從油茶葉中提取槲皮素及根皮素的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種從油茶葉中提取槲皮素及根皮素的方法。以乙醇溶液為溶劑，對油茶葉進(jìn)行浸提，得到粗提液；以D101大孔吸附樹脂富集分離，再經(jīng)兩次所用流動(dòng)相不同的硅膠層析分離，最后經(jīng)DAC色譜柱分離，即可獲得僅含根皮素及槲皮素的混合物。本發(fā)明首次從油茶葉中成功提取出了槲皮素和根皮素，前者首次從山茶屬植物中提取出來。該提取方法具有收率高、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
從油茶葉中提取撇皮素及根皮素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藥物提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其是設(shè)及一種從油茶葉中提取搬皮素及根皮素 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 油茶葉為山茶科植物油茶的葉，其富含多種藥效成分，尤其是黃酬類化合物、巧類 化合物。黃酬類化合物具有多種生物活性，例如屯、血管系統(tǒng)活性、抗菌及抗病毒活性、抗腫 瘤活性、抗氧化自由基活性、鎮(zhèn)痛活性、保肝活性等。巧類化合物具有桂疲止咳、抗腫瘤、抗 真菌、抑菌及降膽固醇等生物活性。
[0003] 如何從油茶葉中提取出搬皮素等生物活性成分，對深度開發(fā)油茶作物極其重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供提取搬皮素及根皮素的方法，所述的提取方法首次從油茶 葉中成功提取出了搬皮素和根皮素，并且該提取方法具有收率高、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了 W下技術(shù)方案：
[0006] 從油茶葉中提取搬皮素及根皮素的方法，包括W下步驟：
[0007] A: W乙醇溶液為溶劑，對油茶葉進(jìn)行浸提，得到粗提液；
[000引 B: WDlOl大孔吸附樹脂吸附富集，依次用水、15-25wt%乙醇溶液和75-85wt%乙 醇溶液對所述粗提液進(jìn)行恒定洗脫；
[0009] C:將所述75-85wt%乙醇溶液洗脫得到的洗脫液進(jìn)行硅膠層析分離，用9-11:1至1 :2.5-3.5梯度的二氯甲燒-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液，經(jīng)色譜分析，合并含有根 皮素、搬皮素的饋分段，命名為第一順序組分；
[0010] D:將所述第一順序組分進(jìn)行硅膠層析分離，用45-55:1至9-11:1梯度的二氯甲燒- 甲醇進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液，經(jīng)色譜分析，合并含有根皮素、搬皮素的饋分段，命名 為第二順序組分；
[001。 E:采用DAC色譜柱，用55-65 %至85-95 %梯度的甲醇-水為流動(dòng)相對所述第二順序 組分進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液，經(jīng)色譜分析，合并含有根皮素、搬皮素的饋分段。 [0012]上述提取方法由粗至精的方式從油茶葉中逐步分離出搬皮素與根皮素的混合物。 [OOU] W干油茶葉為基準(zhǔn)，本發(fā)明對搬皮素及根皮素的總提取率在78.4mg/kgW上，并且 產(chǎn)品的純度均在90 % W上。
[0014] 本發(fā)明所述的流動(dòng)相（即洗脫所用的液體)的比例均指體積比，流動(dòng)相中的"％"指 非水物質(zhì)所占的體積百分?jǐn)?shù)，乙醇溶液均指乙醇的水溶液，例如，15-25%乙醇溶液指乙醇 體積百分比為15-25%水溶液。55%甲醇-水指甲醇體積百分比為55%的水溶液。
[0015] 本發(fā)明所述的恒定洗脫是指流動(dòng)相的組成比例固定。
[0016] 本發(fā)明所述的梯度洗脫是指在洗脫過程中不斷改變流動(dòng)相的濃度配比，但起始濃 度和終點(diǎn)濃度是固定的，例如步驟C中的梯度洗脫是指:二氯甲燒-甲醇按照起始濃度為9- 11:1、洗脫終點(diǎn)濃度為1:2.5-3.5的方式進(jìn)行梯度洗脫。
[0017] 本發(fā)明所述的DAC色譜柱指軸向動(dòng)態(tài)壓縮工業(yè)色譜柱。
[0018] 本發(fā)明所述的提取方法適用于不同種屬的油茶葉，尤其適合普通油茶(Camellia oleifera Abel),其提取率高。
[0019] 本發(fā)明所述的提取方法的各個(gè)步驟可W進(jìn)一步改進(jìn)，例如：
[0020] 步驟A中，浸提所用的溶劑、料液比、溫度對粗提液中的雜質(zhì)含量W及有效成分的 提取率都有影響。溶劑優(yōu)選用40-60 %的乙醇-水溶液，更優(yōu)選50 %的乙醇-水溶液。料液比 優(yōu)選為1:2.5-3.5( Ig固體:2.5-3.5mL溶劑），更優(yōu)選1:2.5-3。浸提溫度優(yōu)選為70-80°C，并 且W回流浸提為最佳。采用W上浸提條件能降低粗提液中的雜質(zhì)含量，提高搬皮素、根皮素 的提取率。
[0021] 另外，為了降低后期分離的難度，在浸提之后可W濃縮干燥粗提液，除去乙醇。
[0022] 步驟B中，每個(gè)梯度洗脫所用流動(dòng)相的體積優(yōu)選為柱體積的3.5-4.5倍，更優(yōu)選為 4-4.5倍，保證待提取成分能夠被充分洗脫出來。所用流動(dòng)相的濃度優(yōu)選水、15-20%乙醇溶 液、75-80%乙醇溶液。
[0023] 步驟C中，硅膠層析分離為分離手段，色譜分析為評價(jià)分離結(jié)果的手段，兩者互相 配合，篩選出含有搬皮素、根皮素兩個(gè)目標(biāo)提取物的洗脫液。篩選通常為粗篩選，一般是經(jīng) 色譜分析，先將色譜圖相似的洗脫液合并，然后與目標(biāo)提取物的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖對比，從中篩 選出含有兩個(gè)目標(biāo)提取物之一的洗脫液，將其合并。
[0024] 所述步驟C中，所用的硅膠的粒徑優(yōu)選為200-300目，所述梯度洗脫優(yōu)選為：用9-10 :1至1:2.5-3梯度的二氯甲燒-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，采用W上進(jìn)一步優(yōu)化的條件，可W提高 分離度和柱效。
[0025] 在所述步驟C中，所述硅膠層析分離之前還包括:將所述75-85%乙醇溶液洗脫得 到的洗脫液濃縮干燥，可W避免乙醇對后續(xù)硅膠層析的干擾。
[0026] 另外，所述步驟C中的色譜分析可W是薄層色譜(TLC)、高效液相色譜等任意能用 于定性的方法，其中后者更準(zhǔn)確。
[0027] 另外，在進(jìn)行硅膠層析時(shí)，為了保證待分離物均勻分散在硅膠之中，優(yōu)選將二氯甲 燒-甲醇稀釋待分離物，同時(shí)拌入硅膠，之后再水浴蒸干。經(jīng)過W上處理后的物質(zhì)再裝入娃 膠柱中進(jìn)行層析。
[0028] 同樣，所述步驟D中，經(jīng)色譜分析可W為:高效液相色譜分析，和/或薄層分析等。
[0029] 所述步驟D中，流動(dòng)相優(yōu)選用45-50:1至9-10:1梯度的二氯甲燒-甲醇進(jìn)行梯度洗 脫.
[0030] 所述步驟E中，梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相的起始濃度優(yōu)選為55-60%，重點(diǎn)濃度優(yōu)選為 85-90%，W提高分離度和柱效。所采用的色譜分析可W為高效液相色譜分析、薄層分析等。 [0031 ]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明能達(dá)到W下技術(shù)效果：
[0032] (1)首次從油茶葉中提取了出高純度的搬皮素、根皮素的混合物；
[0033] (2)由粗到精的提取方式利于提取方法的規(guī)模化推廣；
[0034] (3)提取收率高。
【附圖說明】
[0035] 為了更清楚地說明本發(fā)明【具體實(shí)施方式】或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體 實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的 附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前 提下，還可W根據(jù)運(yùn)些附圖獲得其他的附圖。
[0036] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的80%乙醇洗脫后收集的樣品的液相色譜圖；
[0037] 圖 2 為C0-7 的 Ih-NMR譜圖；
[003引圖3為C0-7的I3C-NMR譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面將結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，但 是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的 實(shí)施例，僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保 護(hù)的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑 或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可W通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0040] 本發(fā)明中所述的流動(dòng)相的比例均指體積比。
[0041 ] 實(shí)施例1
[0042] 第一步：
[0043] 將自然陰干的油茶干燥葉粉碎過60目篩，取20kg分兩批用50 %乙醇按料液比1: 3 在70-80°C加熱回流，重復(fù)提取2次，每次提取化，合并所得上清液，過濾獲得上清液，減壓濃 縮至無醇味，得到原體積約一半的粗提液樣品，備用。
[0044] 第二步：
[0045] 用工業(yè)酒精處理約IOL的DlOl型大孔吸附樹脂，用水洗到無醇味，將第一步得到的 提取液分兩次上樣，依次用水、20 %乙醇、80 %乙醇洗脫，每個(gè)梯度洗脫4倍柱體積，根據(jù)化C 和HPLC分析結(jié)果，各部位合并濃縮。
[0046] 80%乙醇洗脫后收集的樣品濃縮干燥(約150g，其HPlX譜圖如圖1所示，洗脫程序： O-IOmin 50%甲醇水溶液，10-20min 80%甲醇水溶液，20-21min 100%甲醇；檢測波長 254nm，進(jìn)樣量10化），溶解于10:1的二氯甲燒-甲醇中，拌入300g薄層層析硅膠（200~300 目），水浴揮干，分兩次裝柱，其中每次空白層裝填硅膠約SOOg。
[0047] 流動(dòng)相系統(tǒng)為二氯甲燒-甲醇（10:1至1:3梯度洗脫），每SOOmL收集為一次，經(jīng)過 TLC檢測合并為1-化2'（表示:將第一次硅膠柱的第一個(gè)流份、第二個(gè)流份W及第二次硅膠 柱的第二個(gè)流份合并），3-7+3'-7'，8-10+8'-10'，11-13+11'，14-16+12'-13'，17-19+14'， 20-22+15'-18'，19'-21'，23-26+22'-27'，27-40,28'-34'，35'-44'，41-47,48-64,65,66- 67,68-70,71，72-78,45'-51'，52'-63'，64'-67'，68'-71'，72'-84'共計(jì)24個(gè)組分（兩次娃 膠柱的流份用序號后面的符號加 W區(qū)分，部分流份進(jìn)行交叉合并，用加號銜接（同一次 硅膠柱的流份用-銜接），例如，第一次裝柱的提取液經(jīng)洗脫后，收集的液體編號分別為1、 2……78,第二次裝柱的提取液經(jīng)洗脫后，收集的液體編號分別為1'、2'……84'）。
[004引第S步：
[0049] 3-7+3'-7'利用硅膠(200-300目）層析分離，50:1至10:1的甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫， 經(jīng)化C分析，合并色譜圖類似的流份，并將至少含有搬皮素和根皮素之一的流份合并，按照 洗脫的先后順序，編號為12-14。
[(K)加]第四步：
[0051]將第S步中12-14組分利用DAC制備色譜分離，60%至90%甲醇-水梯度洗脫，結(jié)合 HPLC分析，得到僅含兩個(gè)單體化合物搬皮素、根皮素的混合物(簡稱C0-7)，共8.4mg。
[0化2] 第五步:表征提取物 [0化3] 將C0-7進(jìn)行質(zhì)譜檢測。
[0054] 將C0-7進(jìn)行核磁共振圖譜檢巧U，C0-7的1h-NMR、UC-NMR分別如圖2和3所示。
[0化5] 在Ih-NMR中，可見一組苯環(huán)間位質(zhì)子信號S6.15(m，brs)和S6.35(lH，brs)分別歸 屬于搬皮素的H-6和H-8，一組ABX偶合系統(tǒng)的芳香質(zhì)子信號S6.86(IH，d，J = 8.3Hz)，S7.60 aH，d，J = 8.3Hz)和S7.71(lH，s)分別歸屬于搬皮素的H-2'，H-3'和H-6'；一組對稱苯環(huán)間 位質(zhì)子信號S5.79 (2H，brs)歸屬于根皮素的H-6和H-8，一組AA ' BB '偶合系統(tǒng)的芳香質(zhì)子信 號S6.67(2H，d，J = 8.3Hz)，S7.01(2H，d，J = 8.3Hz)分別歸屬于根皮素的H-2'，6'和H-3'， 6'，一組A2B2偶合系統(tǒng)的質(zhì)子信號S3.2laH，m)和S2.81(lH，m)分別歸屬于根皮素的H-a和 H-0。在I3C-NMR中，可W找到搬皮素和根皮素完整的碳信號，兩者比例約為2:1，將碳譜和氨 譜數(shù)據(jù)分別與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的搬皮素、根皮素的色譜圖對照，基本一致。因此，可鑒定C0-7 為搬皮素和根皮素的混合物。
[0056]結(jié)果證明C0-7含有搬皮素和根皮素兩種化合物。
[0化7] 經(jīng)檢測，0)-7的純度為97.5%。
[0058]結(jié)合上述表征結(jié)果可W確定搬皮素的分子式如下式(一），根皮素的分子式如下式 (二)。
[(K)SS
[0060] 實(shí)施例2 [0061 ]第一步：
[0062] 將自然陰干的油茶干燥葉粉碎過60目篩，取20kg分兩批用40%乙醇按料液比I: 2.5在70-80°C加熱回流，重復(fù)提取2次，每次提取化，合并所得上清液，過濾獲得上清液，減 壓濃縮至無醇味，得到原體積約一半的粗提液樣品，備用。
[0063] 第二步：
[0064] 用工業(yè)酒精處理約IOL的DlOl型大孔吸附樹脂，用水洗到無醇味，將第一步得到的 提取液分兩次上樣，依次用水、15%乙醇、75%乙醇洗脫，每個(gè)梯度洗脫4.5倍柱體積，根據(jù) TLC和HPLC分析結(jié)果，各部位合并濃縮。
[0065] 80%乙醇洗脫后收集的樣品濃縮干燥(約150g)，溶解于10:1的二氯甲燒-甲醇中， 拌入300g薄層層析硅膠(200~300目），水浴揮干，分兩次裝柱，其中每次空白層裝填硅膠約 SOOgo
[0066] 流動(dòng)相系統(tǒng)為二氯甲燒-甲醇(9:1至1:2.5梯度洗脫），每SOOmL收集為一次，經(jīng)過 TLC檢測合并含有搬皮素、根皮素中至少一種的流份段，命名為第一順序組分。
[0067] 第S步：
[006引第一順序組分利用硅膠(200-300目）層析分離，45:1至9:1的甲醇-水進(jìn)行梯度洗 脫，經(jīng)化C分析，合并色譜圖類似的流份，并將至少含有搬皮素和根皮素之一的流份合并，命 名為第二順序組分。
[0069] 第四步：
[0070] 將第S步中第二順序組分利用DAC制備色譜分離，55 %至85 %甲醇-水梯度洗脫， 結(jié)合HPLC分析，得到僅含兩個(gè)單體化合物搬皮素、根皮素的混合物(簡稱C0-7)，共8.7mg。
[0071] 第五步:表征提取物
[0072] 同樣，采用質(zhì)譜和iH-NMR、"C-NMR進(jìn)行表征，結(jié)果與實(shí)施例1相同，C0-7為搬皮素、 根皮素的混合物。
[0073] 實(shí)施例3
[0074] 第一步：
[0075] 將自然陰干的油茶干燥葉粉碎過60目篩，取20kg分兩批用60%乙醇按料液比1: 3.5在70-80°C加熱回流，重復(fù)提取2次，每次提取化，合并所得上清液，過濾獲得上清液，減 壓濃縮至無醇味，得到原體積約一半的粗提液樣品，備用。
[0076] 第二步：
[0077] 用工業(yè)酒精處理約IOL的DlOl型大孔吸附樹脂，用水洗到無醇味，將第一步得到的 提取液分兩次上樣，依次用水、25 %乙醇、85 %乙醇洗脫，每個(gè)梯度洗脫3.5倍柱體積，根據(jù) TLC和HPLC分析結(jié)果，各部位合并濃縮。
[0078] 80%乙醇洗脫后收集的樣品濃縮干燥(約150g)，溶解于10:1的二氯甲燒-甲醇中， 拌入300g薄層層析硅膠(200~300目），水浴揮干，分兩次裝柱，其中每次空白層裝填硅膠約 SOOgo
[0079] 流動(dòng)相系統(tǒng)為二氯甲燒-甲醇（11:1至1:3.5梯度洗脫），每SOOmL收集為一次，經(jīng)過 TLC檢測合并含有搬皮素、根皮素中至少一種的流份段，命名為第一順序組分。
[0080] 第S步：
[0081] 第一順序組分利用硅膠(200-300目）層析分離，55:1至11:1的甲醇-水進(jìn)行梯度洗 脫，經(jīng)化C分析，合并色譜圖類似的流份，并將至少含有搬皮素和根皮素之一的流份合并，命 名為第二順序組分。
[0082] 第四步：
[0083] 將第S步中第二順序組分利用DAC制備色譜分離，65%至95%甲醇-水梯度洗脫， 結(jié)合HPLC分析，得到僅含兩個(gè)單體化合物搬皮素、根皮素的混合物(簡稱C0-7)，共8. Img。
[0084] 第五步:表征提取物
[0085] 同樣，采用質(zhì)譜和iH-NMR、"C-NMR進(jìn)行表征，結(jié)果與實(shí)施例1相同，C0-7為搬皮素、 根皮素的混合物。
[0086] 最后應(yīng)說明的是：W上各實(shí)施例僅用W說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制;盡 管參照前述各實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依 然可W對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn) 行等同替換；而運(yùn)些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù) 方案的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 從油茶葉中提取槲皮素及根皮素的方法，其特征在于，包括以下步驟： A:以乙醇溶液為溶劑，對油茶葉進(jìn)行浸提，得到粗提液； B:以DlOl大孔吸附樹脂吸附富集，依次用水、15-25wt%乙醇溶液和75-85wt%乙醇溶 液對所述粗提液進(jìn)行恒定洗脫； C:將所述75-85wt%乙醇溶液洗脫得到的洗脫液進(jìn)行硅膠層析分離，用9-11:1至1: 2.5-3.5梯度的二氯甲烷-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液，經(jīng)色譜分析，合并含有根皮 素、槲皮素的餾分段，命名為第一順序組分； D:將所述第一順序組分進(jìn)行硅膠層析分離，用45-55:1至9-11:1梯度的二氯甲烷-甲醇 進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液，經(jīng)色譜分析，合并含有根皮素、槲皮素的餾分段，命名為第 二順序組分； E:采用DAC色譜柱，用55-65 %至85-95 %梯度的甲醇-水為流動(dòng)相對所述第二順序組分 進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液，經(jīng)色譜分析，合并含有根皮素、槲皮素的餾分段。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從油茶葉中提取槲皮素及根皮素的方法，其特征在于，所述步 驟A中，浸提的方法為:料液比為1:3，在70-80°C下回流提取，乙醇溶液優(yōu)選為40-60 %的乙 醇-水溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從油茶葉中提取槲皮素及根皮素的方法，其特征在于，所述步 驟B中，每個(gè)梯度洗脫所用流動(dòng)相的體積為柱體積的3.5-4.5倍。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從油茶葉中提取槲皮素及根皮素的方法，其特征在于，所述步 驟C中，所用的硅膠的粒徑為200-300目；所述梯度洗脫優(yōu)選為：用9-10:1至1:2.5-3梯度的 二氯甲烷-甲醇進(jìn)行梯度洗脫。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從油茶葉中提取槲皮素及根皮素的方法，其特征在于，所述步 驟D中，所用的硅膠的粒徑為200-300目。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的從油茶葉中提取槲皮素及根皮素的方法，其特征在于，所 述步驟D中，所述50:1~10:1的二氯甲烷-甲醇。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從油茶葉中提取槲皮素及根皮素的方法，其特征在于，所述步 驟E中，60 %~90 %甲醇-水。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從油茶葉中提取槲皮素及根皮素的方法，其特征在于，在所述 步驟C中，所述硅膠層析分離之前還包括:將所述75-85wt%乙醇溶液洗脫得到的洗脫液濃 縮干燥。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的從油茶葉中提取槲皮素及根皮素的方法，其特征在于，在所述 步驟C中，在所述濃縮干燥之后和所述硅膠層析分離之前還包括:溶解于二氯甲烷-甲醇中， 并拌入硅膠，之后水浴除去溶劑。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從油茶葉中提取槲皮素及根皮素的方法，其特征在于，在所 述步驟A中，在所述浸提之后還包括:濃縮除醇。
【文檔編號】C07C49/83GK105924420SQ201610279409
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】曹清明, 包莉圓, 鐘海雁, 付紅軍
【申請人】中南林業(yè)科技大學(xué)