
[0087] 所述TaqMan PCR引物核苷酸序列如下：
[0088] ToCV-F6680：5，-TTTCTCAAAGGATCAAGCTGTGTT-3,；SEQ ID NO.2
[0089] ToCV-R6799：5，-TGCGCTCCGGTATCAGTCTT-3,〇SEQ ID NO.3
[0090] 所述TaqMan實時熒光定量PCR的擴增體系如下，總體系20yL:
[0091] 模板2·0μL;2XPremixExTaq(ProbeqPCR)10·0μL ;10μM/μLToCV-F6680 0·4μL; 10μΜ/μL ToCV-F6799 0.4yL；ΙΟμΜ/μL ToCV-probe6724 0.8yL；ddH20 6.4yL；
[0092] 所述TaqMan PCR擴增程序如下：
[0093] 95 °C 30s; 95 °C 5s，57 °C 30s，40 個循環(huán)。
[0094] TaqMan PCR擴增后得到的動力學擴增曲線，如圖2所示，然后制作PCR擴增循環(huán)閾 值(Ct值)和初始病毒量對數相關的標準曲線，如圖3所示。
[0095] 實施例2
[0096] 利用實時熒光定量PCR快速檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的方法，包括如下 步驟：
[0097] (1)提取單頭待檢測煙粉虱的RNA，經反轉錄，制得反轉錄產物；
[0098] 所述提取單頭待檢測煙粉虱的RNA，步驟如下：
[0099] 1)采集ToCV番茄植株飼養(yǎng)煙粉虱50頭，分別將單頭待檢測煙粉虱置于含有100yL Trizol試劑的容器中，-80°C保存;檢測時，置于冰上溶化，然后研磨后，加入300yL Trizol 試劑，震蕩混勻；
[0100] 2)加入100yL氯仿，震蕩混勾，4°C離心機13000rpm/min離心15min，取上清，將上清 液轉移至一新的1 ·5mL RNase free離心管中；
[0101] 3)上清液中加入250yL異丙醇，震蕩混勻，4°C離心機13000rpm/min離心15min，棄 上清；
[0102] 4)加入lmL由RNase free ddH20配制的質量百分比濃度為75%的乙醇溶液，清洗 RNA，4°C離心機13000rpm/min離心5min，棄上清，風干沉淀，制得RNA;
[0103] 5)加入RNase free ddH20,溶解RNA，即得；
[0104] 經NanoPhotometer N50檢測單頭煙粉虱RNA的濃度在 142 · 3ng/yL~313 · 88ng/yL 之間，-80°C保存?zhèn)溆茫?br>[0105] 所述反轉錄采用反轉錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time) (Takara:RR047a)將制得的RNA進行反轉錄合成cDNA，制得反 轉錄產物，具體操作步驟如下：
[0106] ①基因組DNA的去除:在冰上配制反應液，使用10yL的反應體系，如下：
[0107] 5XgDNA Eraser Buffer 2.0yL,gDNA Eraser 1.0yL,All Total RNA 7.0yL, RNase Free ddH2〇補至lO.OyLo
[0108] 反應條件：42°C2min。
[0109] ②反轉錄:冰上配制反應液，20yL的反應體系，如下：
[0110] Reaction solution from Step 1 10.OyL,5XPrimeScript Buffer2 4.0yL, PrimeScript RT Enzyme MixI1.0yL,RT Primer Mix 1.0yL,RNase Free ddH2〇 4.0yL〇
[0111] 反應條件：37 °C 15min，85 °C 5s，-20 °C 保存。
[0112] (2)以步驟⑴制得的反轉錄產物為模板，利用TaqMan探針和弓丨物，進行TaqMan實 時熒光定量PCR分析：
[0113] 所述TaqMan探針，結構如下：
[0114] ToCV-probe6724：5,(FAM)-TAACATTCGGCACTTCC-(BHQ1)3,；
[0115] 所述TaqMan PCR引物核苷酸序列如下：
[0116] T0CV-F6680:5 '-TTTCTCAAAGGATCAAGCTGTGTT-3 '；
[0117] ToCV-R6799:5 '-TGCGCTCCGGTATCAGTCTT-3 '。
[0118] 所述TaqMan實時熒光定量PCR的擴增體系如下，總體系20yL:
[0119] 模板2·0μL;2XPremixExTaq(ProbeqPCR)10·0μL ;10μM/μLToCV-F6680 0·4μL; 10μΜ/μL ToCV-F6799 0.4yL；ΙΟμΜ/μL ToCV-probe6724 0.8yL；ddH20 6.4yL；
[0120] 所述TaqMan PCR擴增程序如下：
[0121] 95 °C 30s; 95 °C 5s，57 °C 30s，40 個循環(huán)。
[0122] 對TaqMan實時熒光定量PCR數據進行分析，計算煙粉虱體內ToCV的含量(依據圖3 標準曲線計算病毒含量)與帶毒率(帶毒率=陽性數/樣品總數X 100%)，檢測結果如表1所 示；
[0123] 表1
[0124]
[0125] 注:表中"+" ：ToCV檢測為陽性；"一" ：ToCV檢測為隱性。
[0126] 結果顯示，50頭煙粉虱樣品均能擴增出S型曲線(如圖4所示），ToCV的Ct值在22.47 ~30.44之間，相對應的病毒含量1399~498519〇〇?丨68/^以如表1所示），經計算煙粉虱對 ToCV的帶毒率為100%，該煙粉虱可用于健康番茄的傳毒試驗。
[0127] 實施例3
[0128] 取采集于青島市城陽區(qū)上馬鎮(zhèn)番茄溫室大棚中的煙粉虱樣品，按照實施例2所述 的方法進行檢測，檢測結果如表2所示：
[0129] 表2
[0130]
[0132] 注:表中"+" ：ToCV檢測為陽性；"一" ：ToCV檢測為隱性。
[0133] 結果顯示:50頭煙粉虱樣品中有15頭能擴增出3型曲線（圖5)，1'〇(^的(^值在22.02 ~30.16之間，相對應的病毒含量1720~694648〇〇?丨68/^以如表2所示），經計算煙粉虱對 ToCV的帶毒率為30%，預測該地將有ToCV發(fā)生流行趨勢，建議農藥防治煙粉虱，預防ToCV的 流行和爆發(fā)。
【主權項】
1. 檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的TaqMan探針，探針的5'端標記FAM，3'端標記 BHQl，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的TaqMan引物，該引物為一對，上游引物核苷酸 序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3. 利用權利要求1所述的TaqMan探針和權利要求2所述的引物進行實時熒光定量PCR快 速檢測單頭煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 提取單頭待檢測煙粉虱的RNA，經反轉錄，制得反轉錄產物； (2) 以步驟（1)制得的反轉錄產物為模板，利用TaqMan探針和引物，進行TaqMan實時焚 光定量PCR分析，當有S型擴增曲線和Ct值出現(xiàn)時，則表示待檢測煙粉虱中含有ToCV，否則， 待檢測煙粉虱中不含有ToCV。4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)提取單頭待檢測煙粉虱的RNA， 步驟如下： 1) 將單頭待檢測煙粉虱置于含有80~150yL Trizol試劑的容器中，-80°C保存；檢測 時，置于冰上溶化，然后研磨后，加入250~400yL Trizol試劑，震蕩混勻； 2) 加入80~150yL氯仿，震蕩混勾，4 °C離心機13000rpm/min離心15min，取上清； 3) 上清液中加入200~300yL異丙醇，震蕩混勾，4°C離心機13000rpm/min離心15min，棄 上清； 4) 加入ImL由RNase free ddH20配制的質量百分比濃度為75 %的乙醇溶液，清洗RNA，4 °C離心機13000rpm/min離心5min，棄上清，風干沉淀，制得RNA; 5) 加入RNase free CldH2O，溶解RNA，即得。5. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟⑵中，TaqMan實時焚光定量PCR的 擴增體系如下，總體系20yL: 模板2. OyL; 2 XPremix ExTaq 10 .OyL5IOyMAiL T0CV-F668O 0·4μΜ10μΜ/μL ToCV-F67990.4yL；10yM/yL ToCV-probe6724 0.8yL；ddH20 6.4yL； 所述TaqMan PCR擴增程序如下： 95 °C 30s; 95 °C 5s，57 °C 30s，40 個循環(huán)。6. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，還包括根據Ct值與標準曲線 進行對應，計算待檢測煙粉虱中ToCV的具體含量。7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述標準曲線按如下步驟建立： (i) 以感染ToCV植株的cDNA為模板，PCR擴增ToCV的基因片段； 所述PCR擴增的引物ToCV-F和ToCV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所 示； 所述PCR擴增的反應體系如下所示，體系總體積20yL: 模板2 .OyL;2.5IiiMA1L dNTP 2yL;Ex_Taq 0.2yL; 10 X Ex-Taq Buffer 2 .OyL; 10μΜ/μL ToCV-F 0.3yL；10mM/yL ToCV-R 0.3yL；ddH20 13.2yL； 所述PCR擴增的程序如下： 95°(：預變性4111丨11;94°(：變性4〇8,55°(：退火4〇8,72°(：延伸5〇8,35個循環(huán) ；72°(：延伸 IOmin; 4。。反應10min; (ii) 將步驟（i)制得的基因片段連接到PMD18-T Vector中，然后轉化至大腸桿菌感受 態(tài)細胞JM109中，篩選并提取陽性克隆的質粒且測序正確后，制得外參陽性質粒； 根據以下公式計算含有ToCV片段質?？截悢担? 質粒拷貝數ΛΛ= (C X KT9) X阿氏常數/質粒分子量 其中C表示質粒濃度，單位ng/μΜ阿氏常數為6.02 X IO23;質粒分子量=重組質粒堿基 數 X 660dalton/bp; (iii)測定步驟(ii)制得的外參陽性質粒的濃度，按10倍梯度稀釋至1〇9、1〇8、1〇 7、1〇6、 105、104、103、102、101質?？截悢?μL，分別進行TaqMan實時熒光定量PCR擴增，得到動力學擴 增曲線，然后制作PCR擴增循環(huán)閾值(Ct值)和初始病毒量對數相關的標準曲線。8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟（iii)中，TaqMan實時熒光定量PCR 的擴增體系如下，總體系20yL: 模板2. OyL; 2 XPremix ExTaq 10 .OyL5IOyMAiL T0CV-F668O 0·4μΜ10μΜ/μL ToCV-F67990.4yL；10yM/yL ToCV-probe6724 0.8yL；ddH20 6.4yL； 所述TaqMan PCR擴增程序如下： 95 °C 30s; 95 °C 5s，57 °C 30s，40 個循環(huán)。
【文檔編號】C12R1/94GK105907892SQ201610382085
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】李潔, 褚棟, 王政杰, 張鑫澤, 豐榮基
【申請人】青島農業(yè)大學