塞來昔布的藥物組合物及其治療膽石癥的醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了塞來昔布的藥物組合物及其治療膽石癥的醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的塞來昔布的藥物組合物中含有塞來昔布和一種結構新穎的天然產物化合物(Ⅰ)，塞來昔布、化合物(Ⅰ)單獨作用時，對膽石癥具有治療作用；塞來昔布和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時，對膽石癥的治療效果顯著提高，可開發(fā)成治療膽石癥的藥物，與現(xiàn)有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【專利說明】
塞來昔布的藥物組合物及其治療膽石癥的醫(yī)藥用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體設及塞來昔布的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的 應用。
【背景技術】
[0002] 塞來昔布臨床用于緩解骨關節(jié)炎的癥狀和體征、緩解成人類風濕關節(jié)炎的癥狀和 體征、治療成人急性疼痛。
[0003] 塞來昔布是非醬體類抗炎藥，動物模型中觀察到其有抗炎、鎮(zhèn)痛和退熱的作用。塞 來昔布的作用機理是通過抑制環(huán)氧化酶-2(C0X-2)來抑制前列腺素生成。且在人體治療濃 度下，本品對同工酶-環(huán)氧化酶-I(COX-I)沒有抑制作用。
[0004] 在動物結腸腫瘤模型中塞來昔布減緩了腫瘤的發(fā)生和進展。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種塞來昔布的藥物組合物，該藥物組合物中含有塞來昔 布和一種結構新穎的天然產物，塞來昔布和該天然產物可W協(xié)同治療膽石癥。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術方案得W實現(xiàn)的：
[0007] -種具有下述結構式的化合物(I)，
[OOOJ
[0009] -種塞來昔布的藥物組合物，包括塞來昔布、如權利要求1所述的化合物（I)和藥 學上可W接受的載體，制備成需要的劑型。
[0010] 進一步地，藥學上可W接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[001。進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0012]上述化合物（I)的制備方法，包含W下操作步驟：（a)將慕枝核粉碎，用85~95%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃 取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步驟(a)中正下醇取物用 大孔樹脂除雜，先用35%乙醇洗脫8個柱體積，再用90%乙醇洗脫12個柱體積，收集90%洗 脫液，減壓濃縮得90%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中90%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為120:1、60:1、30:1和15:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d) 步驟(C)中組分3用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為40:1、30:1和10:1的二氯甲燒-甲 醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體 積百分濃度為85%的甲醇水溶液等度洗脫，收集14~18個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮 得到化合物(I)。
[0013] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用90%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0014] 進一步地，化合物(I)的制備方法中，所述大孔樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂。
[0015] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲燒代替乙酸乙醋進行萃 取，得到二氯甲燒萃取物。
[0016] 上述化合物(I)在制備治療膽石癥的藥物中的應用。
[0017] 上述塞來昔布的藥物組合物在制備治療膽石癥的藥物中的應用。
[001引本發(fā)明的優(yōu)點：
[0019] 本發(fā)明提供的塞來昔布的藥物組合物中含有塞來昔布和一種結構新穎的天然產 物，塞來昔布、化合物（I)單獨作用時，對膽石癥具有治療作用；塞來昔布和化合物（I)聯(lián)合 作用時，對膽石癥的治療效果顯著提高，可開發(fā)成治療膽石癥的藥物。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但并不W此限定本發(fā)明保護范 圍。
[0021] 實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0022] 分離方法：（a)將慕枝核(2kg)粉碎，用90%乙醇熱回流提取（1化X3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油酸（化X3次）、乙酸乙醋（化X3次）和水飽和的正下醇 (化X3次）萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙醋萃取物用DlOl型大孔樹脂除雜，先用35%乙醇洗脫8個柱體積，再用90%乙醇洗脫 12個柱體積，收集90%洗脫液，減壓濃縮得90%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中90%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為120:1(11個柱體積）、60:1(9個柱體積）、30:1(9 個柱體積)和15:1 (8個柱體積)的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(C)中組分 3用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為40:1(6個柱體積）、30:1(8個柱體積)和10:1(6個 柱體積)的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合 的反相硅膠分離，用體積百分濃度為85 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集14~18個柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(IKHPLC歸一化純度大于98% )。
[0023] 結構確證:HR-ESI-MS顯示[M+H]+為m/z 219.1772,結合核磁特征可得分子式為 〇15出2〇,不飽和度為 5。核磁共振氨譜數據 SH(ppm，CDCl3,500MHz):H-ie(1.74，m)，H-2a (2.15，m)，H-20(1.85，m)，H-3a(2.37，m)，H-30(1.98，m)，H-5(2.77，dd，J=11.4,7.8Hz)，H- 6a(2.33，m)，H-6e(1.88，m)，H-8a(1.56，m)，H-8e(1.51，m)，H-9a(1.72，m)，H-9e(1.76，m)， H-12(1.76，s)，H-13a(4.82，s)，H-l：3b(4.93，s)，H-14(1.46，s)，H-15a(4.71，s)，H-l加 (4.85,s);核磁共振碳譜數據Sc(ppm，CDCl3,125MHz) :51.7(CH，1-C)，26.9(C此，2-C) ,29.8 (CH2,3-C)，153.5(C，4-C)，37.2(CH，5-C)，31.8(Ol2,6-C)，89.6(C，7-C)，35.8(ai2,8-C)， 39.2(CH2,9-C)，86.7(C，10-C)，146.2(C，ll-C)，25.6(Ol3，12-C)，112.2(ai2，13-C)，26.3 (邸3，14-〇，114.1(邸2，15-〇?；衔锏陌弊V中顯示該化合物有兩個單峰甲基信號（如1.46 和1.76)，兩組末端雙鍵質子信號（Sh4.82和4.93; 4.71和4.85)。該化合物的碳譜顯示15個 碳信號，其中有兩組雙鍵碳信號，W及兩個連氧碳信號。綜合高分辨質譜W及核磁數據，該 化合物可能為一個倍半祗類化合物。查閱文獻可W看出該化合物和已知化合物7a ,IOa- epoxyguaiane-4a,ll-diol具有相似的結構。比較兩者的核磁W及高分辨數據發(fā)現(xiàn)，新化合 物中相較于7日，10日-邱〇xyguaiane-4a, 11-diol最大的區(qū)別是多出了兩個不飽和度即兩個 雙鍵。在新化合物的HMBC譜中，H-15/C-3，H-15/C-4，H-3/C-4的相關性說明C-15和C-4位之 間為雙鍵。此外，H-12/C-7，H-12/C-13，H-13/C-7，H-13/C-11之間的相關性說明該化合物中 存在的另一個末端雙鍵位于C-Il和C-13位。因此，該化合物仍然是一個C-10X-7位形成氧 橋的愈創(chuàng)木燒型倍半祗。ROESY譜中出-14/H-l，H-5/H-lW及H-5/出-12之間的相關性可W推 斷該化合物的H-I，H-5，出-14 W及C-7位上的基團均為0構型。綜合氨譜、碳譜、麗BC譜和 ROESY譜，W及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如下所示，立體構型進一 步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。
[0024] 該化合物化學式及碳原子編號如下：
[0025]
[00%]實施例2:藥理作用
[0027]本實施例使用鹽酸林可霉素皮下注射制備膽石癥豚鼠模型，觀察藥物降低膽石癥 豚鼠膽囊黏膜TGR5陽性表達率，減少膽石形成等方面的抗膽石癥作用。
[002引1、材料與方法
[0029] 1.1 動物
[0030] 豚鼠，雌性，350~450g，由衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所實驗動物中屯、提供。
[0031] 1.2試劑與樣品
[0032] 塞來昔布購自中國藥品生物制品檢定所?；衔?I)自制，制備方法見實施例1。
[0033] 1.3 儀器
[0034] 一抗RalDbit Polyelonal to GPCR TGR5(ab72608)(美國Abeam)和二抗，購自 Abcam和北京中杉金橋生物技術有限公司；Olympus化72圖像采集分析儀（日本Olympus公司 生產）。
[0035] 1.4豚鼠分組及模型制備
[0036] 豚鼠隨機分為5組，每組12只，分別為正常對照組、模型對照組、塞來昔布組 (80mg ? kg-i)、化合物（I)組(80mg ? kg-i)、塞來昔布與化合物（I)組合物組【40mg ? kg-i塞來 昔布+40mg ? kg-i化合物（I)】。除正常對照組外，其他組均給予鹽酸林可霉素60mg/kg，l次/ d，皮下注射，連續(xù)注射4d，停藥2d，再注射3d進行造模。正常對照組給W同等劑量生理鹽水 皮下注射。造模成功后按照上述劑量灌胃給藥，1次/d,共8天;模型對照組和正常對照組給 W同樣劑量的生理鹽水灌胃。
[0037] 1.5膽囊容積測定實驗
[0038] 實驗第12天，末次給藥前，禁食2地。末次給藥化后，將豚鼠 W戊己比妥鋼40mg/kg 腹腔注射麻醉，打開腹腔，結扎膽囊管切除膽囊，用空針抽出膽汁，測量膽囊容積[膽囊容積 (yl/g)=膽汁量(yl)/豚鼠體質量(g)]。
[0039] 1.6免疫組化觀察陽性細胞實驗
[0040] 采用Envision法染色。TGR5經巧樣酸高溫修復，具體操作步驟按說明書。取染色良 好的豚鼠各組切片在光學顯微鏡下觀察并照相，顯微鏡下每一張切片隨機選取10個視野， W膽囊黏膜上皮細胞頂膜側出現(xiàn)棟色或棟褐色的均質或顆粒樣物質為陽性細胞判斷標準。 [OOW 1.7統(tǒng)計學方法
[0042] 實驗數據用均數±標準差(x±s)表示，應用SPSS18.0版統(tǒng)計軟件進行單因素方差 分析和t檢驗，WP<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
[0043] 2、實驗結果
[0044] 2.1對膽石癥模型豚鼠膽囊容積的影響
[0045] 與正常對照組比，模型對照組豚鼠膽囊容積明顯增加(P<0.01)，表明造模效果較 好;與模型對照組比，塞來昔布與化合物（I)組合物組豚鼠膽囊容積顯著減小(P<〇.01);與 模型對照組比，塞來昔布組、化合物（I)組豚鼠膽囊容積減小(P<〇.05)。結果見表1。
[0046] 2.2對膽石癥模型豚鼠膽囊黏膜TGR5陽性表達的影響
[0047] 與正常對照組比較，模型對照組豚鼠的膽囊黏膜TGR5陽性表達明顯增強（P< 0.01)。與模型對照組比較，塞來昔布與化合物（I)組合物組豚鼠的膽囊黏膜TGR5陽性表達 明顯減弱(P<〇.01);與模型對照組比較，塞來昔布組、化合物（I)組豚鼠的膽囊黏膜TGR5陽 性表達減弱(P<〇.〇5)。結果見表1。
[004引表1對膽石癥模型豚鼠膽囊容積和膽囊黏膜TGR5陽性表達的影響 「nrviol
[0050] TGRS(Gpbarl)是一種類似于視紫質的跨膜G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體，為7次跨膜脂蛋 白，受體胞外結構域(N-末端)識別胞外信號分子并與之結合，胞內結構域(C-末端)與G蛋白 偶聯(lián)。通過與G蛋白偶聯(lián)，調節(jié)相關酶活性，在細胞內產生第二信使，從而將胞外信號跨膜傳 遞到胞內。TGRSmRNA的蛋白表達在許多不同的人類組織和曬齒類動物組織中發(fā)現(xiàn)，包括鼠 膽管上皮細胞和膽囊上皮細胞。研究發(fā)現(xiàn)TGR5定位于人體膽囊黏膜上皮細胞頂膜側和膽管 上皮細胞原纖毛上，而且GS患者膽囊TGR5的表達明顯高于對照組。
[0051] TGR5介導尖端鋼依賴性膽鹽運輸體(ASBT)促進胞外膽汁酸逆轉運，使胞內的膽汁 酸濃度升高，反饋地抑制了肝細胞中膽汁酸合成關鍵酶-膽固醇7a-徑化酶（cytochrome P450，famil}f7，subfamilyA，polypeptidel;切p7al)，使膽汁酸合成減少而膽固醇增多，排 入膽道形成膽固醇過飽和致石膽汁。
[0052] 塞來昔布、化合物（I)單獨作用時，對膽石癥具有治療作用;塞來昔布和化合物（I) 聯(lián)合作用時，對膽石癥的治療效果顯著提高，可開發(fā)成治療膽石癥的藥物。
[0053] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質性內容，但并不W此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可W對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物α)，2. -種塞來昔布的藥物組合物，其特征在于:包括塞來昔布、如權利要求1所述的化合 物(I)和藥學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據權利要求2所述的塞來昔布的藥物組合物，其特征在于:藥學上可以接受的載體 包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體 或潤滑劑。4. 根據權利要求2所述的塞來昔布的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠 囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、 栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將荔 枝核粉碎，用85~95%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用35%乙醇洗脫8個柱體積，再用90%乙醇洗脫 12個柱體積，收集90%洗脫液，減壓濃縮得90%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中90%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為120:1、60:1、30:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分3用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為40:1、30:1 和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合 的反相硅膠分離，用體積百分濃度為85 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集14~18個柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用90%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。8. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療膽石癥的藥物中的應用。10. 權利要求2~4任一所述的塞來昔布的藥物組合物在制備治療膽石癥的藥物中的應 用。
【文檔編號】A61P1/16GK105924413SQ201610338448
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】秦勇, 王 琦, 劉琪, 焦婷婷, 周自桂, 徐成, 陳建芳
【申請人】江蘇神龍藥業(yè)有限公司