重組專性厭氧革蘭氏陽性菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于通過抗TRAIL?R1抗體和抗TRAIL?R2抗體有效地誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，同時減輕對正常細(xì)胞的毒性。一種重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，以可表達(dá)狀態(tài)含有編碼融合蛋白質(zhì)的核酸，該融合蛋白質(zhì)含有3個以上的抗TRAIL?R1單鏈抗體和/或3個以上的抗TRAIL?R2單鏈抗體。
【專利說明】
重組專性厭氧革蘭氏陽性菌
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及將重組專性厭氧革蘭氏陽性菌作為有效成分的抗腫瘤劑和腫瘤檢測 用標(biāo)記物。
【背景技術(shù)】
[0002] TRAIL(TNF_related apoptosis-inducing ligand)屬于TNF超家族，是對各種癌 細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(apoptosis細(xì)胞凋亡）的蛋白質(zhì)。TRAIL在生物體內(nèi)形成三聚體，在細(xì)胞 內(nèi)與具有死亡結(jié)構(gòu)域的TRAIL受體(TRAIL-RUTRAIL-R2)結(jié)合。已知TRAIL結(jié)合時TRAIL受體 聚集形成三聚體，由此將細(xì)胞死亡信號傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)。已知TRAIL的受體除了上述TRAIL-尺1、了1^11^-1?2以外，還有了1^11^-1?31^11^-1?4和屬于可溶性受體的骨保護(hù)素（圖1) (^1^11^-R3、TRAIL-R4和骨保護(hù)素完全或部分地缺失死亡結(jié)構(gòu)域，這些受體即使結(jié)合TRAIL也不誘導(dǎo) 細(xì)胞死亡，因此稱為誘餌受體。
[0003] TRAIL由于在正常細(xì)胞中不易引起細(xì)胞死亡，因此作為抗腫瘤藥正在進(jìn)行開發(fā)。然 而，為了利用TRAIL對癌細(xì)胞有效地誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，需要開發(fā)不與上述誘餌受體結(jié)合，有效 地與TRAIL-R1和TRAIL-R2結(jié)合，向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)細(xì)胞死亡信號的系統(tǒng)。對TRAIL-R1和TRAIL-R2的激動性(agon i s t)抗體由于不與上述誘t耳受體結(jié)合，所以能夠比TRAIL更有效地誘導(dǎo)細(xì) 胞死亡，且血中的半衰期長，因此能夠延長給藥間隔。因此，這些抗體現(xiàn)在處于臨床階段(非 專利文獻(xiàn) 1)。然而，HGS-ETR1 (抗 hTRAIL(人 TRAIL)-R1 激動性抗體)和 HGS-ETR2(抗 hTRAIL-R2激動性抗體)是二價(jià)的，因此在沒有具有Fc受體的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞所致的抗體的交聯(lián)的 情況下，無法誘導(dǎo)TRAIL受體形成三聚體（圖2a)。因此，存在這些抗體在臨床試驗(yàn)中沒有體 現(xiàn)顯著的治療效果的問題(非專利文獻(xiàn)2)。
[0004] 作為在NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞不參與的情況下能夠直接使癌細(xì)胞膜上的hTRAIL-R2分 子凝聚來傳導(dǎo)細(xì)胞死亡信號的強(qiáng)效激動性抗體，已知有HGS-TR2J(KMTR2)(非專利文獻(xiàn)3) (圖2b)。另外，也已知針對hTRAIL-R2的美洲駝單鏈VHH抗體的3~5聚體在NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞 不參與的情況下對表達(dá)hTRAIL-R2的癌細(xì)胞非常強(qiáng)效地誘導(dǎo)細(xì)胞死亡（專利文獻(xiàn)1)(圖3)。 另一方面，認(rèn)為hTRAIL-Rl和hTRAIL-R2不僅在癌細(xì)胞中表達(dá)，也在各種人正常組織中表達(dá)， 特別是人正常肝細(xì)胞對hTRAIL、抗hTRAIL-R激動性抗體是敏感性的（非專利文獻(xiàn)4和非專利 文獻(xiàn)5)，因此hTRAIL-R激動性抗體作為副作用引起肝損傷。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006] 專利文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn) 1:PCT W0/2011/098520
[0008] 非專利文獻(xiàn)
[0009] 非專利文獻(xiàn)l:Ghobrial等，2005，CA Cancer J Clin. ,55(3)，ρρ· 178-194
[0010] 非專利文獻(xiàn)2:Micheau等，2013，Br J Pharmacol. ,169(8)，ρρ· 1723-1744
[0011] 非專利文獻(xiàn)3:Motoki等，2005，Clin Cancer Res. ,11(8)，ρρ·3126-3135
[0012] 非專利文獻(xiàn)4:加等，2000，恥七]^(1.，6(5)4口.564-567
[0013] 非專利文獻(xiàn)5:Mori等，2004，Cell Death Differ. ,11(2)，ρρ·203-207

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的在于通過抗TRAIL-R1抗體和抗TRAIL-R2抗體有效地誘導(dǎo)癌細(xì)胞死 亡，同時減少對正常細(xì)胞的毒性。
[0015] 本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)制作雙歧桿菌，通過 該重組雙歧桿菌的靜脈給藥能夠誘導(dǎo)腫瘤局部的癌細(xì)胞死亡，所述雙歧桿菌表達(dá)、分泌具 有強(qiáng)效激動劑活性的抗hTRAIL-R2VHH抗體。另外，本發(fā)明人取得了能夠識別癌細(xì)胞膜上的 hTRAIL-Rl分子的新型抗hTRAIL-RIVHH抗體。根據(jù)本發(fā)明，通過腫瘤部位局部給予具有強(qiáng)效 激動劑活性的抗hTRAIL-Rl和抗hTRAIL-R2抗體，能夠減少對正常細(xì)胞的毒性，并且有效地 誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。
[0016] 本發(fā)明基于該研究結(jié)果而完成，具體提供以下發(fā)明。
[0017] (1) -種重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，以可表達(dá)狀態(tài)含有編碼融合蛋白質(zhì)的核酸， 該融合蛋白質(zhì)含有信號肽以及3個以上的抗TRAIL-R1單鏈抗體和/或3個以上的抗TRAIL-R2 單鏈抗體。
[0018] (2)根據(jù)（1)所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，專性厭氧革蘭氏陽性菌為 雙歧桿菌屬(Bifidobacterium) 〇
[0019] (3)根據(jù)(1)或(2)所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，對于抗TRAIL-R1單鏈 抗體，
[0020] ⑶R1含有由序列號22表示的氨基酸序列，
[0021 ] ⑶R2含有由序列號23表示的氨基酸序列，和
[0022]⑶R3含有由序列號24表示的氨基酸序列。
[0023] (4)根據(jù)（1)~（3)中任一項(xiàng)所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，對于抗 TRAIL-R2單鏈抗體，
[0024]⑶R1含有由序列號15表示的氨基酸序列，
[0025] ⑶R2含有由序列號16表示的氨基酸序列，和
[0026] ⑶R3含有由序列號17表示的氨基酸序列。
[0027] (5)根據(jù)（1)~(4)中任一項(xiàng)所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，上述融合蛋 白質(zhì)進(jìn)一步含有功能性肽。
[0028] (6)根據(jù)(5)所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，功能性肽為標(biāo)記蛋白質(zhì)。
[0029] (7)-種抗腫瘤劑，將（1)~(6)中任一項(xiàng)所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌作為 有效成分。
[0030] (8)-種抗 TRAIL-R1 抗體，其中，
[0031]⑶R1含有由序列號22表示的氨基酸序列，
[0032] ⑶R2含有由序列號23表示的氨基酸序列，和
[0033]⑶R3含有由序列號24表示的氨基酸序列。
[0034]本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)的日本專利申請2014-003441號的說明 書和/或附圖中記載的內(nèi)容。
[0035]根據(jù)本發(fā)明，通過腫瘤部位局部給予具有強(qiáng)效激動劑活性的抗hTRAIL-Rl抗體和 抗hTRAIL-R2抗體，能夠減少對正常細(xì)胞的毒性，并且有效地誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。
【附圖說明】
[0036]圖1是TRAIL及其受體的結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的信號傳導(dǎo)的簡圖。
[0037]圖2是表示對TRAIL-R的通?？贵wa和具有激動劑活性的抗體b的細(xì)胞死亡信號的 細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的差異的簡圖（通常抗體的情況下，介由TRAIL的細(xì)胞凋亡需要NK細(xì)胞、巨噬細(xì) 胞c所致的交聯(lián)。KMTR2抗體的情況下，介由TRAIL的細(xì)胞凋亡不需要NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞所致 的交聯(lián)）。
[0038]圖3是表示單鏈VHH抗體的3~5聚體(該圖中為VHH4)在沒有NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞所致 的交聯(lián)的情況下對表達(dá)hTRAIL-R的癌細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的簡圖。
[0039] 圖 4 表示純化 hTRAIL-Rl:Fc(a)、hTRAIL-R2:Fc(b(l)WPmTRAILQJntTRAIL)-R2: Fc (b (2))的SDS-PAGE (SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳）圖像。
[0040] 圖5表示純化后的4E6單體的SDS-PAGE圖像。箭頭表示4E6單體。
[0041 ] 圖6表示由ELISA得到的4E6單體對hTRAIL-R2: Fc抗原的結(jié)合活性的測定結(jié)果。 [0042] 圖7表示由Biacore X-100得到的4E6單體與hTRAIL-R2:Fc抗原的解離常數(shù)的測定 結(jié)果。
[0043]圖8表示純化后的4P6單體的SDS-PAGE圖像。
[0044]圖9表示由ELISA得到的4P6單體和4E6單體的結(jié)合特異性的解析結(jié)果。
[0045] 圖10表示由Biacore X-100得到的4P6單體與hTRAIL-Rl :Fc抗原的解離常數(shù)的測 定結(jié)果。
[0046] 圖11表示4P6單體和4E6單體的拮抗活性。
[0047] 圖12是在大腸桿菌中表達(dá)的4E6二聚體Toxin(a)、4E6二聚體EGFP(b)和4E6四聚體 (c)的基因結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0048] 圖13表示純化的大腸桿菌表達(dá)重組蛋白質(zhì)(a: 4E6二聚體Toxin、b: 4E6二聚體EGFP 和c: 4E6四聚體）的SDS-PAGE圖像。
[0049] 圖14表示重組蛋白質(zhì)（a: 4E6二聚體Toxin和4E6二聚體EGFP以及b: 4E6單體和4E6 四聚體)對人大腸癌細(xì)胞C〇1〇205細(xì)胞的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性。
[0050] 圖15表示利用4E6二聚體EGFP的癌細(xì)胞(a:Colo205細(xì)胞和b:BxPC-3細(xì)胞）的熒光 染色。縱軸表示細(xì)胞數(shù)，橫軸表示4E6二聚體EGFP的熒光強(qiáng)度。
[0051 ] 圖16表示在大腸桿菌中表達(dá)的抗hTRAIL-R2VHH抗體四聚體(4E6四聚體)對人大腸 癌細(xì)胞C〇1〇205細(xì)胞(a)和胰腺癌細(xì)胞BxPC-3細(xì)胞(b)的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)作用。
[0052] 圖17表示由雙歧桿菌培養(yǎng)上清液lmL純化而得的4E6四聚體和4E6二聚體EGFP的 SDS-PAGE圖像。4E6四聚體顯示3克隆的結(jié)果，4E6二聚體EGFP顯示2克隆的結(jié)果。
[0053] 圖18表示由雙歧桿菌培養(yǎng)上清液純化而得的4E6四聚體(4E6四聚體)對C〇1〇205細(xì) 胞的癌細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性。
[0054]圖19表示移植了C〇1〇205細(xì)胞的裸小鼠中的分泌4E6四聚體的雙歧桿菌的抗腫瘤 效果。腫瘤體積以mm3計(jì)，由平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差(η = 6)表示。
[0055]圖20表示在移植了C〇1〇205細(xì)胞的裸小鼠中給予分泌4Ε6四聚體的雙歧桿菌時的 體重變化。體重由平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 6)表示。
[0056]圖21表示移植了 BxPC-3細(xì)胞的裸小鼠中的分泌4E6四聚體的雙歧桿菌的抗腫瘤效 果。腫瘤體積以mm3計(jì)，由平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差(η = 6)表示。
[0057]圖22表示在移植了BxPC-3細(xì)胞的裸小鼠中給予分泌4Ε6四聚體的雙歧桿菌時的體 重變化。體重由平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 6)表示。
[0058]圖23表示純化的大腸桿菌表達(dá)重組蛋白質(zhì)(4Ρ6三聚體)的SDS-PAGE圖像。
[0059] 圖24表示在大腸桿菌中表達(dá)的抗hTRAIL-RIVHH抗體三聚體(4Ρ6三聚體)對人大腸 癌細(xì)胞C〇1〇205細(xì)胞的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)作用。
[0060]圖25表示由雙歧桿菌培養(yǎng)上清液純化而得的4P6三聚體的SDS-PAGE圖像。
[00611圖26表示由雙歧桿菌培養(yǎng)上清液純化而得的抗hTRAIL-RIVHH抗體三聚體(4P6三 聚體)對人大腸癌細(xì)胞C010205細(xì)胞(a)和胰腺癌細(xì)胞BxPC-3細(xì)胞(b)的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)作用。 [0062] 圖27表示移植了 BxPC-3-Luc#2細(xì)胞的裸小鼠中的分泌4P6三聚體的雙歧桿菌的抗 腫瘤效果。腫瘤體積以mm3計(jì)，由平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差(n = 5)表示。
[0063] 圖28表示在移植了 BxPC-3-Luc#2細(xì)胞的裸小鼠中給予分泌4P6三聚體的雙歧桿菌 時的體重變化。體重由平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差(η = 5)表示。
【具體實(shí)施方式】
[0064]以下對本發(fā)明進(jìn)行具體說明。
[0065] 1.重組專性厭氧革蘭氏陽性菌
[0066] 1-1.概要和定義
[0067] 本發(fā)明的第1方式為重組專性厭氧革蘭氏陽性菌（以下，通常簡稱為"重組細(xì)菌"）。 本發(fā)明的重組細(xì)菌是以可表達(dá)狀態(tài)含有編碼融合蛋白質(zhì)的核酸的藥劑遞送載體。
[0068] "專性厭氧革蘭氏陽性菌"是指被分類為革蘭氏陽性菌的專性厭氧菌。在此，"專性 厭氧菌"也被稱為嚴(yán)格厭氧菌，是具有在高氧存在下不能增殖而滅絕的性質(zhì)的細(xì)菌。因此， 在哺乳動物的體內(nèi)，可以在低氧下在厭氧狀態(tài)的消化器官內(nèi)、主要在腸內(nèi)增殖，但在存在溶 解氧的血液等體液中、通常的組織內(nèi)無法增殖。"革蘭氏陽性菌"是指通過革蘭氏染色被染 成紫色或藏青色的細(xì)菌的通稱。革蘭氏陽性菌已知有桿菌、球菌、螺旋菌，但在本說明書中 沒有特別限定。由于革蘭氏陽性菌不含有內(nèi)毒素(Endotoxin)，因此死后也不釋放出內(nèi)毒 素。因此，從安全性方面考慮，優(yōu)選作為本發(fā)明的藥劑遞送載體。作為本發(fā)明的重組細(xì)菌，例 如雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)(本說明書中，以下將雙歧桿菌屬總稱為"雙歧桿菌"）、梭 菌屬（(：1〇^4(111 1111)可以符合。優(yōu)選為雙歧桿菌。這是由于雙歧桿菌不分泌外毒素 (Exotoxin)，且日常被用作乳酸菌，對人體等的安全性得到確認(rèn)。雙歧桿菌可以是任意的種 類，但優(yōu)選生活在人的腸道內(nèi)的種類，具體而言為雙叉雙歧桿菌(B.bifidum)、長雙歧桿菌 (B . Ion gum)、短雙歧桿菌（B.brave)、嬰兒雙歧桿菌（B.inf antis)和青春雙歧桿菌 (B.adolescentis)〇
[0069] 1-2.構(gòu)成
[0070] 本發(fā)明的專性厭氧革蘭氏陽性菌以可表達(dá)狀態(tài)含有編碼融合蛋白質(zhì)的核酸（以 下，通常稱為"融合基因"）。以下，對表征本發(fā)明的重組細(xì)菌的融合基因和使其為可表達(dá)狀 態(tài)的表達(dá)盒的構(gòu)成進(jìn)行具體說明。
[0071] 1-2-1.融合基因的構(gòu)成
[0072] 在本說明書中"編碼融合蛋白質(zhì)的核酸(融合基因)"是指利用基因重組技術(shù)融合 多個基因等構(gòu)建的、編碼融合蛋白質(zhì)的外源性核酸。融合基因以被插入到后述的表達(dá)盒內(nèi) 的狀態(tài)被導(dǎo)入到本發(fā)明的重組細(xì)菌內(nèi)。
[0073] 本說明書中"融合蛋白質(zhì)"是指含有信號肽、3個以上的單鏈抗體和任意的功能性 肽并將它們連接而成的細(xì)胞外分泌性蛋白質(zhì)。信號肽、單鏈抗體和功能性肽可以直接連接， 也可以介由連接肽間接地連接。連接肽的長度和氨基酸序列只要不阻礙單鏈抗體和功能性 肽各自的功能，就沒有特別限定。例如，優(yōu)選20個氨基酸以下或15個氨基酸以下不自折疊的 氨基酸序列等。作為本發(fā)明中使用的連接肽，例如可舉出IE G RM D連接肽（序列號2 7)和 (GGSGG)2連接肽(序列號28)。以下，對構(gòu)成融合蛋白質(zhì)的信號肽、單鏈抗體和功能性肽進(jìn)行 具體說明。
[0074] (1)信號肽
[0075] 信號肽是細(xì)胞內(nèi)生物合成的蛋白質(zhì)向細(xì)胞外轉(zhuǎn)移所必需的肽。通常，在N末端側(cè)配 置Lys和Arg這樣具有正電荷的氨基酸，與其連接地配置Ala、Leu、Val、lie、Val和Phe這樣疏 水性高的氨基酸序列。另外，在信號肽的C末端側(cè)，可以具有促進(jìn)信號肽的切割和分泌的信 號序列后插入序列和/或包含從融合蛋白質(zhì)中切割信號肽的信號肽酶識別部位的氨基酸序 列。信號肽擔(dān)負(fù)將在本發(fā)明的細(xì)菌內(nèi)表達(dá)的上述融合蛋白質(zhì)介由存在于膜的轉(zhuǎn)位因子等分 泌到細(xì)胞外的功能。信號肽的氨基酸序列沒有特別限定?？梢岳媚軌蛟趯Ｐ詤捬醺锾m氏 陽性菌內(nèi)發(fā)揮功能的公知的所有信號序列的氨基酸序列。另外，信號肽的氨基酸長度也沒 有特別限定。通常在3個氨基酸~60個氨基酸的范圍內(nèi)即可。但是，為了防止融合蛋白質(zhì)的 分子量過大，優(yōu)選氨基酸長度短的信號肽。
[0076] 信號肽配置于融合蛋白質(zhì)的N末端側(cè)。
[0077] (2)單鏈抗體
[0078] 上述融合蛋白質(zhì)包含3個以上的單鏈抗體。本說明書中"單鏈抗體"是指由單鏈多 肽構(gòu)成、且能夠單獨(dú)識別靶物質(zhì)并結(jié)合的抗體。這是因?yàn)橛蓛蓷l鏈以上構(gòu)成的抗體由于分 子量過大，因此在專性厭氧革蘭氏陽性菌內(nèi)不表達(dá)的可能性、構(gòu)建不出具有抗體功能的適 當(dāng)?shù)牧Ⅲw結(jié)構(gòu)的可能性高。因此，本發(fā)明的單鏈抗體優(yōu)選為每1個的分子量為35kDa以下的 低分子抗體。天然抗體和人工抗體不限。
[0079] 本發(fā)明的單鏈抗體典型的是由互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR)和框架區(qū)(FR)所組成的可變區(qū) 而構(gòu)成?；パa(bǔ)性決定區(qū)是顯示可變性、對抗體賦予結(jié)合特異性的區(qū)域。另一方面，框架區(qū)是 可變區(qū)的相對保守的部分。完整的可變結(jié)構(gòu)域包括由3個CDR連接的4個FR。3個CDR從其N末 端依次被稱為CDR1、CDR2和CDR3，4個FR從其N末端依次被稱為FR1、FR2、FR3和FR4。因此，在 可變區(qū)內(nèi)，上述CDR和FR從氨基酸末端到羧基末端方向按照FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和FR4的順序排列。
[0080] 本說明書中"天然抗體"是指具有與任意一種脊椎動物產(chǎn)生的抗體相同的氨基酸 序列的抗體。作為天然抗體的單鏈抗體的具體例，例如可舉出駱駝科的動物產(chǎn)生的單鏈抗 體(Hamers-Casterman C.，et al.，1993，Nature 363:446-448)(以下，本說明書中稱為"胳 駝科單鏈抗體"）。駱駝科單鏈抗體是沒有L鏈而僅由Η鏈構(gòu)成的抗體，能僅以Η鏈的V H區(qū)域與 抗原結(jié)合，因此分子量約為14kDa，僅為通常的抗體的十分之一左右。另外，一般具有抗原親 和性高，對熱、酸和堿的耐性高的性質(zhì)（Deffar，K.，et al.，2009，African Journal of Biotechnology 8(12):2645-2652)。因此，作為本發(fā)明中的單鏈抗體非常適合。駱駝科的動 物物種只要能夠產(chǎn)生駱駝科單鏈抗體，則其種類不限。例如，也可以利用來自美洲駝、羊駝、 駱駝等任一動物物種的抗體。
[0081] 本說明書中"人工抗體"是指人工構(gòu)建的抗體。例如除在上述天然抗體的氨基酸序 列中導(dǎo)入適當(dāng)變異的單鏈抗體以外，還可舉出自然界中原則上不存在的進(jìn)行了結(jié)構(gòu)上的改 變的單鏈抗體。作為這樣的人工抗體的具體例，可舉出嵌合抗體、人源化抗體、單鏈Fv (scFv:single chain Fragment of variable region)(Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995，Pierce Chemical C?！?，Rockford, IL)、雙鏈抗體（diabody)、三鏈抗體 (tr iabody)或四鏈抗體(tetrabody)等。
[0082] "嵌合抗體"是指抗體分子的可變區(qū)和恒定區(qū)分別來自不同種類的動物的抗體。嵌 合抗體的制作可以使用公知的方法進(jìn)行，例如可以如下得到，即通過將編碼抗體V區(qū)域的核 酸和編碼人抗體C區(qū)域的核酸連接，將其整合到表達(dá)載體并導(dǎo)入宿主而產(chǎn)生。
[0083] "人源化抗體"是指也被稱為重構(gòu)(reshaped)人抗體的修飾抗體。人源化抗體通過 將來自免疫動物的抗體的CDR移植到人抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)而構(gòu)建。還已知其一般的基因 重組技術(shù)。
[0084]單鏈Fv是具有在免疫球蛋白分子中將位于L鏈和Η鏈的可變區(qū)（即，分別為I和Vh) 通過足夠長的柔軟性接頭連接而包含于1跟多肽鏈的結(jié)構(gòu)的、分子量約35kDa以下的合成抗 體。單鏈Fv內(nèi)的兩個可變區(qū)可以相互自集合而形成一個功能性抗原結(jié)合部位。
[0085]上述融合蛋白質(zhì)中，單鏈抗體為了使TRAIL聚集形成三聚體而必須含有3個以上。 但是，抗體數(shù)變多時，融合蛋白質(zhì)的分子量變大，因此通常優(yōu)選數(shù)個，例如3~6個、3~5個或 3~4個。各個單鏈抗體優(yōu)選由適當(dāng)?shù)倪B接肽連接。連接肽的長度、氨基酸序列只要不阻礙各 個單鏈抗體的抗原結(jié)合活性，就沒有特別限定。
[0086] 上述融合蛋白質(zhì)含有3個以上識別相同抗原的單鏈抗體。例如，將hTRAIL-R1作為 抗原時，上述融合蛋白質(zhì)均含有3個以上識別相同的hTRAIL-Rl的單鏈抗體。
[0087] 本發(fā)明中，抗體的"價(jià)"是指1分子抗體所具有的抗原結(jié)合部位的個數(shù)。例如，IgG是 1分子中具有2個抗原結(jié)合部位的2價(jià)的抗體。上述單鏈抗體是每1分子具有1個抗原結(jié)合部 位的1價(jià)的抗體。本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)由于含有3個以上的單鏈抗體，因此整體為3價(jià)以上。
[0088] 單鏈抗體只要在融合蛋白質(zhì)中是信號肽的C末端側(cè)，則與后述的功能性肽的順序 就沒有特別限制，但優(yōu)選配置于功能性肽的N末端側(cè)。
[0089]本發(fā)明中的單鏈抗體的靶物質(zhì)為TRAIL-R1或TRAIL-R2。如上所述本發(fā)明的重組細(xì) 菌僅能在厭氧環(huán)境下增殖，因此在生物體內(nèi)成為厭氧環(huán)境下的細(xì)胞適合作為靶細(xì)胞。具體 而言，作為適合的靶細(xì)胞，可舉出腫瘤細(xì)胞或腸道上皮細(xì)胞。以下，對抗TRAIL-R1抗體和抗 TRAIL-R2抗體進(jìn)行具體說明。
[0090] (i)抗TRAIL-R1 抗體
[0091] 本發(fā)明中，"抗TRAIL-R1 單鏈抗體"是指針對TRAIL-R1 (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1，TRAIL 受體 1) 的單鏈抗體。本發(fā)明中使用的抗 TRAIL-R1 單鏈 抗體只要與TRAIL-R1特異性結(jié)合，就沒有特別限定。作為可在本發(fā)明中使用的抗TRAIL-R1 單鏈抗體，例如可舉出在本說明書的實(shí)施例中取得并使用的4P6。4P6是來自羊駝的單鏈VHH 抗體，CDR1含有由序列號22表示的氨基酸序列，CDR2含有由序列號23表示的氨基酸序列，以 及CDR3含有由序列號24表示的氨基酸序列。本發(fā)明中使用的抗TRAIL-R1單鏈抗體的框架區(qū) 的序列沒有特別限定，但例如可以使用Maass D.R.，et al·，2007, J Immunol Methods. 324:13-25中記載的羊§它單鏈抗體(例如，上述文獻(xiàn)中記載的Clone A02)的框架區(qū) 的序列。因此，抗TRAIL-R1單鏈抗體沒有限定，但例如FR1可以含有由序列號18表示的氨基 酸序列，F(xiàn)R2可以含有由序列號19表示的氨基酸序列，F(xiàn)R3可以含有由序列號20表示的氨基 酸序列和FR4可以含有由序列號21表示的氨基酸序列。
[0092]本發(fā)明中使用的融合蛋白質(zhì)特別優(yōu)選具有與TRAIL-R1結(jié)合而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的激 動劑活性。TRAE-R1通過聚集成三聚體以上來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此為了使TRAE-R1活化，上 述融合蛋白質(zhì)如上所述特別優(yōu)選含有3個以上、4個以上、5個以上或6個以上例如3個、4個、5 個或6個的抗TRAIL-R1單鏈抗體。
[0093]作為本發(fā)明的一個方式，可舉出⑶R1含有由序列號22表示的氨基酸序列、CDR2含 有由序列號23表示的氨基酸序列和CDR3含有由序列號24表示的氨基酸序列的抗TRAIL-R1 抗體。該抗體的框架區(qū)的序列沒有特別限定，但例如可以使用上述的Maass D.R的文獻(xiàn)中記 載的序列，因此，F(xiàn)R1可以含有由序列號18表示的氨基酸序列，F(xiàn)R2可以含有由序列號19表示 的氨基酸序列，F(xiàn)R3可以含有由序列號20表示的氨基酸序列和FR4可以含有由序列號21表示 的氨基酸序列。為了使TRAIL-R1活化，優(yōu)選該抗體為3價(jià)以上。另外，該抗體可以為如上所述 的人工抗體，例如嵌合抗體或人源化抗體。
[0094] 對TRAIL-R1的激動性抗體介由TRAIL-R1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此本發(fā)明的抗體可以用 作細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。
[0095] (ii)抗TRAIL-R2 抗體
[0096] 本發(fā)明中，"抗TRAIL-R2單鏈抗體"是指針對TRAIL-R2(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 2，TRAIL受體2)的單鏈抗體。本發(fā)明中使用的抗TRAIL-R2單鏈 抗體只要與TRAIL-R2特異性結(jié)合，就沒有特別限定。作為本發(fā)明中使用的抗TRAIL-R2單鏈 抗體，例如，可舉出上述文獻(xiàn)W02011 /098520中記載的4E6。4E6為美洲駝單鏈VHH抗體，其 CDR1含有由序列號15表示的氨基酸序列，CDR2含有由序列號16表示的氨基酸序列和CDR3含 有由序列號17表示的氨基酸序列。
[0097] 本發(fā)明中使用的融合蛋白質(zhì)特別優(yōu)選具有與TRAIL-R2結(jié)合而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的激 動劑活性。TRAIL-R2通過聚集成三聚體以上來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此為了使TRAIL-R2活化，上 述融合蛋白質(zhì)如上所述特別優(yōu)選含有3個以上、4個以上、5個以上或6個以上例如3個、4個、5 個或6個的抗TRAIL-R2單鏈抗體。
[0098] 針對TRAIL-R2的激動性抗體介由TRAIL-R2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此本發(fā)明的抗體可以 用作細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。
[0099] (3)功能性肽
[0100]上述融合蛋白質(zhì)中任意含有功能性肽。本說明書中"功能性肽"是指在生物體內(nèi)或 細(xì)胞內(nèi)具有特定的生物活性例如酶活性、催化活性、作為底物的功能或生物學(xué)抑制或增強(qiáng) 功能（例如，細(xì)胞毒活性）的肽。具體而言，例如可舉出熒光蛋白質(zhì)或發(fā)光蛋白質(zhì)、酶或外毒 素。
[0101 ]功能性肽的來源生物物種不限。另外，功能性肽可以為天然型或非天然型中的任 一種。天然型的功能性多肽是指自然界中存在的肽。另一方面，非天然型的功能性多肽是指 基于天然型的功能性多肽的氨基酸序列，在不喪失該功能性肽具所有的特有的功能的范圍 內(nèi)，在氨基酸序列中導(dǎo)入了適當(dāng)變異(進(jìn)行了氨基酸的添加、缺失、取代的變異)的修飾肽。
[0102] 上述融合蛋白質(zhì)中可以含有2個以上功能性肽。但是，含有多個功能性肽的情況 下，由于融合蛋白質(zhì)整體的分子量過大，因此可以將功能性肽的總分子量設(shè)為80kDa以下， 優(yōu)選設(shè)為40kDa以下。包含2個以上功能性肽的情況下，各個功能性肽的種類可以相同也可 以不同。例如可舉出將外毒素與酶或者外毒素與熒光蛋白質(zhì)或發(fā)光蛋白質(zhì)組合而成的功能 性肽。包含2個以上功能性肽的情況下，各個功能性肽可以直接連接，但優(yōu)選以各個功能性 肽能夠有效地發(fā)揮獨(dú)自的功能的方式用適當(dāng)?shù)倪B接肽連接。連接肽的長度、氨基酸序列只 要不阻礙功能性肽的功能，就沒有特別限定。通過在1個融合蛋白質(zhì)中包含2個以上的不同 的功能性肽，能夠?qū)捂溈贵w所識別的靶物質(zhì)賦予不同的功能。
[0103] 功能性肽只要在融合蛋白質(zhì)中在信號肽的C末端側(cè)，就沒有特別限制，但優(yōu)選配置 于上述單鏈抗體的C末端側(cè)。
[0104] 以下，對在本發(fā)明的重組細(xì)菌中可以作為功能性肽起作用的上述的熒光蛋白質(zhì)或 發(fā)光蛋白質(zhì)、酶、或者外毒素進(jìn)行具體說明。
[0105] (i)焚光蛋白質(zhì)或發(fā)光蛋白質(zhì)(標(biāo)記蛋白質(zhì)）
[0106] 對于作為功能性肽的熒光蛋白質(zhì)的種類，只要堿基序列已知，就沒有特別限定?？?以為上述天然型和非天然型中的任一種。但是，出于上述理由優(yōu)選氨基酸長度短的熒光蛋 白質(zhì)。另外，激發(fā)波長、熒光波長也沒有特別限定。這些波長根據(jù)情況和需要而適當(dāng)?shù)剡x擇 即可。作為具體的熒光蛋白質(zhì)，例如可舉出CFP、RFP、DsRed、YFP、PE、PerCP、APC、GFP等。
[0107] 另外，對于發(fā)光蛋白質(zhì)，也是只要堿基序列已知，其種類就沒有特別限定。與上述 熒光蛋白質(zhì)同樣，可以為天然型和非天然型中的任一種，但優(yōu)選氨基酸長度短的發(fā)光蛋白 質(zhì)。作為具體的發(fā)光蛋白質(zhì)，例如可舉出水母發(fā)光蛋白等。
[0108] (ii)酶
[0109] 對于作為功能性肽的酶的種類，只要堿基序列已知，就沒有特別限定?？梢詾榕c靶 物質(zhì)直接作用的酶，也可以是不與靶物質(zhì)直接作用而在其周邊發(fā)揮功能的酶。作為后者的 具體例，可舉出有助于發(fā)光的熒光素酶、過氧化物酶(例如，辣根過氧化物酶)等。在上述單 鏈抗體上連接有酶的融合蛋白質(zhì)可以作為免疫酶(Immunoenzyme)發(fā)揮功能。
[0110] (iii)外毒素
[0111] "外毒素"（Exotoxin)是指細(xì)菌分泌到菌體外的毒性蛋白質(zhì)。外毒素只要具有細(xì)胞 毒活性且其堿基序列已知，則其種類不限。例如可舉出綠膿桿菌毒素 (Pseudomonas toxin; PT)及其衍生物例如從PT除去了細(xì)胞粘接結(jié)構(gòu)域的外毒素 A、白喉毒素 (Diphtheria toxin: DT)及其衍生物以及蓖麻毒素（Ricin)及其衍生物（Brinkmann U.&Pastan 1.,1994, Biochimica et Biophysica Acta，1198(l):27_45)。已知綠胺桿菌外毒素 A被攝入到癌細(xì) 胞內(nèi)后，通過對EF-2進(jìn)行ADP核糖基化而失活來抑制蛋白質(zhì)合成，發(fā)揮較強(qiáng)的殺滅細(xì)胞效 果。在上述單鏈抗體上連接有外毒素的融合蛋白質(zhì)可以作為免疫毒素（Immunotoxin)發(fā)揮 功能。
[0112] 1-2-2.表達(dá)盒的構(gòu)成
[0113] 本說明書中"表達(dá)盒"是指含有上述融合基因并處于能夠?qū)⒃撊诤匣蜃鳛槿诤?蛋白質(zhì)表達(dá)的狀態(tài)的表達(dá)系統(tǒng)。本說明書中，"能表達(dá)的狀態(tài)"是指以該表達(dá)盒中含有的融 合基因能夠在重組細(xì)菌內(nèi)表達(dá)的方式配置在基因表達(dá)所需要的元件的控制下的狀態(tài)。基因 表達(dá)中需要的元件可舉出啟動子和終止子。
[0114] 啟動子只要是能夠在重組細(xì)菌內(nèi)工作的啟動子，就沒有特別限制，但優(yōu)選來自使 用的專性厭氧革蘭氏陽性菌的啟動子。例如，專性厭氧革蘭氏陽性菌使用雙歧桿菌的長雙 歧桿菌的情況下，可舉出長雙歧桿菌的hup基因啟動子(序列號25)。另外，啟動子中根據(jù)其 表達(dá)控制的性質(zhì)，已知有過表達(dá)型啟動子、組成型啟動子、位點(diǎn)特異性啟動子、階段特異性 啟動子或誘導(dǎo)型啟動子等。本發(fā)明中的表達(dá)盒中使用的啟動子是哪一種啟動子，沒有特別 限定。根據(jù)需要適當(dāng)?shù)剡x擇即可。優(yōu)選為過表達(dá)型啟動子或組成型啟動子。在上述表達(dá)盒 中，啟動子配置在上述融合基因的起始密碼子的上游的5'側(cè)。
[0115] 終止子只要是能夠在重組細(xì)菌內(nèi)終結(jié)由上述啟動子轉(zhuǎn)錄的基因的轉(zhuǎn)錄的序列，就 沒有特別限定。例如，可舉出組蛋白那樣的蛋白質(zhì)終止子(HUT)(序列號26)。優(yōu)選來自與啟 動子相同的生物物種的終止子，更優(yōu)選在啟動子的來源生物物種的基因組的基礎(chǔ)上與該啟 動子成組的終止子。在上述表達(dá)盒中，終止子配置在上述融合基因的終止密碼子的下游的 3,側(cè)。
[0116] 為了使上述融合蛋白質(zhì)在重組細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定地表達(dá)，可以將包含表達(dá)盒的載體作為 表達(dá)載體導(dǎo)入該菌體內(nèi)?；蛘?，也可以介由同源性重組而插入到該菌的基因組內(nèi)。使用表達(dá) 載體的情況下，載體可以使用質(zhì)粒等。載體使用含有能夠在本發(fā)明的重組細(xì)菌內(nèi)復(fù)制且在 菌體內(nèi)穩(wěn)定地保持的適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記基因的載體。載體可以是在大腸桿菌等其他細(xì)菌內(nèi)也 能夠復(fù)制的穿梭載體。例如可舉出pKKT427、pBESAF2、pPSABl等。插入到重組細(xì)菌的基因組 內(nèi)的情況下，可以僅將融合基因以成為可表達(dá)狀態(tài)的方式插入到重組細(xì)菌的基因組中。即， 可以在重組細(xì)菌的內(nèi)源性的啟動子、終止子的控制下插入融合基因。
[0117] 表達(dá)盒可以是在1個表達(dá)盒內(nèi)含有1個融合基因的單順反子，也可以是含有2個以 上融合基因的多順反子。
[0118] 1-3.重組專性厭氧革蘭氏陽性菌的制造方法
[0119] 本發(fā)明的重組細(xì)菌可以使用該領(lǐng)域中公知的分子遺傳學(xué)的方法來制造。例如，如 果為上述融合基因，則使用例如Green and Sambrook,Molecular Cloning,4th Ed(2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubelet al. , Short Protocols in Molecular Biology，3rd Ed·，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology( 1995)，John Wiley&Sons所記載的方法構(gòu)建分別編碼信號肽和單鏈抗 體的核酸即可。
[0120] 為了取得上述單鏈抗體，可以使用編碼與TRAIL-R1或TRAIL-R2結(jié)合的抗體的基因 的堿基序列信息。該抗體的堿基序列信息例如可以參照前述的CDR和FR的堿基序列。
[0121] 重新制作針對TRAIL-R1或TRAIL-R2的抗體的情況下，針對TRAIL-R1或TRAIL-R2的 單克隆抗體的制作根據(jù)在該領(lǐng)域內(nèi)公知的方法進(jìn)行即可。以下例示該制作例。
[0122] 將作為靶的TRAIL-R1或TRAIL-R2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域作為免疫原，給予駱駝科的動物 而進(jìn)行免疫。如果需要，可以添加佐劑以有效地進(jìn)行免疫。作為佐劑的例子，可舉出市售的 弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)等，可以將它們單獨(dú)使用或混合使用。免疫原溶 液的1次給藥量是相當(dāng)于每1只上述動物含有約50~200yg的免疫原即可。免疫的間隔沒有 特別限定，初次免疫后，以幾天到幾周間隔、優(yōu)選以1~4周間隔進(jìn)行2~10次、優(yōu)選5~7次追 加免疫。初次免疫之后，利用ELISA(Enzyme_Linked Immuno Sorbent Assay)法等反復(fù)進(jìn)行 免疫動物的血清中的抗體效價(jià)的測定。接著，從免疫的動物采取抗體產(chǎn)生細(xì)胞。作為抗體產(chǎn) 生細(xì)胞，可舉出脾臟細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、末梢血細(xì)胞等，優(yōu)選末梢血細(xì)胞。接下來，從末梢血 細(xì)胞提取RNA，使用寡聚dT引物和無規(guī)6mer引物合成cDNA。從該cDNA通過PCR擴(kuò)增駱駝科單 鏈抗體的可變區(qū)（V.區(qū)域）的基因，在pCANTAB6(McCafferty J.，et al.，1994， Appl.Biochem.Biotech. ,47,157-173)等噬菌粒載體上整合上述基因，用電穿孔法導(dǎo)入到 大腸桿菌TG1中。使M13K07輔助噬菌體感染上述的大腸桿菌TG1，回收噬菌體，由此取得駱駝 科單鏈抗體可變區(qū)(Vhh區(qū)域)表達(dá)噬菌體文庫。標(biāo)準(zhǔn)地成為1 X 107pfu種以上的文庫。
[0123] 為了挑選表達(dá)針對靶抗原的抗體的噬菌體而進(jìn)行生物淘選。上述生物淘選為如下 方法:使抗體噬菌體文庫與固定化的靶抗原反應(yīng)，通過清洗將未結(jié)合的噬菌體除去后，使結(jié) 合的噬菌體洗脫并感染大腸桿菌而增殖，將上述操作進(jìn)行3次至5次，由此濃縮相對于靶抗 原為特異性的噬菌體。使淘選的噬菌體再次感染大腸桿菌TG1后，將含有插入有V HH的 pCANTAB噬菌粒載體的TG1克隆分離，在各個TG1克隆中感染K07輔助噬菌體，得到展示Vhh抗 體的克隆化噬菌體。從其中選擇與抗原反應(yīng)的克隆。可以從取得的噬菌體中得到抗體的堿 基序列。
[0124] 融合基因使用分子遺傳學(xué)的方法以可表達(dá)的方式被插入上述表達(dá)盒內(nèi)。表達(dá)盒根 據(jù)需要而整合到例如質(zhì)粒等載體中。為了在載體中整合表達(dá)盒，可以采用以適當(dāng)?shù)南拗泼?切割表達(dá)盒的5 '末端和3'末端，在載體內(nèi)的多克隆位點(diǎn)等對應(yīng)的限制部位插入的方法等。 另外，載體是在本發(fā)明的重組細(xì)菌內(nèi)可表達(dá)的表達(dá)用載體的情況下，也可以通過將上述融 合基因插入到該表達(dá)用載體的表達(dá)控制區(qū)域內(nèi)（載體內(nèi)的啟動子和終止子間的多克隆位點(diǎn) 等），與構(gòu)建表達(dá)盒的同時構(gòu)建目標(biāo)表達(dá)載體。關(guān)于這些具體的方法，例如請參照上述Green and Sambrook(2012)中記載的方法。
[0125] 目標(biāo)重組細(xì)菌可以通過將上述表達(dá)載體、表達(dá)盒或融合基因?qū)氲阶鳛樗巹┻f送 載體的專性厭氧革蘭氏陽性菌中來制造。將表達(dá)載體等向目標(biāo)專性厭氧革蘭氏陽性菌內(nèi)導(dǎo) 入的方法使用該領(lǐng)域內(nèi)公知的分子生物學(xué)方法即可。例如可以使用電穿孔法 (e 1 ectroporation法）、磷酸鈣法這樣的公知的方法。關(guān)于這些具體的方法，例如請參考上 述Green and Sambrook(2012)中記載的方法。
[0126] 2.抗腫瘤劑
[0127] 2-1.概要
[0128] 本發(fā)明的第2方式為抗腫瘤劑。本發(fā)明中"抗腫瘤劑"是指對腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒 活性，使該細(xì)胞達(dá)到細(xì)胞凋亡，結(jié)果能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖的藥劑。但是，其藥效只要能 夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖即可，可以不根除腫瘤細(xì)胞。
[0129] 本發(fā)明的抗腫瘤劑的特征在于將第1方式的重組細(xì)菌作為有效成分。根據(jù)本發(fā)明 的抗腫瘤劑，通過作為有效成分的重組細(xì)菌僅在腫瘤內(nèi)增殖，在腫瘤內(nèi)分泌3個以上的抗 TRAIL-R1單鏈抗體和/或3個以上的抗TRAIL-R2單鏈抗體，能夠有效地誘導(dǎo)腫瘤的細(xì)胞凋 亡，使腫瘤萎縮。
[0130] 2-2.構(gòu)成
[0131] 本發(fā)明的抗腫瘤劑如上所述將第1方式的重組細(xì)菌作為有效成分。此時的重組細(xì) 菌的融合基因編碼如下單鏈抗體，即識別并結(jié)合TRAIL-R1的單鏈抗體和/或識別并結(jié)合 TRAIL-R2的單鏈抗體，TRAIL-R1和TRAIL-R2都是作為靶細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞的表面抗原中的一 種。因此，作為本發(fā)明的抗腫瘤劑的有效成分的重組細(xì)菌分泌細(xì)胞外分泌性抗腫瘤細(xì)胞融 合蛋白質(zhì)。
[0132] 成為本發(fā)明的抗腫瘤劑的靶標(biāo)的腫瘤只要是表達(dá)TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的腫 瘤，無論良性、惡性，可以為任一種腫瘤。作為靶腫瘤，例如可舉出腦腫瘤、甲狀腺癌、口腔 癌、食道癌、胃癌、大腸癌、咽喉癌、肺癌、肝癌、腎癌、腎上腺癌、胰腺癌、膽道癌、子宮頸癌、 子宮體癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、纖維肉瘤、肥大細(xì)胞瘤或黑色素瘤。
[0133] 本發(fā)明的重組細(xì)菌表達(dá)融合基因的情況下，作為其產(chǎn)物的細(xì)胞外分泌性抗腫瘤細(xì) 胞融合蛋白質(zhì)被分泌到細(xì)胞外。分泌的融合蛋白質(zhì)通過以單鏈抗體部分與作為靶物質(zhì)的腫 瘤細(xì)胞結(jié)合，將TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多聚化來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
[0134] 作為本發(fā)明的有效成分的重組細(xì)菌以活菌狀態(tài)被包含在抗腫瘤劑中。本發(fā)明的第 1方式中記載的重組細(xì)菌在高濃度的氧存在下不能增殖，不久滅絕。因此，在生物體內(nèi)，僅能 在氧分壓低的部位增殖、生存。作為這樣的部位的代表例，可舉出在進(jìn)行性癌中所看到的腫 瘤(實(shí)體癌）的中心部位或腸道內(nèi)。因此，本發(fā)明的抗腫瘤劑通過注射等進(jìn)行體內(nèi)給藥的情 況下，可以成為腫瘤選擇遞送性高的抗腫瘤劑。
[0135] 另外，本發(fā)明的抗腫瘤劑可以在不阻礙或抑制作為有效成分的重組細(xì)菌的生存、 增殖、融合蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌的范圍內(nèi)與其他抗腫瘤劑并用。
[0136] 本發(fā)明的抗腫瘤劑，以在活菌狀態(tài)下維持或保存重組細(xì)菌為前提，原則上可以用 該領(lǐng)域內(nèi)公知的方法進(jìn)行制劑化。例如，使用Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co.，Easton，Pa.)中記載的方法即可。具體的制劑化的方法因給藥方 法而不同。給藥方法大致區(qū)分為口服給藥和非口服給藥，但本發(fā)明的抗腫瘤劑的情況下，更 優(yōu)選非口服給藥。
[0137] 對本發(fā)明的抗腫瘤劑進(jìn)行非口服給藥時，作為其具體例，可舉出通過注射進(jìn)行給 藥。通過注射給予本發(fā)明的抗腫瘤劑時，可以制備成懸浮液劑的形式，即將重組細(xì)菌與制藥 上可允許的溶劑混合，根據(jù)需要加入制藥上可允許的擔(dān)載體而成。
[0138] "制藥上可允許的溶劑"可以為水或水以外的藥學(xué)上可允許的水溶液或者油性液 體中的任一種。作為水溶液，例如可舉出含有生理鹽水、葡萄糖、其他輔助劑的等張液。作為 輔助劑，例如可舉出D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉、另外還有低濃度的非離子型 表面活性劑（例如、聚山梨醇酯80(TM)、HC0-60)、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯類等。作 為油性液體，可舉出芝麻油、大豆油，也可以與作為增溶劑的苯甲酸芐酯或芐醇并用。另外， 也可以與緩沖劑例如磷酸鹽緩沖液、乙酸鈉緩沖液、無痛化劑例如鹽酸普魯卡因、穩(wěn)定劑例 如芐醇、苯酚、抗氧化劑配合。
[0139] 注射劑通過與制藥上允許的賦形劑、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié) 劑等適當(dāng)?shù)亟M合，以一般認(rèn)可的制藥實(shí)施所要求的單位用量形態(tài)混和來進(jìn)行制劑化即可。 [0140]注射可舉出例如血管內(nèi)注射、淋巴管內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射 等，但從作為本發(fā)明的抗腫瘤劑有效成分的重組細(xì)菌在腫瘤內(nèi)增殖、抑制該腫瘤細(xì)胞的增 殖的機(jī)理考慮，在腫瘤灶的位置不明確的情況下，優(yōu)選作為全身給藥的血管內(nèi)注射或淋巴 管內(nèi)注射等循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)給藥。血管內(nèi)注射有靜脈內(nèi)注射和動脈內(nèi)注射等，在給予本發(fā)明的 抗腫瘤劑時可以為任一種。另一方面，在腫瘤灶的位置確定的情況下，除上述全身給藥以 外，也可以是對腫瘤直接給藥的局部給藥。
[0141] 將本發(fā)明的抗腫瘤劑口服給藥的情況下，除了作為有效成分的重組細(xì)菌以外，可 以添加制藥上可允許的擔(dān)載體。
[0142] "制藥上可允許的擔(dān)載體"是指為了使藥劑的制劑化、對生物體的適用容易，且維 持作為有效成分的重組細(xì)菌的生存，在不阻礙或不抑制該菌體的作用的范圍內(nèi)添加的物 質(zhì)。例如可舉出賦形劑、粘合劑、崩解劑、填充劑、乳化劑、流動添加調(diào)節(jié)劑或潤滑劑。
[0143] 作為"賦形劑"，例如可舉出單糖、二糖類、環(huán)糊精和多糖類這樣的糖(具體而言，沒 有限定，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、糊精、麥芽糊精、淀粉和 纖維素）、金屬鹽(例如，磷酸鈉或磷酸鈣、硫酸鈣、硫酸鎂）、檸檬酸、酒石酸、甘氨酸、低、中、 高分子量的聚乙二醇(PEG)、普朗尼克、或者它們的組合。
[0144] 作為"粘合劑"，例如可舉出使用了玉米、小麥、稻米或馬鈴薯的淀粉而成的淀粉 糊、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯基吡咯烷 酬等。
[0145] 作為"崩解劑"，例如可舉出上述淀粉、羧甲基淀粉、交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂、 海藻酸或海藻酸鈉或者它們的鹽。
[0146] 作為"填充劑"，例如可舉出上述糖和/或磷酸鈣(例如，磷酸三鈣或磷酸氫鈣）。
[0147] 作為"乳化劑"，例如可舉出失水山梨糖醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸 酯、丙二醇脂肪酸酯。
[0148] 作為"流動添加調(diào)節(jié)劑"和"潤滑劑"，例如可舉出硅酸鹽、滑石、硬脂酸鹽或聚乙二 醇。
[0149] 此外，也可以根據(jù)需要含有矯味矯臭劑、懸浮劑、稀釋劑、表面活性劑、增量劑、賦 濕劑、保濕劑(例如，甘油、淀粉等）、吸附劑(例如，淀粉、乳糖、高嶺土、膨潤土、膠體狀硅酸 等）、崩解抑制劑(例如，白糖、硬脂、可可脂、氫化油等）、涂布劑、著色劑、保存劑、抗氧化劑、 香料、調(diào)味劑、甜味劑、緩沖劑等。根據(jù)需要適當(dāng)?shù)厥褂蒙鲜龅膿?dān)載體的一種或二種以上即 可。
[0150] 作為經(jīng)口疫苗劑的劑型，例如，可以舉出固體劑型(包括片劑、丸劑、舌下劑、膠囊 劑、滴劑）、顆粒劑、粉劑、散劑、液劑等。此外，固體劑型可以根據(jù)需要制成實(shí)施了該領(lǐng)域內(nèi) 公知的包衣的劑型，例如糖衣片、明膠包衣片、腸溶片、膜包衣片、雙層片、多層片。劑型的具 體形狀、大小只要都是各自的劑型在該領(lǐng)域內(nèi)公知的劑型的范圍內(nèi)即可，沒有特別限定。
[0151] 本發(fā)明的抗腫瘤劑中的重組細(xì)菌的含量原則上是按1次給藥可達(dá)到該菌體能夠在 靶腫瘤中生存且增殖的狀態(tài)的量，且對應(yīng)用該重組細(xì)菌的受試者幾乎或完全沒有有害的副 作用的量即可。這樣的含量因抗腫瘤劑的靶細(xì)胞的種類、癌的進(jìn)行度、腫瘤的大小、全身的 腫瘤灶數(shù)、抗腫瘤劑的劑型和給藥方法而不同，因此考察各自的條件而適當(dāng)?shù)貨Q定。
[0152] 本說明書的抗腫瘤劑的給藥對象是具有腫瘤或具有腫瘤可能性高的受試者。本說 明書中"受試者"是指適用本發(fā)明的抗腫瘤劑的動物。例如哺乳動物，優(yōu)選為人、狗、貓、馬、 小鼠、大鼠、兔子、牛、猴子等，更優(yōu)選為人。
[0153] 2-3.效果
[0154] 根據(jù)本發(fā)明的抗腫瘤劑，作為有效成分的重組細(xì)菌僅在氧分壓低的腫瘤內(nèi)生存和 增殖，分泌抗腫瘤細(xì)胞融合蛋白質(zhì)。因此，可以將該融合蛋白質(zhì)有效地傳導(dǎo)到腫瘤細(xì)胞，且 繼續(xù)起作用。另外，通過融合蛋白質(zhì)的作用而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，腫瘤萎縮，由此組織中 的氧分壓高時，屬于專性厭氧革蘭氏陽性菌的重組細(xì)菌無法生存，因此能夠從生物體內(nèi)自 動地排除。由此，能夠提供一種與以往的細(xì)菌療法相比，在利用非病原性的專性厭氧菌在不 對實(shí)體癌給予其他抗腫瘤藥的情況下，通過單獨(dú)向靜脈內(nèi)給藥而能發(fā)揮抗腫瘤效果的安全 且簡便的治療方法。
[0155] 另外，本發(fā)明的抗腫瘤劑可以靜脈內(nèi)注射，因此具有對受試者的侵襲性也低的優(yōu) 點(diǎn)。
[0156] 3.腫瘤檢測用標(biāo)記物
[0157] 3-1.概要
[0158] 本發(fā)明的第3方式為腫瘤檢測用標(biāo)記物。本發(fā)明中"腫瘤檢測用標(biāo)記物"是指能夠 在生物體內(nèi)檢測腫瘤的標(biāo)記物。
[0159] 本發(fā)明的腫瘤檢測用標(biāo)記物的特征在于將第1方式的重組細(xì)菌作為有效成分。根 據(jù)本發(fā)明的腫瘤檢測用標(biāo)記物，作為有效成分的重組細(xì)菌僅在腫瘤內(nèi)增殖，在腫瘤內(nèi)分泌 酶、熒光蛋白質(zhì)或發(fā)光蛋白質(zhì)，由此能夠監(jiān)控生物體內(nèi)的腫瘤的位置、大小。
[0160] 3-2.構(gòu)成
[0161] 基本的構(gòu)成遵循第2方式的抗腫瘤劑。因此，這里主要對與上述抗腫瘤劑不同的方 面進(jìn)行說明，對于重復(fù)的構(gòu)成，原則上省略。
[0162] 本發(fā)明的腫瘤檢測用標(biāo)記物如上所述將第1方式的重組細(xì)菌作為有效成分。此時 的重組細(xì)菌的融合基因編碼識別作為靶細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞的表面抗原并與其結(jié)合的單鏈抗 體，編碼功能性肽為標(biāo)記蛋白質(zhì)或誘導(dǎo)標(biāo)記化的蛋白質(zhì)。作為標(biāo)記蛋白質(zhì)，例如可舉出前述 的熒光蛋白質(zhì)或發(fā)光蛋白質(zhì)。另外，作為誘導(dǎo)標(biāo)記化的蛋白質(zhì)，可舉出以熒光素、魯米諾這 樣的發(fā)光素或熒光素為底物的酶(熒光素酶、過氧化物酶）。因此，作為本發(fā)明的腫瘤檢測用 標(biāo)記物的有效成分的重組細(xì)菌分泌細(xì)胞外分泌性抗腫瘤細(xì)胞免疫標(biāo)記物(免疫標(biāo)記物）。
[0163] 本發(fā)明的重組細(xì)菌表達(dá)融合基因時，作為其產(chǎn)物的細(xì)胞外分泌性抗腫瘤細(xì)胞免疫 標(biāo)記物被分泌到細(xì)胞外。分泌的免疫標(biāo)記物在單鏈抗體部分與作為靶物質(zhì)的腫瘤細(xì)胞的細(xì) 胞膜上的TRAIL-R1或TRAIL-R2結(jié)合，該細(xì)胞被標(biāo)記化。具體而言，功能性肽為發(fā)光蛋白質(zhì)或 熒光蛋白質(zhì)這樣的標(biāo)記蛋白質(zhì)的情況下，腫瘤細(xì)胞被與單鏈抗體部分連接的這些標(biāo)記蛋白 質(zhì)直接標(biāo)記。另一方面，功能性肽為酶的情況下，腫瘤細(xì)胞被與單鏈抗體部分連接的酶進(jìn)行 酶標(biāo)記。
[0164] 本發(fā)明的腫瘤檢測用標(biāo)記物可以與第2方式的抗腫瘤劑并用。此時，作為有效成分 的重組細(xì)菌可以是將腫瘤檢測用標(biāo)記物和抗腫瘤劑作為各自獨(dú)立的分子進(jìn)行分泌的、即分 泌含有識別相同靶物質(zhì)的單鏈抗體的不同融合蛋白質(zhì)的、相同的或不同的重組細(xì)菌，也可 以是分泌在功能性蛋白質(zhì)部分含有外毒素和標(biāo)記蛋白質(zhì)或酶的1種融合蛋白質(zhì)的重組細(xì) 菌。這些情況下，能夠在對相同的腫瘤細(xì)胞標(biāo)記化的同時，利用外毒素的作用來毒殺腫瘤細(xì) 胞。
[0165] 另外，也可以在不阻礙或抑制作為有效成分的重組細(xì)菌的生存、增殖、免疫標(biāo)記物 的表達(dá)和分泌的范圍內(nèi)，與其他抗腫瘤劑并用。
[0166] 3-3.檢測
[0167] 將本發(fā)明的腫瘤檢測用標(biāo)記物給予受試者的情況下，如果該個體具有腫瘤，則作 為有效成分的重組細(xì)菌在該腫瘤內(nèi)增殖，分泌抗腫瘤細(xì)胞免疫標(biāo)記物。分泌的免疫標(biāo)記物 將腫瘤細(xì)胞標(biāo)記化。對于標(biāo)記化的腫瘤細(xì)胞的檢測，在免疫標(biāo)記物為發(fā)光蛋白質(zhì)或熒光蛋 白質(zhì)這樣的標(biāo)記蛋白質(zhì)的情況下，檢測該標(biāo)記蛋白質(zhì)自身發(fā)出的發(fā)光或熒光即可，另外，在 免疫標(biāo)記物為酶標(biāo)記的情況下，檢測給予至生物體內(nèi)的熒光素等底物的由酶反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā) 光或熒光即可。免疫標(biāo)記物的檢測方法沒有特別限定。由于大多腫瘤存在于生物體內(nèi)部，因 此可以在通過開腹等手術(shù)使腫瘤露出后檢測免疫標(biāo)記物，也可以從體外非侵襲地檢測生物 體內(nèi)的發(fā)光或熒光。優(yōu)選為從體外檢測的方法。作為從體外檢測來自免疫標(biāo)記物的發(fā)光或 焚光的方法，沒有限定，但例如可以使用體內(nèi)生物影像法?？梢允褂美鏚a t z，M. H. e t a 1.， 2003,Cancer Res .63:5521-5525, Schmitt,C.A.et al.,2002,Cancer Cell,1:289-298, Katz al · ,2003, J. Surg.Res · , 113:151-160等中記載的方法進(jìn)行檢測?？梢岳檬?售的IVIS Imaging System(Caliper)、與其類似的裝置進(jìn)行檢測。
[0168] 3-4.效果
[0169] 根據(jù)本發(fā)明的腫瘤檢測用標(biāo)記物，可以基于免疫標(biāo)記物從生物體外部監(jiān)控生物體 內(nèi)的腫瘤的位置和大小。另外，通過并用本發(fā)明的腫瘤檢測用標(biāo)記物和第2方式的抗腫瘤 劑，從而在利用免疫毒素抑制腫瘤細(xì)胞的增殖的同時，利用免疫標(biāo)記物從生物體外部檢測 生物體內(nèi)的腫瘤，由此能夠經(jīng)時監(jiān)控腫瘤的萎縮、治愈效果。
[0170] 實(shí)施例
[0171] <實(shí)施例1:雙歧桿菌表達(dá)用抗人TRAIL-R2基因表達(dá)盒的制作>
[0172] (1)雙歧桿菌表達(dá)用抗hTRAIL-R2VHH抗體4聚體(4E6四聚體)的基因表達(dá)盒 [0173]對以下基因進(jìn)行DNA合成(序列號1)，即，使用來自長雙歧桿菌hup基因的啟動子區(qū) 域(序列號25)、來自長雙歧桿菌的usp分泌信號序列（序列號29)、DTY(信號序列后插入序 列）、W0/2011/098520中記載的4E6的氨基酸序列、來自8C7EGFP基因的（GGSGG) 2連接肽(序 列號28)和來自組蛋白樣蛋白質(zhì)的終止子(HUT)(序列號26)，在C末端添加編碼His-Tag序列 的 DNA。
[0174] (2)雙歧桿菌表達(dá)用抗hTRAIL-R2VHH抗體二聚體綠膿桿菌外毒素 A亞單位融合體 (4E6二聚體Toxin)的基因表達(dá)盒
[0175] 對以下基因進(jìn)行DNA合成(序列號2)，即，使用來自長雙歧桿菌hup基因的啟動子區(qū) 域(序列號25)、來自長雙歧桿菌的usp分泌信號序列（序列號29)、DTY(信號序列后插入序 列）、W0/2011/098520中記載的4E6的氨基酸序列、來自8C7EGFP基因的（GGSGG) 2連接肽(序 列號28)、綠膿桿菌外毒素 A(被pJH8(從ATCC購入)編碼的ExotoxinA的DNA序列）和來自組蛋 白樣蛋白質(zhì)的終止子(HUT)(序列號26)，在C末端添加編碼His-Tag序列的DNA。
[0176] (3)雙歧桿菌表達(dá)用抗hTRAIL-R2VHH抗體二聚體綠色熒光蛋白質(zhì)融合體(4E6二聚 體EGFP)的基因表達(dá)盒
[0177] 使用來自長雙歧桿菌hup基因的啟動子區(qū)域(序列號25)、來自長雙歧桿菌的usp分 泌信號序列（序列號29)、DTY(信號序列后插入序列）和來自組蛋白樣蛋白質(zhì)的終止子(HUT) (序列號26)，在4E6二聚體基因的3'末端添加編碼來自8C7EGFP基因的（GGSGG) 2連接肽(序 列號28)+EGFP(Zhang G.et al.，1996，Biochem Biophys Res Commun,227(3) :707-711)基 因+His-Tag序列的DNA序列（序列號3)。
[0178] <實(shí)施例2: hTRAIL-Rl: Fc，hTRAIL-R2: Fc，mTRAIL-R2: Fc分泌表達(dá)果蠅培養(yǎng)細(xì)胞 的制作和重組蛋白質(zhì)的純化>
[0179] (1)基因表達(dá)盒的制作
[0180] (1-1)果蠅培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)用人TRAIL-R1:羊駝Fc(hTRAIL-Rl:Fc)的基因表達(dá)盒 [0181 ]合成由ΚρηΙ位點(diǎn)、翻譯起始共有序列（Cavener D · R ·，1987，Nucleic Acids Res. 15，1353-1361 )、Bip 分泌信號（Life Technologies)、hTRAIL-Rl細(xì)胞外區(qū)域 (Accession No.AAC51226,109~239氨基酸）、IEGRMD接頭（序列號27)、羊駝（alpaca) IgGlFc(Accession Ν〇·ΑΜ773729，102~335氨基酸）、His-Tag序列、終止密碼子和Xhol位點(diǎn) 構(gòu)成的DNAJ序列號4)
[0182] (1-2)果蠅培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)用人TRAIL-R2:羊駝Fc(hTRAIL-R2:Fc)的基因表達(dá)盒
[0183] 合成由ΚρηΙ位點(diǎn)、翻譯起始共有序列（Cavener D · R ·，1987，Nucl ei c Acids Res. 15，1353-1361 )、Bip 分泌信號（Life Technologies)、hTRAIL-R2 細(xì)胞外區(qū)域 (Accession No.Q6FH58,54~182氨基酸）、IEGRMD接頭（序列號27)，羊駝(alpaca)IgGIFc (Accession No.AM773729,102~335氨基酸）、His-Tag序列、終止密碼子和Xhol位點(diǎn)構(gòu)成的 DNAJ序列號5)
[0184] (1-3)果蠅培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)用小鼠 TRAIL-R2:羊駝Fc(mTRAIL-R2:Fc)的基因表達(dá)盒
[0185] 合成由ΚρηΙ位點(diǎn)、翻譯起始共有序列（Cavener D · R ·，1987，Nucl ei c Acids Res. 15，1353-1361 )、Bip 分泌信號（Life Technologies)、mTRAIL-R2 細(xì)胞外區(qū)域 (Accession No.Q9QZM4,52~177氨基酸）、IEGRMD接頭（序列號27)、羊駝(alpaca)IgGIFc (Accession No.AM773729,102~335氨基酸）、His-Tag序列、終止密碼子和Xhol位點(diǎn)構(gòu)成的 DNAJ序列號6)
[0186] (2)hTRAIL-Rl:Fc，hTRAIL-R2:Fc，mTRAIL-R2:Fc 分泌表達(dá)果蠅培養(yǎng)細(xì)胞的制作和 重組蛋白質(zhì)的純化
[0187] 為了得到融合了 hTRAIL-Rl、hTRAIL-R2、mTRAIL-R2的細(xì)胞外區(qū)域和羊駝IgGl的Fc 的蛋白質(zhì)，制作在作為果蠅培養(yǎng)細(xì)胞的S2細(xì)胞中分泌表達(dá)這些重組蛋白質(zhì)的載體pAc5.1/ 11丁1^11^-1?卟。、？厶。5.1/1^1^11^-1?2卩。、？厶。5.1/11^1^11^-1?2卩。。在？厶。5.1八5-^8厶質(zhì)粒（1^& Technologies)的Kpnl、XhoI位點(diǎn)插入重組蛋白質(zhì)的S2分泌表達(dá)基因盒。通過磷酸f丐法，以 與含有潮霉素抗性基因的pCoHygro質(zhì)粒(Life Technologies)為19:1的比例導(dǎo)入到S2細(xì)胞 中。細(xì)胞在含有300yg/mL潮霉素 （Life Technologies)、10%胎牛血清（Tissue Culture Biologicals)的Schneider ' s果繩培養(yǎng)基(Life Technologies)中培養(yǎng)，得到耐藥細(xì)胞。耐 藥細(xì)胞（IX 107細(xì)胞/mL)在含有20mM谷氨酰胺的EXPRESS FIVE SFM(Life Technologies) 中培養(yǎng)，第7天回收培養(yǎng)上清液。重組蛋白質(zhì)使用TALON樹脂(TAKARA BIO)進(jìn)行純化。具體而 言，在填充有TAL0N樹脂的柱中添加培養(yǎng)上清液后，用清洗緩沖液(25mM HEPES pH7.4、0.3M NaCl、5mM咪唑）清洗，用洗脫緩沖液（25mM HEPES pH7.4、0.3M NaCl、150mM咪唑）洗脫重組 蛋白質(zhì)。純化蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-聚丙稀酰胺電泳，用Coomassie Brilliant Blue (CBB)R_250 (Bio-Rad)染色，確認(rèn)各蛋白質(zhì)的純化(圖4)。
[0188] <實(shí)施例3:E.coli BL21(DE3)中的重組4E6單體蛋白質(zhì)的表達(dá)?純化和結(jié)合活性 >
[0189] (1)大腸桿菌表達(dá)用抗hTRAIL_R2VHH抗體/Myc-Tag(4E6單體)基因表達(dá)盒的制作
[0190] 根據(jù)W0/2011/098520中記載的4E6VHH單體的氨基酸序列信息，對大腸桿菌表達(dá)用 的基因進(jìn)行DNA合成(序列號7)。
[0191] (2)4E6單體的利用大腸桿菌的表達(dá)?純化
[0192] 表達(dá)4E6單體的載體插入到pET22b( + )的Nde和Notl部位。向E.coli BL21Star? (DE3)0ne Shot (Life technologies)中導(dǎo)入該表達(dá)載體質(zhì)粒DNA。根據(jù)附屬手冊使用100mL 的加入了 l〇〇yg/mL安比西林(Sigma-Aldrich)的2YT培養(yǎng)基在37°C下培養(yǎng)重組大腸桿菌，達(dá) 到0D6q() = 0.4~0.5時，添加0.5mM IPTG(異丙基-β-硫代半乳糖苷，TAKARA ΒΙ0)在30°C下培 養(yǎng)3小時。培養(yǎng)結(jié)束后，回收大腸桿菌，再次懸浮于10mL的提取緩沖液(50mM磷酸鈉 pH7.8， 300mM NaCl，EDTA_Free蛋白酶抑制劑混合物（protease inhibitor cocktail)(Roche))。 在冰中使用Sonifier 250(Branson)，以O(shè)utput Control 2、Duty cycle 80% 的條件進(jìn)行2 次1分鐘的超聲波處理，粉碎菌體。以15000rpm在4°C對處理后的懸浮液離心20分鐘，回收上 清液。融合蛋白質(zhì)的純化使用His Trap柱(GE Healthcare UK)。將超聲波處理懸浮液的離 心上清液直接通過His Trap柱，用結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉、0.5M NaCl、20mM咪唑pH7.4)清 洗柱子后，用含有500mM咪唑的洗脫液洗脫融合蛋白質(zhì)。將純化樣品供于15%丙烯酰胺SDS 電泳，用CBB染色，確認(rèn)純化到約15KDa的4E6單體蛋白質(zhì)，與BSA(牛血清白蛋白蛋白質(zhì)）的染 色相比，計(jì)算4E6單體的濃度。其結(jié)果，4E6單體的濃度為~3ygAU(圖5)。
[0193] (3)通過ELISA確認(rèn)4E6單體對hTRAIL-R2:Fc抗原的結(jié)合活性
[0194] hTRAIL-R2:Fc像實(shí)施例2那樣進(jìn)行制備。在96孔免疫板(Nunc)中以50yL/孔添加 0.1Μ NaHC03(Blank)、或含有l(wèi)yg/mL或 10yg/mL的BSA的0.1Μ NaHC03(BSA陰性抗原）、或含有 lyg/mL或 10yg/mL的hTRAIL-R2: Fc的0 · 1M NaHC03，在4°C放置一晚。向其中加入350yL/孔的 SuperBlock-PBS(Thermo 3(^611衍打(3)在室溫下放置1小時。用40(^17孔的？85-1'(含有 0.05%Tween20的磷酸緩沖生理鹽水）清洗后，加入40μL/孔的含有l(wèi)μg/mL的4E6單體的 SuperBlock-roS，在室溫下反應(yīng)1小時。再次，用400yL/孔的roS-T清洗3次，加入40yL/孔的 以SuperBlock-PBS稀釋了 500倍的抗Myc小鼠單克隆抗體9E10(Santa Cruz Biotechnology)，在室溫下反應(yīng)1小時。用400yL/孔的PBS-T清洗3次，以40yL/孔加入抗小鼠 IgG山羊抗體HRP，室溫下放置1小時。其后，用400yL/孔的PBS-T清洗3次，以50yL/孔加入ΤΜΒ 試劑(和光純藥），反應(yīng)10分鐘左右后，用〇. 5Μ硫酸使反應(yīng)停止。其后，測定450nm的吸光度， 計(jì)算以重復(fù)三次進(jìn)行的測定的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。純化的4E6單體蛋白質(zhì)與hTRAIL-R2: Fc 特異性結(jié)合(圖6)。
[0195] (4)4E6單體與hTRAIL_R2ECD(細(xì)胞外區(qū)域，extracellular domain)的解離常數(shù) (KD)的測定
[0196] 通過使用了Biacore X_100(GE Healthcare)的表面等離子共振法對4E6單體與 hTRAIL-R2:Fc(參照實(shí)施例2)的結(jié)合親和性進(jìn)行解析。測定根據(jù)Biacore X-100所附的說明 書按照多循環(huán)動力學(xué)（7少于f彳夕少力彳氺于4夕只）法進(jìn)行，在〇 · 919nM、1 · 838nM、 3 · 675nM、7 · 35nM、14 · 7nM、29 · 4nM、58 · 8nM 和117 · 6nM 對 4E6 單體進(jìn)行測定。
[0197] 將各濃度下的傳感圖和擬合曲線示于圖7 3E6單體與重組人TRAIL-R2:Fc抗原的 Kd 值為7·5Χ10-ηΜ。
[0198] <實(shí)施例4:新型抗hTRAIL-RIVHH抗體(4Ρ6單體)的取得>
[0199] (1)新型抗hTRAIL-RIVHH抗體(4P6單體)基因的分離
[0200] 抗TRAIL-R1VHH抗體在此之前并不為人所知，因此通過以下方法制作。即，參考由 Maass等發(fā)表的文獻(xiàn)（J Immunol Methods ·，2007，324，13-25)，通過菌體展示法對與 hTRAIL-Rl:人Fc(R&D Systems)結(jié)合的VHH抗體基因進(jìn)行分離。將100yg的hTRAIL-Rl:羊駝 Fc每隔1~2周對羊駝免疫6次，8周后，回收白細(xì)胞，使用RNeasy(Qiagen，Venlo， Netherland)提取RNA。利用PrimeScriptll lststrand cDNA synthesis kit(TAKARA BIO) 由該RNA使用寡聚dT引物、無規(guī)6引物合成cDNAjHH抗體基因利用PrimeSTAR GXL DNA polymerase(TAKARA BIO)以將95°C1 分鐘進(jìn)行 1 個循環(huán)，將98°C10秒、55°C15秒、68°C1 分鐘 進(jìn)行25個循環(huán)的方式進(jìn)行PCR而擴(kuò)增。對于該擴(kuò)增產(chǎn)物，以將95°C1分鐘進(jìn)行1個循環(huán)，將98 °C 10秒、60 °C 15秒、68 °C 1分鐘進(jìn)行20個循環(huán)的方式同樣地進(jìn)行PCR，擴(kuò)增抗體基因。PCR使用 具有引物DNA序列1 (序列號8)和引物DNA序列2(序列號9)的DNA序列的引物。分離的抗體基 因的序列（4P6)使用BigDye Terminator v3.1 (Life Technologies)，通過循環(huán)測序法確 定。其結(jié)果，分離的抗體的CDR1具有由序列號22表示的氨基酸序列，CDR2具有由序列號23表 示的氨基酸序列和CDR3具有由序列號24表示的氨基酸序列。
[0201 ] (2)果蠅培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)用4P6單體基因表達(dá)盒的制作
[0202] 合成由ΚρηΙ位點(diǎn)、翻譯起始共有序列（Cavener D · R ·，1987，Nucleic Acids Res · 15，1353-1361)、Bip分泌信號（Life Technologies)、4P6基因、His_Tag序列、Myc-Tag 序列、終止密碼子和Xhol位點(diǎn)構(gòu)成的DNA。
[0203] (3)抗hTRAIL-RIVHH抗體單體(4P6單體)分泌表達(dá)果蠅培養(yǎng)細(xì)胞的制作和重組蛋 白質(zhì)的純化
[0204] 通過在pAc5· l/V5_HisA質(zhì)粒(Life Technologies)的Kpnl、XhoI位點(diǎn)之間插入上 述（2)的基因表達(dá)盒，制成在作為果蠅培養(yǎng)細(xì)胞的S2細(xì)胞中分泌表達(dá)4P6單體的載體 pAc5.1/4P6單體。利用磷酸鈣法將該質(zhì)粒以與含有潮霉素抗性基因的pCoHygro質(zhì)粒為19:1 的比例導(dǎo)入到S2細(xì)胞中。細(xì)胞在含有300yg/mL潮霉素 (Life Technologies)、10%胎牛血清 的Schneider ' s果繩培養(yǎng)基(Life Technologies)中培養(yǎng)，得到耐藥細(xì)胞。耐藥細(xì)胞在含有 20mM谷氨酰胺的EXPRESS FIVE SFM(Life Technologies)中培養(yǎng)，得到培養(yǎng)上清液。4P6單 體通過HisTrap柱(GE Healthcare)進(jìn)行純化。純化蛋白質(zhì)進(jìn)行12.5%SDS-聚丙稀酰胺電 泳，用Oriο 1 e熒光凝膠染料(Bio-Rad)染色（圖8)。
[0205] <實(shí)施例5:抗hTRAIL-RIVHH抗體單體(4P6單體)的結(jié)合特異性和與hTRAIL-Rl的 親和性的測定>
[0206] (1 )4P6單體和4E6單體的由ELISA得到的結(jié)合特異性的解析
[0207] 通過ELISA研究4P6單體與TRAIL-R1選擇性結(jié)合的情況。向96孔的Nunc免疫板 (Thermo Scientific)中加入 50yL 的溶解于 0· 1M NaHC03 的 lyg/mL 的 hTRAIL-Rl :Fc， hTRAIL_R2 :Fc、mTRAIL_R2 :Fc(參照實(shí)施例2)、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin)，在4 °(：放置一晚。加入300yL的SuperBlock(TBS)封閉緩沖液(Thermo Scientific)，室溫下放置 1小時。除去各孔的溶液后，以50yL/孔加入以10yg/mL溶解于封閉緩沖液的4P6單體或4E6單 體，室溫下放置1小時。用含有0 · 05 %TWeen20的PBS清洗3次后，加入50yL的以67ng/mL溶解 于封閉緩沖液的9E10抗Myc抗體(Santa Cruz Biotechnology)，室溫下放置1小時。清洗3次 后，加入50yL的溶解于封閉緩沖液的抗小鼠 IgG HRP，室溫下放置1小時。清洗3次后，加入50 yL的TMB溶液(和光純藥），室溫下放置10分鐘。加入50yL的0.5M硫酸，測定450nm的吸光度。 每2個孔對各樣品進(jìn)行解析，計(jì)算測定值的平均值和誤差?？梢源_認(rèn)4P6單體與hTRAIL-Rl特 異性結(jié)合，4E6單體與hTRAIL-R2特異性結(jié)合(圖9)。
[0208] (2)抗 hTRAIL-RIVHH 抗體單體（4P6 單體）與 hTRAIL-Rl ECD(細(xì)胞外區(qū)域， extracellular domain)的解離常數(shù)的測定
[0209] 通過使用了Biacore X_100(GE Healthcare)的表面等離子共振法對4P6單體與重 組人TRAIL-R1ECD的結(jié)合親和性進(jìn)行解析。將hTRAIL-Rl:Fc(hTRAIL-Rl:Fc，參照實(shí)施例2) 以約1000RU固定于傳感芯片(CM5)。測定按照BiacoreX-100所附的說明書用單循環(huán)動力（シ ^夕、、少^'彳夕少力彳氺于彳夕只）法進(jìn)行，按0 · ΙηΜ、0 · 5nM、2 · 5nM、12 · 5nM、62 · 5nM的順序連 續(xù)添加4P6單體進(jìn)行測定。將傳感圖和擬合曲線示于圖HLKd值(解離常數(shù))為3.4Χ10-ηΜ。 [0 210] ⑶4Ρ6單體和4Ε6單體的拮抗活性
[0211 ] 對4Ρ6單體是否與癌細(xì)胞的hTRAIL-Rl結(jié)合、對誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的hTRAIL顯示詰抗活 性進(jìn)行解析。將人大腸癌Col〇205細(xì)胞懸浮在添加有10 %胎牛血清（Tissue Culture Biologicals)的RPMI1640培養(yǎng)基（Sigma)中，以3X103cells/50yL培養(yǎng)基/孔向Falcon 96 孔培養(yǎng)板（Beeton Dickinson)中加入細(xì)胞。培養(yǎng)一晚，添加各50yL的終濃度100ng/mL的 TRAIL和以各種濃度含有4P6單體、抗hTRAIL-R2 VHH抗體(4E6單體)的培養(yǎng)基。再培養(yǎng)一晚， 加入10yL的活細(xì)胞數(shù)量測定試劑SF(Nacalai Tesque)，培養(yǎng)2小時后測定450nm的吸光度。 將未加入細(xì)胞的只是培養(yǎng)基的孔作為背景扣除。將僅有細(xì)胞的孔設(shè)為100%，將其相對值作 為數(shù)據(jù)。由各濃度3個孔的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。如圖11所示，4P6單體、4E6單體單獨(dú)無法 抑制由TRAIL所致的細(xì)胞死亡。但是，同時加入4P6單體和4E6單體時，用量依賴性地抑制細(xì) 胞死亡。由于hTRAIL、4P6單體、4E6單體的分子量幾乎相等，因此VHH抗體100ng/mL與 hTRAIL100ng/mL的摩爾濃度幾乎相等。根據(jù)以上結(jié)果，顯示4P6單體、4E6單體不僅分別與細(xì) 胞表面的hTRAIL-Rl、hTRAIL-R2結(jié)合，還作為拮抗劑起作用。
[0212] 如此，能夠取得與hTRAIL-Rl特異性結(jié)合、還可以作為拮抗劑起作用的新型抗體 4P6〇
[0213] <實(shí)施例6:4E6二聚體Toxin、4E6二聚體EGFP和4E6四聚體、重組E.coli BL21 (DE3)的制作和重組蛋白質(zhì)的表達(dá)?純化>
[0214] (1)基因表達(dá)盒的制作
[0215] (1-1)大腸桿菌表達(dá)用抗hTRAIL-R2VHH抗體二聚體綠膿桿菌外毒素 A亞單位融合 體(4E6二聚體Toxin)基因表達(dá)盒的制作
[0216] 大腸桿菌表達(dá)用4E6二聚體Toxin基因，以插入到pBluescriptII( + )質(zhì)粒的雙歧桿 菌表達(dá)用4E6二聚體Toxin基因表達(dá)盒(序列號2)作為模板，使用引物DNA序列5(序列號12) 和6(序列號13)進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。PCR的條件是使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(TAKARA BI0)作為DNA聚合酶以將95°C1分鐘進(jìn)行1個循環(huán)，將98°C10秒、60°C15秒、68°C2分鐘進(jìn)行25 個循環(huán)的方式實(shí)施。擴(kuò)增產(chǎn)物使用MinElute柱(Qiagen)根據(jù)附加的協(xié)議進(jìn)行純化，用Ndel 和Notl進(jìn)行限制酶消化后，用1.2%瓊脂糖進(jìn)行電泳，從凝膠中切出目標(biāo)條帶，使用DNA凝膠 提取試劑盒(Qiagen)根據(jù)附加的協(xié)議進(jìn)行純化分離。將其插入到pET_22b( + )(Novagen)的 Ndel和Notl部位，構(gòu)建如下的4E6二聚體Toxin(圖12a)，即，在N末端具有Strep Tag (Schmidt T.G.，Skerra A.，2007，Nat Protoc.2(6):1528-1535)，用（GGSGG)2連接肽（序列 號28)連接2個VHH單體彼此，介由Xbal序列（SerArg)使綠膿桿菌外毒素亞單位A(Toxin)與 4E6二聚體的C末端結(jié)合。
[0217] (1-2)大腸桿菌表達(dá)用抗hTRAIL-R2VHH抗體二聚體綠色熒光蛋白質(zhì)融合體(4E6二 聚體EGFP)基因表達(dá)盒的制作
[0218] 大腸桿菌表達(dá)用4E6二聚體EGFP基因，以插入到pBluescriptII( + )質(zhì)粒中的雙歧 桿菌表達(dá)用4E6二聚體Toxin基因表達(dá)盒（序列號3)作為模板，使用引物DNA序列5(序列號 12)和7(序列號14)進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。PCR的條件是使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (TAKARA BIO)作為DNA聚合酶，以將95°C 1分鐘進(jìn)行1個循環(huán)，將98°C 10秒、60°C 15秒、68°C2 分鐘進(jìn)行25個循環(huán)的方式實(shí)施。擴(kuò)增產(chǎn)物使用MinElute柱(Qiagen)根據(jù)附加的協(xié)議進(jìn)行純 化，用Ndel和Notl進(jìn)行限制酶消化后，用1.2%瓊脂糖進(jìn)行電泳，從凝膠切出目標(biāo)條帶，使用 DNA凝膠提取試劑盒（Qiagen)根據(jù)附加的協(xié)議進(jìn)行純化分離。將其插入到pET-22b( + ) (Novagen)的Ndel和Notl部位，構(gòu)建如下的4E6二聚體EGFP(圖12b)，即，在N末端具有Strep Tag，用(GGSGG) 2連接肽(序列號28)連接2個VHH單體彼此，介由XbaI序列（SerArg)使在N末 端結(jié)合有(GGSGG) 2連接肽(序列號28)的綠色熒光蛋白質(zhì)(EGFP)與4E6二聚體的C末端結(jié)合。 [0219] (1-3)大腸桿菌表達(dá)用抗hTRAIL-R2VHH抗體四聚體(4E6四聚體)基因表達(dá)盒的制 作
[0220] 大腸桿菌表達(dá)用4E6四聚體基因，以插入到pEX-K質(zhì)粒的雙歧桿菌表達(dá)用4E6四聚 體基因表達(dá)盒(序列號1)作為模板，使用引物DNA序列3(序列號10)和4(序列號11)進(jìn)行PCR 的擴(kuò)增。PCR的條件是使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(TAKARA ΒΙ0)作為DNA聚合酶， 以將95 °C 1分鐘進(jìn)行1個循環(huán)，將98 °C 10秒、60 °C 15秒、68 °C 2分鐘進(jìn)行25個循環(huán)的方式實(shí)施。 擴(kuò)增產(chǎn)物使用MinElute柱(Qiagen)根據(jù)附加的協(xié)議進(jìn)行純化，用Ndel和Notl進(jìn)行限制酶消 化后，用1.2%瓊脂糖進(jìn)行電泳，從凝膠切出目標(biāo)條帶，使用DNA凝膠提取試劑盒(Qiagen)根 據(jù)附加的協(xié)議進(jìn)行純化分離。將其插入到pET-22b( + ) (Novagen)的Ndel和Notl部位，構(gòu)建在 N末端具有Strep Tag、用3個(GGSGG)2連接肽(序列號28)連接4個VHH單體彼此的4E6四聚體 (圖 12c)。
[0221] (2)大腸桿菌中的重組蛋白質(zhì)的表達(dá)
[0222] 將如上所述制作的4E6四聚體、4E6二聚體Toxin和4E6二聚體EGFP基因插入到 pET22b( + )的Ndel和Notl部位。向E · coli RosettaGami (DE3)2(Novagen)導(dǎo)入該表達(dá)載體質(zhì) 粒DNA，按照所附手冊使用200mL的加入了 100yg/mL安比西林(Sigma-Aldri ch)的2YT培養(yǎng)基 在37°C培養(yǎng)重組大腸桿菌，達(dá)到0D6Q() = ().4~0.5時，添加 ImM IPTG(異丙基-β-硫代半乳糖 苷，TAKARA ΒΙ0)在30°C培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)結(jié)束后，回收大腸桿菌，再次懸浮在20mL的提取緩 沖液（50mM磷酸鈉 pH7.8、300mM NaCl、EDTA-Free蛋白酶抑制劑混合物（protease inhibitor cocktail)(Roche))中，在冰中使用Sonifier 250 (Branson)，以O(shè)utput Control 2、Duty cycle 80%的條件進(jìn)行2次1分鐘的超聲波處理，粉碎菌體。將處理后的懸 浮液以15000rpm在4°C離心20分鐘，回收上清液。融合蛋白質(zhì)的純化使用HisTrap柱 (GEHealthcare)。將超聲波處理懸浮液的離心上清液直接通過HisTrap柱，用結(jié)合緩沖液 (20mM磷酸鈉、0.5M NaCl、20mM咪唑pH7.4)清洗柱后，用含有500mM咪唑的洗脫液洗脫融合 蛋白質(zhì)。將純化樣品供于10%丙烯酰胺SDS電泳，用CBB染色，確認(rèn)純化的重組蛋白質(zhì)，與BSA (牛血清白蛋白蛋白質(zhì)）的染色相比，計(jì)算目標(biāo)蛋白質(zhì)帶的濃度（圖二聚體 Toxin、4E6二聚體EGFP、4E6四聚體的濃度分別計(jì)算為0.8mg/mL、l .2mg/mL、l .6mg/mL。
[0223] <實(shí)施例7:4E6二聚體Toxin和4E6四聚體的癌細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性的測定>
[0224] 研究4E6二聚體Toxin融合蛋白質(zhì)是否對培養(yǎng)hTRAIL-R2表達(dá)人癌細(xì)胞(C〇1〇205， 由American Type Culture Collection得到）具有細(xì)胞死亡誘導(dǎo)作用。向Falcon 96孔培養(yǎng) 板(Becton Dickinson)以5 X 104cells/50yL培養(yǎng)基（含有0 · 2%胎牛血清（Tissue Culture Biologicals)的RPMI1640培養(yǎng)基)/孔加入細(xì)胞，培養(yǎng)2小時后，將如上所述純化的4E6二聚 體 Toxin、4E6 二聚體 EGFP 以終濃度成為 2000、800、160、32、6.4、1.28、0.256、(h0512ng/mL 的 培養(yǎng)基（2 X終濃度)各添加50yL。在培養(yǎng)第2天加入10yL的MTT試劑(Nacalai Tesque)。再培 養(yǎng)2小時后以lOOyL/孔加入增溶劑，用吸量管將細(xì)胞溶解，測定OD57〇nm的吸光度。將無細(xì)胞 添加的培養(yǎng)基的孔的測定值作為背景值從總測定值中減去。將未添加抗體的空白對照的孔 設(shè)為100%，用其相對值表示。測定重復(fù)三次進(jìn)行，取3個孔的平均值。如圖14a所示，抗 TRAIL-R2VHH抗體二聚體和Toxin融合體、即免疫毒素完全不誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
[0225] 為了確認(rèn)4E6二聚體與細(xì)胞結(jié)合的情況，進(jìn)行了以下試驗(yàn)。即，對人大腸癌C〇1〇205 細(xì)胞、胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，使各2 X 105細(xì)胞在50yL的含有10yg/mL 4E6二聚體EGFP和2%胎 牛血清的磷酸緩沖生理鹽水(pH7.4)中進(jìn)行30分鐘冰上反應(yīng)。用上述的加入血清的磷酸緩 沖生理鹽水清洗2次，利用FACSVerse(BD Biosciences)解析細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。2種細(xì)胞均被 4E6二聚體EGFP染色。另一方面，對于對照二聚體EGFP，任一細(xì)胞均未被染色（圖15)。因此， 認(rèn)為4E6二聚體與細(xì)胞結(jié)合。
[0226] 根據(jù)以上結(jié)果，認(rèn)為4E6二聚體Toxin雖與細(xì)胞膜上的TRAIL-R2結(jié)合，但無法使 TRAIL-R2分子聚集為三聚體以上，且也不會被攝取到細(xì)胞內(nèi)，因此無法對C〇1〇205細(xì)胞誘導(dǎo) 細(xì)胞死亡。
[0227] 接著，為了研究4E6單體和4E6四聚體是否具有細(xì)胞死亡誘導(dǎo)作用，將如上所述純 化的4E6單體、4E6四聚體以終濃度成為25000、5000、1000、200、40、8、1.6、0.32pg/mL的培養(yǎng) 基(2 X終濃度)各添加50yL。其結(jié)果，4E6單體未引起細(xì)胞死亡，但具有使TRAIL-R2分子聚集 成三聚體以上的活性的4E6四聚體對C〇1〇205細(xì)胞強(qiáng)效誘導(dǎo)細(xì)胞死亡（圖14b)。
[0228] 這些結(jié)果顯示具有使TRAIL-R聚集成三聚體以上的活性的抗hTRAIL-R VHH抗體四 聚體與抗hTRAIL-R VHH抗體二聚體Toxin相比，能夠有效地誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。
[0229] <實(shí)施例8:大腸桿菌中表達(dá)的4E6四聚體對人大腸癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞死 亡誘導(dǎo)作用>
[0230] 研究4E6四聚體對人大腸癌細(xì)胞C〇1〇205和胰腺癌細(xì)胞BxPC-3(由American Type Culture Col lection得到）的癌細(xì)胞死亡誘導(dǎo)作用。細(xì)胞懸浮于添加有10 %胎牛血清 (Tissue Culture Biologicals)的RPMI1640培養(yǎng)基（Sigma)，向Falcon96孔培養(yǎng)板(Becton Dickinson)以3X10 3cells/50yL/孔加入細(xì)胞，培養(yǎng)一晚后，添加各50yL的含有4E6四聚體、 hTRAIL(和光純藥）的培養(yǎng)基。C〇1〇205細(xì)胞培養(yǎng)一晚，BxPC-3細(xì)胞培養(yǎng)兩晚后，加入10yL的 活細(xì)胞數(shù)量測定試劑SF(Nacalai Tesque)，進(jìn)一步培養(yǎng)4~6小時，測定450nm的吸光度。將 未加入細(xì)胞的只是培養(yǎng)基的孔作為背景扣除。將僅有細(xì)胞的孔設(shè)為1〇〇%，將其相對值作為 數(shù)據(jù)。用各濃度3個孔的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。如圖16所示，4E6四聚體濃度依賴性地誘導(dǎo) C〇1〇205細(xì)胞、BxPC-3細(xì)胞的細(xì)胞死亡，IC5Q分別為2pmol/L、8pmol/L。用大腸桿菌制作的 hTRAIL的IC5Q為400pmol/L，可知4E6四聚體能夠以比hTRAIL低的濃度誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
[0231] <實(shí)施例9:4E6四聚體和4E6二聚體EGFP在雙歧桿菌中的分泌表達(dá)和純化>
[0232] (1)通過電穿孔制作重組雙歧桿菌
[0233] 將用于在雙歧桿菌中分泌表達(dá)4E6四聚體和4E6二聚體EGFP的載體基因盒(參照實(shí) 施例 1)插入PKKT427載體（Yasui K.，et al.，Nucleic Acids Res.2009)的Hindlll與Notl 之間，通過電穿孔法導(dǎo)入至長雙歧桿菌105-A。電穿孔以2.41^、25以？、200〇的條件進(jìn)行。
[0234] (2)由雙歧桿菌分泌表達(dá)的4E6四聚體、4E6二聚體EGFP的純化
[0235] 將（1)中得到的重組雙歧桿菌加入到含有l(wèi)OOyg/mL壯觀霉素的MRS液體培養(yǎng)基 (Lactobacilli MRS Broth,Difco Laboratories，Detroit，MI)、50mM鹿糖、3·4mg/mL L_抗 壞血酸鈉鹽和〇.2mg/mL L-半胱氨酸鹽酸鹽中，進(jìn)行一晚厭氧培養(yǎng)。厭氧培養(yǎng)使用加入了作 為脫氧劑的AnaeroPack-Kenki (三菱瓦斯化學(xué)，東京，日本)的密閉容器進(jìn)行。測定培養(yǎng)一晚 的培養(yǎng)液的吸光度(600nm)，以吸光度變?yōu)?.1的方式加入到新的液體培養(yǎng)基中。厭氧培養(yǎng)6 ~7小時，以4°C、9400 X g離心10分鐘，采取培養(yǎng)上清液。重組蛋白質(zhì)的純化用HisTrap柱(GE Healthcare)進(jìn)行。將培養(yǎng)上清液通過HisTrap柱，用結(jié)合緩沖液(50mM磷酸鈉、0.3M NaCl、 20mM咪唑pH7.8)清洗柱后，用含有500mM咪唑的洗脫液洗脫蛋白質(zhì)。將與由培養(yǎng)上清液lmL 純化的量相當(dāng)?shù)募兓鞍踪|(zhì)進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，用Oriole熒光凝膠染料(Bio-Rad)染色 （圖 17) JE6 四聚體、 4E6 二聚體 EGFP 都在推測分子量附近 （約 60kDa) 被檢測到 。對 于培養(yǎng)上清液中的分泌量，4E6四聚體預(yù)計(jì)為400ng/mL，4E6二聚體EGFP預(yù)計(jì)為3.2ng/mL。根 據(jù)以上結(jié)果可知任一重組蛋白質(zhì)均有分泌，4E6四聚體與4E6二聚體EGFP相比被效率良好地 分泌表達(dá)。
[0236] <實(shí)施例10:雙歧桿菌中分泌表達(dá)的抗hTRAIL-R2VHH抗體四聚體(4E6四聚體）的 癌細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性>
[0237] 研究4E6四聚體對人大腸癌C〇1〇205細(xì)胞（American Type Culture Collection) 的癌細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性。細(xì)胞懸浮于添加有10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals) 的 RPMI1640 培養(yǎng)基（Sigma)，以3X103cells/50yl 培養(yǎng)基 / 孔向 Falcon96 孔培養(yǎng)板(Becton Dickinson)加入細(xì)胞。培養(yǎng)一晚，添加各50yL的以終濃度0.3pM~10nM含有4E6四聚體、 TRAIL的培養(yǎng)基。進(jìn)一步培養(yǎng)一晚，加入10yL的活細(xì)胞數(shù)量測定試劑SF(Nacalai Tesque)， 培養(yǎng)6小時后測定450nm的吸光度。將未加入細(xì)胞的只是培養(yǎng)基的孔作為背景扣除。將僅有 細(xì)胞的孔作為100%，將其相對值作為數(shù)據(jù)。用各濃度3個孔的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。如圖 18所示，4E6四聚體濃度依賴性地抑制增殖，IC 5Q為0.02nmol/L。另一方面，由大腸桿菌制作 的hTRAIL(和光純藥)的IC5Q為0.4nmol/L。因此，可知在雙歧桿菌中分泌表達(dá)的4E6四聚體與 hTRAIL相比細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性高。
[0238] <實(shí)施例11:C〇1〇205細(xì)胞移植的異種移植模型(Xenograft model)中的重組長雙 歧桿菌通過靜脈內(nèi)給藥得到的抗腫瘤效果的研究>
[0239] 在向裸小鼠的皮下移植人大腸癌C〇1〇205細(xì)胞形成實(shí)體癌的異種移植模型中，研 究將分泌表達(dá)抗hTRAIL-R2VHH抗體四聚體(4E6四聚體)的重組長雙歧桿菌105-A向靜脈內(nèi) 給藥時的抗腫瘤效果。具體而言，對6周齡的雌性KSN/Slc裸小鼠皮下移植2 X 106的C〇1〇205 細(xì)胞，9天后以各組（n = 6,未處置、4E6四聚體、4E6二聚體EGFP)的腫瘤塊的體積成為約 280mm3的方式分組后，將按照實(shí)施例9制作的重組雙歧桿菌以每1只1.5 X 109個向靜脈內(nèi)給 藥。使用的長雙歧桿菌105-A通過離心和在生理鹽水中的再次懸浮進(jìn)行制備。為了補(bǔ)充體內(nèi) 的長雙歧桿菌105-A的營養(yǎng)，每天將lmL的20%半乳糖苷果糖向腹腔內(nèi)給藥。對于腫瘤直徑， 從雙歧桿菌給藥當(dāng)天開始〇、2、4、7、11、14、18、21天后使用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量。腫瘤體積由 "(短徑)2x(長徑)/2"的計(jì)算公式計(jì)算。將結(jié)果示于圖19。在雙歧桿菌給藥后第21天，分泌 表達(dá)4E6四聚體的重組雙歧桿菌與未處置相比，抑制了 51%的腫瘤增殖。另一方面，作為陰 性對照的分泌4E6二聚體EGFP的雙歧桿菌給藥組中未發(fā)現(xiàn)腫瘤增殖抑制效果。
[0240]與腫瘤直徑的測量同時，從雙歧桿菌給藥當(dāng)天開始0、2、4、7、11、14、18、21天后測 量各組的體重。如圖20所示，與未處置、4E6二聚體EGFP組相比，4E6四聚體組中未檢測到體 重減少。根據(jù)這些結(jié)果，認(rèn)為4E6四聚體不產(chǎn)生引起體重減少這樣的副作用，通過細(xì)胞死亡 誘導(dǎo)活性抑制腫瘤增殖。
[0241] <實(shí)施例12: BxPC-3細(xì)胞移植的異種移植模型中的重組長雙歧桿菌通過靜脈內(nèi)給 藥產(chǎn)生的抗腫瘤效果的研究>
[0242] 在向裸小鼠的皮下移植人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞形成實(shí)體癌的異種移植模型中，研究 將分泌表達(dá)抗hTRAI L-R2VHH抗體四聚體(4E6四聚體)的重組長雙歧桿菌105-A向靜脈內(nèi)給 藥時的抗腫瘤效果。具體而言，向8周齡的雌性KSN/Slc裸小鼠皮下移植2 X106的BxPC-3細(xì) 胞，8天后以各組(η = 6，未處置，4E6四聚體，4E6二聚體EGFP)的腫瘤塊的體積成為約230mm3 的方式分組后，將按照實(shí)施例9制作的重組雙歧桿菌以每1只1.5 X 109個向靜脈內(nèi)給藥。使 用的長雙歧桿菌105-A通過離心和在生理鹽水中的再次懸浮進(jìn)行制備。為了補(bǔ)充體內(nèi)的長 雙歧桿菌105-A的營養(yǎng)，每天將lmL的20 %半乳糖苷果糖向腹腔內(nèi)給藥。對于腫瘤直徑，從雙 歧桿菌給藥當(dāng)天開始0、3、6、10、13、17天后使用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量。腫瘤體積由"(短徑) 2\ (長徑)/2"的計(jì)算公式計(jì)算。將結(jié)果示于圖21。在雙歧桿菌給藥后第17天，分泌表達(dá)4E6四聚 體的重組雙歧桿菌與未處置相比，抑制了 52%的腫瘤增殖。另一方面，在作為陰性對照的分 泌4E6二聚體EGFP的雙歧桿菌給藥組中未發(fā)現(xiàn)腫瘤增殖抑制效果。
[0243] 與腫瘤直徑的測量同時，從雙歧桿菌給藥當(dāng)天開始0、3、6、10、13、17天后測量各組 的體重。如圖22所示，與未處置、4E6二聚體EGFP組相比，4E6四聚體組中未檢測到體重減少。 根據(jù)這些結(jié)果，認(rèn)為4E6四聚體不產(chǎn)生引起體重減少這樣的副作用，通過細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性 抑制腫瘤增殖。
[0244] <實(shí)施例13:4P6三聚體重組E.coli BL21(DE3)的制作和重組蛋白質(zhì)的表達(dá)?純 化>
[0245] (1)大腸桿菌表達(dá)用抗hTRAIL-RIVHH抗體三聚體(4P6三聚體)基因表達(dá)盒的制作
[0246] 將在N末端具有Strep Tag、在C末端具有His-Tag序列、按照實(shí)施例4(1)取得的抗 hTRAIL-RIVHH抗體的3個單體彼此用2個(GGSGG)2連接肽（序列號28)連接而形成4P6三聚 體，將編碼該4P6三聚體的基因插入到pET-22b( + )(Novagen)的Ndel和Notl部位，構(gòu)建大腸 桿菌表達(dá)用4P6三聚體基因表達(dá)盒(參照實(shí)施例6)。
[0247] (2)大腸桿菌中的重組蛋白質(zhì)的表達(dá)
[0248] 將如上所述制作的質(zhì)粒載體導(dǎo)入E.coli BL21Star?(DE3)0ne Shot(Life technologies)。根據(jù)隨附手冊使用200mL的加入了 100yg/mL安比西林（Sigma-Aldrich)的 2YT培養(yǎng)基在37°C培養(yǎng)重組大腸桿菌，達(dá)到0D6q() = 0.4~0.5時，添加 ImM IPTG(異丙基-β-硫 代半乳糖苷，TAKARA ΒΙ0)在30°C培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)結(jié)束后，回收大腸桿菌，再次懸浮于20mL 的提取緩沖液(50mM磷酸鈉 pH7.8、300mM NaCl、EDTA-Free蛋白酶抑制劑混合物(protease inhibitor cocktail) (Roche))。在冰中使用Sonifier 250(Branson)以 Output Control 2、Duty cycle 80%的條件進(jìn)行2次1分鐘的超聲波處理，粉碎菌體。將處理后的懸浮液以 9400 Xg在4 °C離心20分鐘，回收上清液。融合蛋白質(zhì)的純化使用His Trap柱（GE Healthcare UK)。將超聲波處理懸浮液的離心上清液直接通過His Trap柱，用結(jié)合緩沖液 (20mM磷酸鈉、0.5M NaCl、20mM咪唑pH7.4)清洗柱后，用含有500mM咪唑的洗脫液洗脫融合 蛋白質(zhì)。進(jìn)而，將洗脫組分添加于Strep-Tactin柱（IBA)，根據(jù)隨附手冊進(jìn)行純化。對相當(dāng)于 50ng的BSA的純化蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳，用Oriole焚光凝膠染料(Bio-Rad) 染色（圖23K4P6三聚體在推測分子量附近(約42kDa)被檢測到。根據(jù)以上結(jié)果，可知4P6三 聚體可以在大腸桿菌中表達(dá)、純化。
[0249] <實(shí)施例14:大腸桿菌中表達(dá)的4P6三聚體的癌細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性的測定>
[0250] 研究4P6三聚體對大腸癌C〇1〇205細(xì)胞（American Type Culture Collection)的 癌細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性。細(xì)胞懸浮于添加了10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals)的 RPMI1640培養(yǎng)基（Sigma)，以3X 103cells/50yl培養(yǎng)基/孔向Falcon96孔培養(yǎng)板（Becton Dickinson)加入細(xì)胞。培養(yǎng)一晚后，添加各50yL的以終濃度10pM~10nM含有4P6三聚體的培 養(yǎng)基。再培養(yǎng)兩晚后，加入l〇yL的活細(xì)胞數(shù)量測定試劑SF(Nacalai Tesque)，培養(yǎng)4小時后 測定450nm的吸光度。將未加入細(xì)胞的只是培養(yǎng)基的孔作為背景扣除。將僅有細(xì)胞的孔設(shè)為 100 %，將其相對值作為數(shù)據(jù)。用各濃度3個孔的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。如圖24所示，4P6三 聚體濃度依賴性地抑制C〇1〇205細(xì)胞的增殖，IC 5Q為0.4nmol/L。由大腸桿菌制作的hTRAIL (和光純藥）的IC5Q為0.4nmol/L，大腸桿菌中表達(dá)的4P6三聚體顯示與hTRAE相同程度的細(xì) 胞死亡誘導(dǎo)活性。
[0251] <實(shí)施例15:抗hTRAIL-RIVHH抗體三聚體(4P6三聚體)在雙歧桿菌中的分泌表達(dá) 和純化>
[0252] (1)通過電穿孔制作重組雙歧桿菌
[0253] 將實(shí)施例1 (1)中的表達(dá)盒的4E6四聚體的部分替換為按照實(shí)施例4(1)取得的4P6 的三聚體，將這樣制作的用于在雙歧桿菌中分泌表達(dá)4P6三聚體的載體基因盒插入到 pKKT427載體(Yasui K.，et al.，Nucleic Acids Res.2009)的Hindlll與Notl之間，通過電 穿孔法導(dǎo)入到長雙歧桿菌105-A中。電穿孔以2.41^、25以？、200〇的條件進(jìn)行。
[0254] (2)雙歧桿菌中分泌表達(dá)的4P6三聚體的純化
[0255] 將（1)中得到的重組雙歧桿菌加入到含有l(wèi)OOyg/mL壯觀霉素的MRS液體培養(yǎng)基 (Lactobacilli MRS Broth,Difco Laboratories，Detroit，MI)、50mM鹿糖、3·4mg/mL L_抗 壞血酸鈉鹽和〇.2mg/mL L-半胱氨酸鹽酸鹽中，進(jìn)行一晚厭氧培養(yǎng)。厭氧培養(yǎng)使用加入了作 為脫氧劑的AnaeroPack-Kenki (三菱氣體化學(xué)，東京，日本)的密閉容器而進(jìn)行。測定培養(yǎng)了 一晚的培養(yǎng)液的吸光度(600nm)，以吸光度變?yōu)?.1的方式加入到新的液體培養(yǎng)基中。厭氧 培養(yǎng)7小時，在4°C以9400 X g離心10分鐘，采取培養(yǎng)上清液。重組蛋白質(zhì)的純化用HisTrap柱 (GE Healthcare)進(jìn)行。將培養(yǎng)上清液通過HisTrap柱，用結(jié)合緩沖液（50mM磷酸鈉、0.3M NaCl、20mM咪唑pH7.8)清洗柱后，用含有500mM咪唑的洗脫液洗脫蛋白質(zhì)。將與由培養(yǎng)上清 液0.6mL純化的量相當(dāng)?shù)募兓鞍踪|(zhì)進(jìn)行SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳，用Or i ο 1 e焚光凝膠染料 (Bio-Rad)染色（圖25) JP6三聚體在推測分子量附近（約42kDa)被檢測到。使用BSA進(jìn)行定 量，結(jié)果4P6三聚體的培養(yǎng)上清液中的分泌量估計(jì)為30ng/mL。根據(jù)以上結(jié)果可知4P6三聚體 在雙歧桿菌中被分泌表達(dá)。
[0256] <實(shí)施例16:雙歧桿菌中分泌表達(dá)的抗hTRAIL-RIVHH抗體三聚體(4P6三聚體）的 癌細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性>
[0257] 研究4P6三聚體對人大腸癌C〇1〇205細(xì)胞（American Type Culture Collection) 和胰腺癌BxPC-3細(xì)胞(American Type Culture Collection)的癌細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性。細(xì)胞 懸浮于添加有 10%胎牛血清（Tissue Culture Biologicals)的RPMI1640培養(yǎng)基（Sigma)， 以3 X 103cells/50yl培養(yǎng)基/孔向Falcon96孔培養(yǎng)板(Becton Dickinson)加入細(xì)胞。培養(yǎng) 一晚，添加各50yL的以終濃度0.3pM~10nM含有4P6三聚體的培養(yǎng)基。再培養(yǎng)兩晚，加入10yL 的活細(xì)胞數(shù)量測定試劑SF(Nacalai Tesque)，培養(yǎng)2小時后測定450nm的吸光度。將未加入 細(xì)胞的只是培養(yǎng)基的孔作為背景扣除。將僅有細(xì)胞的孔設(shè)為1〇〇%，將其相對值作為數(shù)據(jù)。 用各濃度3個孔的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。如圖26a所示，4P6三聚體濃度依賴性地抑制 C〇1〇205細(xì)胞的增殖，IC5Q為0.08nmol/L。由大腸桿菌制作的hTRAIL(和光純藥）的IC 50為 0.4nmol/L，可知雙歧桿菌中分泌表達(dá)的4P6三聚體與hTRAIL相比細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性高。如 圖26b所示，4P6三聚體也濃度依賴性地抑制BxPC-3細(xì)胞的增殖。
[0258] <實(shí)施例17:BxPC-3-Luc#2細(xì)胞移植的異種移植模型中的分泌表達(dá)4P6三聚體的 重組長雙歧桿菌通過靜脈內(nèi)給藥得到的抗腫瘤效果的研究>
[0259]在向裸小鼠的皮下移植人胰腺癌BxPC-3-Luc#2細(xì)胞（由JCRB細(xì)胞庫得到）形成實(shí) 體癌的異種移植模型中，研究將分泌表達(dá)抗hTRAIL-RIVHH抗體三聚體(4P6三聚體）的重組 長雙歧桿菌105-A向靜脈內(nèi)給藥時的抗腫瘤效果。具體而言，對6周齡的雌性KSN/Slc裸小鼠 皮下移植3X10 6的BxPC-3-Luc#2細(xì)胞，15天后以各組(n = 5,未處置、4P6三聚體、僅pKKT427 載體）的腫瘤塊的體積成為約135mm3的方式分組后，將按照實(shí)施例15制作的重組雙歧桿菌 以每1只3 X108個向靜脈內(nèi)給藥。使用的長雙歧桿菌105-A通過離心和在生理鹽水中的再次 懸浮而制備。為了補(bǔ)充體內(nèi)的長雙歧桿菌105-A的營養(yǎng)，每天將lmL的20 %半乳糖苷果糖向 腹腔內(nèi)給藥。對于腫瘤直徑，從移植腫瘤當(dāng)天開始15、19、21、24、28、31、35天后使用游標(biāo)卡 尺進(jìn)行測量。腫瘤體積由"(短徑) 2X(長徑)/2"的計(jì)算公式計(jì)算。將結(jié)果示于圖27。在雙歧 桿菌給藥后第20天，分泌表達(dá)4P6三聚體的重組雙歧桿菌與未處置相比，抑制了 65%的腫瘤 增殖。另一方面，在作為陰性對照的導(dǎo)入了 PKKT427的雙歧桿菌給藥組中未發(fā)現(xiàn)腫瘤增殖抑 制效果。
[0260] 在腫瘤直徑的測量同時，從移植腫瘤當(dāng)天開始15、19、21、24、28、31、35天后測量各 組的體重。如圖28所示，與未處置、導(dǎo)入pKKT427的雙歧桿菌組相比，4P6三聚體組中未檢測 到體重減少。根據(jù)這些結(jié)果，認(rèn)為4P6三聚體不產(chǎn)生引起體重減少這樣的副作用，通過細(xì)胞 死亡誘導(dǎo)活性抑制腫瘤增殖。
[0261] 產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0262]根據(jù)本發(fā)明，能夠減少對正常細(xì)胞的毒性，并且通過具有強(qiáng)效激動劑活性的抗 hTRAIL-Rl抗體和抗hTRAIL-R2抗體的腫瘤部位局部給藥而有效地誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。
[0263]將本說明書中引用的全部出版物、專利和專利申請作為參考直接引入本說明書 中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，以可表達(dá)狀態(tài)含有編碼融合蛋白質(zhì)的核酸，該融 合蛋白質(zhì)含有信號肽以及3個以上的抗TRAIL-Rl單鏈抗體和/或3個以上的抗TRAIL-R2單鏈 抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，專性厭氧革蘭氏陽性菌為 雙歧桿菌屬即Bif idobacterium。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，對于抗TRAIL-Rl單鏈 抗體而言， CDRl含有由序列號22表示的氨基酸序列， CDR2含有由序列號23表示的氨基酸序列，和 CDR3含有由序列號24表示的氨基酸序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，對于抗 TRAIL-R2單鏈抗體而言， CDRl含有由序列號15表示的氨基酸序列， CDR2含有由序列號16表示的氨基酸序列，和 CDR3含有由序列號17表示的氨基酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，所述融合蛋 白質(zhì)進(jìn)一步含有功能性肽。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，功能性肽為標(biāo)記蛋白質(zhì)。7. -種抗腫瘤劑，將權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌作為有 效成分。8. -種抗TRAIL-Rl抗體，其特征在于， CDRl含有由序列號22表示的氨基酸序列， CDR2含有由序列號23表示的氨基酸序列，和 CDR3含有由序列號24表示的氨基酸序列。
【文檔編號】A61P35/00GK105916975SQ201480072570
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2014年12月24日
【發(fā)明人】西川毅, 平裕郎, 平裕一郎, 平郁子, 石田功
【申請人】學(xué)校法人帝京平成大學(xué)