靶向線粒體的抗腫瘤五環(huán)三萜衍生物及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一類五環(huán)三萜衍生物，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)或式(Ⅴ)所示：其中，R1為氫、甲?；?、乙酰基或(n＝1?19)，R2為(n＝1?19)，R3為羥基，甲氧基或乙氧基，R4為(n＝1?19)。本發(fā)明的化合物具有較好的抗腫瘤活性，通過將天然化合物靶向至線粒體，能更好的應(yīng)用于抗腫瘤藥物的開發(fā)。且化合物為鹽類，大大提高了藥物的水溶性及改善其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
【專利說明】
革田向線粒體的抗腫瘤五環(huán)H瞄衍生物及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一類祀向線粒體的抗腫瘤五環(huán)=祗衍生物及其制備方法與應(yīng)用，具體 設(shè)及白枠醇、白枠?biāo)?、齊墳果酸、熊果酸和乳香酸的TPP衍生物及其制備方法與應(yīng)用，屬于醫(yī) 藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 線粒體作為細(xì)胞內(nèi)十分重要的一類細(xì)胞器，不僅承擔(dān)著為細(xì)胞供能的工作，還是 控制細(xì)胞程序性死亡(又稱細(xì)胞調(diào)亡）的重要細(xì)胞器。研究表明，多數(shù)抗腫瘤藥的作用機(jī)制 與引發(fā)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡有關(guān)。而線粒體在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞相比，發(fā)生了一些形態(tài)和生理 功能的變化，比如糖酵解變?yōu)橹饕┠芊绞剑琺tDNA發(fā)生突變，ROS增多及線粒體膜電位增高 等巧uropean Journal of BiochemistiT, 1999,264,687-701.)。腫瘤細(xì)胞中線粒體的運(yùn)一 系列變化使得我們將藥物特異性地祀向至腫瘤細(xì)胞的線粒體中并進(jìn)一步引發(fā)調(diào)亡成為可 能。目前為止常見的將抗腫瘤化合物運(yùn)載至線粒體的方法主要有=類：納米載體，多膚載 體，及電子移位親脂性陽離子（Delocalized Lipophilic Cation ,DLC)等（Molecular nutrition&food research,2009,53,9-28；Environmental and molecular mutagenesis, 2010,51,462-75. )dDLC-般由一個(gè)親水的帶電中屯、和一個(gè)疏水的核屯、連接而成，利用腫瘤 細(xì)胞中線粒體遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞的膜電位選擇性積聚，從而達(dá)到特異性祀向至線粒體的目的 (Annual review of pharmacology and toxicology，2007,47,629-656.)。其中最常用的 DLC是S苯基麟(TPP)，目前已有多種抗腫瘤化合物與TPP連接后大幅提高其抗腫瘤活性或 改善腫瘤的抗藥性。如白襲蘆醇(化rrent陸armaceutical Desi即，2014,20,172-179)，沒 食子酸(J.Med. Chem, 2014,57,2440-2454)等。
[0003] 很多五環(huán)=祗類化合物如乳香酸、齊墳果酸、白枠?biāo)?、白枠醇等本身具有廣泛的生 理和藥理活性，尤其在抗腫瘤方面有突出的表現(xiàn)(Molecule ,2015，20,1610-1625 ;Cancer Letters,2012,320,158-170)，W白枠?biāo)?、白枠醇為例（Journal of Applied Biomedicine， 2012,10,7-12)，白枠醇和白枠?biāo)崾谴罅看嬖谟跂樐究浦参飽槝淅锏囊环N五環(huán)=祗，其結(jié)構(gòu) 式為：
[0004]
[0005] 已有研究表明，白枠?biāo)?、白枠醇的抗腫瘤機(jī)制與線粒體調(diào)亡途徑有關(guān)，包括連續(xù)激 活caspases 9,3 ,和7，清除聚腺巧二憐酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase， PARP)，繼而引發(fā)細(xì)胞色素 C和Smac蛋白由線粒體內(nèi)膜上的釋放，線粒體膜電位去極化，W及 調(diào)亡蛋白Bax和Bak的高表達(dá)等（Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology， 2009，105,425-432;Tumor,2012，32，2；M-238!Molecular Carcinogenesis，2010,49,630- 640;F*LoS0NE，2009,4，A;rticle ID e5361;0ncogene，2004,23,7611-7620;B;rit J 化ncer， 2010，103,43-51.)。
[0006] 但由于五環(huán)=祗類化合物普遍存在的生物利用度低，水溶性差等原因限制了它們 的臨床應(yīng)用。藥學(xué)家們對(duì)它們結(jié)構(gòu)進(jìn)行了一系列改造 W期增強(qiáng)生物利用度及水溶性并增強(qiáng) 其抗腫瘤活性，（BioMed Research International ,2015,A;rticle ID 584189 !Medicinal Research Reviews，20 I 5，35，1 1 27 - 1 1 55;European Journal of Medicinal Chemis1:ry20l5,92,648-655.)。但目前將五環(huán)S祗類化合物直接祀向到線粒體從而引發(fā)腫 瘤細(xì)胞調(diào)亡的合成方法復(fù)雜，且未做深入的機(jī)制研究（Russian Chemical Bulletin, International Edition,2013,62,188-198.)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，通過兩步合成反應(yīng)將線粒體祀向載體 與五環(huán)S祗類化合物及其衍生物連接在一起，得到了系列五環(huán)S祗類化合物的TPP衍生物。 本發(fā)明的新化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性強(qiáng)，還具有較好的水溶性，有利于藥物的體內(nèi)吸 收和發(fā)揮藥效。本發(fā)明的化合物具有作為抗腫瘤藥物的潛力。由此提供了下述發(fā)明：
[000引本發(fā)明的一個(gè)方面設(shè)及一類五環(huán)=祗衍生物，其結(jié)構(gòu)式如式I、式n、式虹、式IV或 式V所示：
[00C
[0010] 其中，町為氨、甲酯基、乙酷基或.
n=l-19)，
[00川防巧
：n=l-19)，R3為徑基，甲氧基或乙氧基，R4夫 (n = l-19) O
[0012]上述化合物的實(shí)例如下：
[0013
[0014]本發(fā)明的另一方面設(shè)及上述五環(huán)=祗衍生物的制備方法，其反應(yīng)路線如下所示： [001引式I制備路線：
[0016]
[001
[001
[001
[00方
[0021]
[0022]
[0024] 式虹、IV其他化合物制備方法同式n。 [00巧]式V制備路線：
[0023]
[0026]
[0027] 式V其他化合物通過酷氯試劑酷化法制備。
[0028] 所述方法包括：W五環(huán)=祗化合物為起始原料，使五環(huán)=祗化合物的至少一個(gè)徑 基進(jìn)行醋化反應(yīng)，得中間體化合物，然后將中間體化合物與=苯基麟發(fā)生成鹽反應(yīng)，生成式 I、式n、式虹或式IV所示的五環(huán)=祗衍生物；
[0029] 或者，將S苯基麟與1,5-二漠戊燒在乙臘中發(fā)生成鹽反應(yīng)，然后將成鹽反應(yīng)的產(chǎn) 物與乙二胺在四氨巧喃中發(fā)生取代反應(yīng);將乳香酸與氯化亞諷發(fā)生醋化反應(yīng)后，再與上述 取代反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行酷胺化反應(yīng)，生成式（V)所示的五環(huán)=祗衍生物。
[0030] 上述方法，生成式（I)、式（n)、式（虹）或式(IV)所示的五環(huán)=祗衍生物的過程中， 所述醋化反應(yīng)采用的是抓C/DMAP法，W二氯甲燒作為溶劑，室溫下反應(yīng)，五環(huán)S祗化合物、 EDC(l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）、DMAP(4-二甲氨基化晚）與5-漠戊酸和 二氯甲燒加入量的比為：Imo 1: (2.5-2.6 )mo 1: (0.4-0.5 )mo 1: (4-4.1 )mo 1:2000mL。
[0031] 上述方法，生成式（I)、式（n)、式（虹）或式(IV)所示的五環(huán)=祗衍生物的過程中， 所述成鹽反應(yīng)是W乙臘作為溶劑，中間體化合物、S苯基麟和乙臘加入量的比為1111〇1:(3- 3.1 )mo 1:1 OOOmL，70-80 °C 加熱回流。
[0032] 上述方法，生成式（V)所示的五環(huán)=祗衍生物的過程中，=苯基麟、1,5-二漠戊燒 和乙臘加入量的比為：1111〇1:(5-5.2)111〇1:2000111^70-80°(：加熱回流1211，得成鹽反應(yīng)的產(chǎn) 物。
[0033] 上述方法，生成式（V)所示的五環(huán)=祗衍生物的過程中，成鹽反應(yīng)的產(chǎn)物、乙二胺 和四氨巧喃加入量的比為：Imol: (5-5.2)mol: ISOOmL，室溫反應(yīng)化，得取代反應(yīng)的產(chǎn)物。
[0034] 上述方法，生成式（V)所示的五環(huán)=祗衍生物的過程中，所述醋化反應(yīng)的反應(yīng)條 件為：11-幾基-e-乙酷乳香酸Imol在1000 mL氯化亞諷中80°C加熱回流化，蒸除溶劑。
[0035] 上述方法，生成式（V)所示的五環(huán)=祗衍生物的過程中，所述酷胺化反應(yīng)的反應(yīng) 條件為:將醋化反應(yīng)的產(chǎn)物用2000mL二氯甲燒溶解后，(TC冰浴下緩慢滴加取代反應(yīng)的產(chǎn)物 和=乙胺各3mol，室溫?cái)埌?地。
[0036] 當(dāng)式I的Ri為甲酯基或乙酷基時(shí)，所述方法還包括將五環(huán)=祗化合物的一個(gè)徑基 進(jìn)行醋化反應(yīng)后，再通過酷氯試劑酷化法制備的步驟。
[0037] 當(dāng)式n、式虹或式IV的R3為甲氧基或乙氧基時(shí)，所述方法還包括將五環(huán)=祗化合 物的一個(gè)徑基進(jìn)行醋化反應(yīng)后，再通過面代控與簇基的醋化反應(yīng)制備的步驟。
[0038] 上述方法中，所述五環(huán)=祗化合物選自白枠醇、白枠?biāo)帷R墳果酸、熊果酸和乳香 酸。
[0039] 本發(fā)明還提供上述五環(huán)=祗衍生物在制備抗腫瘤類藥物中的用途。
[0040] 本發(fā)明的再一方面設(shè)及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的五環(huán)=祗 衍生物。
[0041 ]優(yōu)選的，所述藥物組合物還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。
[0042] 優(yōu)選的，所述載體包括如生理鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇或它們的組 合物;賦形劑可W選自憐酸巧，硬脂酸儀，滑石粉，糊精，淀粉，凝膠纖維素，甲基纖維素，簇 甲基纖維素鋼鹽或聚乙締化咯燒酬。
[0043] 優(yōu)選的，所述藥物組合物為固體口服制劑或腸胃外給藥制劑。
[0044] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述藥物組合物為片劑、分散片、腸溶片、巧嚼片、口崩片、膠囊、糖 衣劑、顆粒劑、干粉劑、口服溶液劑、注射用小水針、注射用凍干粉針、大輸液或小輸液。
[0045] 術(shù)語"組合物"意指包括包含指定量的各指定成分的產(chǎn)品，W及直接或間接從指定 量的各指定成分的組合產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。
[0046] 通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1 -90重量％的本發(fā)明五環(huán)=祗衍生物。藥物組合物 可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。
[0047] 我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明制備的五環(huán)=祗衍生物是可W用于制備預(yù)防和/或治 療腫瘤的藥劑。
[0048] 因此，本發(fā)明的另一個(gè)主題是，一種治療腫瘤的方法，所述方法包括施用治療有效 量的如上所述的式（I)、式（n)、式（虹)或式(IV)的五環(huán)=祗衍生物。
[0049] 本文使用的術(shù)語"治療有效量"表示，治療、改善疾病或病癥，或者表現(xiàn)出可檢測(cè)的 治療效果所需的治療劑的量。
[0050] 本發(fā)明的化合物在相當(dāng)寬的劑量范圍內(nèi)是有效的。實(shí)際服用本發(fā)明式（I)所示的 化合物的劑量可由醫(yī)生根據(jù)有關(guān)的情況來決定。運(yùn)些情況包括:被治療者的身體狀態(tài)、給藥 途徑、年齡、體重、對(duì)藥物的個(gè)體反應(yīng)，癥狀的嚴(yán)重程度等。
[0051] 本發(fā)明的有益效果：
[0052] 本發(fā)明的五環(huán)S祗及其衍生物的TPP衍生物，其制備方法簡(jiǎn)單，工藝穩(wěn)定，可操作 性強(qiáng)，原料可從植物中提取，亦可由成熟的化學(xué)合成工藝轉(zhuǎn)化得到。
[0053] 藥理活性實(shí)驗(yàn)證明該系列結(jié)構(gòu)改造化合物具有較好的抗腫瘤活性，通過將天然化 合物祀向至線粒體，能更好的應(yīng)用于抗腫瘤藥物的開發(fā)。且化合物為鹽類，大大提高了藥物 的水溶性及改善其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
【附圖說明】：
[0054] 圖1:化合物1-曰、化合物I-b與白枠醇的ICso(IiM)比較結(jié)果；
[0055] 圖2:化合物Il-a與白枠?biāo)岬难郓?山〇比較結(jié)果；
[0化6] 圖3 :化合物I-a，I-b，Il-a，W及白枠醇、白枠?biāo)釋?duì)A549細(xì)胞在扣M濃度下的抑制 率.
[0057] 圖4:不同濃度下化合物I -a對(duì)K562細(xì)胞形態(tài)的變化；
[0058] 圖5:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度化合物I-a誘發(fā)K562細(xì)胞調(diào)亡結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0059] 結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0060] 實(shí)施例1:化合物I-a制備
[0061] 將白枠醇（1.0g，2.26mmol)與抓Ca.09g，9.04mmol)、DMAP(112mg，0.90mmol)、5- 漠戊酸（1.68g，9.04mmol)混合置于100ml圓底燒瓶中，加入40ml二氯甲燒，常溫反應(yīng)約llh， TLC檢測(cè)反應(yīng)達(dá)平衡，加入S蒸水洗S次后有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥化后抽濾除去硫酸鋼， 減壓濃縮，硅膠柱層析得化合物1的白色粉末250mg，將此白色粉末溶于IOml乙臘中，加入 325mg( 1.24mmol)TPP，油浴升溫至75-80°C，磁力攬拌2地后化C檢測(cè)反應(yīng)基本完全，減壓蒸 干溶劑后，硅膠柱層析得產(chǎn)物白色晶體I-a 30mg Jata for I-a: Mp :87-99 °C [a ]d2d =巧.6。 (c0.1，Ol3〇H)，iHMffi(CDCl3,600MHz):7.89-7.85(m，6H)，7.79(ddd，J = 7.4，1.6,0.9Hz， 3H)，7.72-7.68(m，6H)，4.67(d，J=1.7Hz，lH)，4.58(s，lH)，4.20-4.15(m，lH)，4.00-3.92 (m，2H)，3.77(d，J=11.0Hz，lH)，3.18(dd，J=11.5,4.7Hz，lH)，2.42(t，J = 6.Wz，2H), 2.41-2.36(m,IH)，2.06-2.00(m，2H),1.66,1.00,0.97,0.95,0.82，0.76(s，3H)(6-CH3).Uc 匪R(CDCl3,150MHz)150.14,134.95,133.78,130.45,118.68,118.11,109.86,78.92, 77.25,77.04,76.83,62.55,55.26,53.45,50.33,48.73,47.69,46.35,42.67,40.85， 38.86,38.68,37.56,37.13,34.51,34.16,33.47,29.69,29.55,27.99,27.38,27.00, 25.48,25.15,22.78,22.45,22.04,20.76,19.09,18.27,16.06,15.38,14.74;皿-ESI-MS (m/z) :787.5231 [M-化]+。
[0062] 合成路線如下：
[0063
[0064] 實(shí)施例2:化合物I-b制備
[0065] 操作同化合物1-曰，得白色固體。Data forl-b :Mp : 145-154°C [a]D2〇 = +23.2° (C 0.1，C出OH)，Ih NMR(CD3OD 400MHz，）7.94-7.88(m，細(xì)）7.87-7.76(m，24H)4.73(S，IH)，4.61 (s，2H)，4.44(d，J = 5.1Hz，lH)，4.39(dJ=10.4Hz，lH)，3.83(dJ=11.0Hz，lH)，3.55- 3.44(m，5H)，2.49-2.38(m，5H)，1.97-1.84(m，5H).1.72 1.071.03 0.89 0.83 0.81(s，3H) (6-CH3).i3c 應(yīng)R(CD30D，100MHz):173.59，173.10，149.98，134.95，133.45，130.20, I18.90,118.04,109.26,81.04,63.89,62.20,55.31,50.22,48.54,48.18,47.86,47.60， 47.22，47.20，47.10，47.00，46.36，42.45，41.85，40.71，38.09，37.54，36.84(S)，：M.18， 33.91,33.17,32.77,29.90,29.34,28.90,27.19,26.80,25.54,25.08,23.35,23.06, 22.78,21.71,21.39,20.87,20.54,17.94,15.71,15.28,13.87,13.10,10.08JR-ESI-MS (m/z):[(M-2Br)/2]+。
[0066] 合成路線如下：
[0067]
[006引實(shí)施例3:化合物I-C制備
[0069] 將白枠醇（5.0邑，11.3臟〇1)與抓(：（5.45邑，45.2臟〇1)、014口（560111邑，4.5臟〇1)、5-漠 戊酸（8.4g,45.2mmol)混合置于500ml圓底燒瓶中，加入200ml二氯甲燒，常溫反應(yīng)約Uh， TLC檢測(cè)反應(yīng)達(dá)平衡，加入S蒸水洗S次后有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥化后抽濾除去硫酸鋼， 減壓濃縮，硅膠柱層析得化合物1的白色粉末3g，取上述化合物1 1.19g溶于20mL甲酸中，油 浴升溫至85 °C回流攬拌化后化C檢測(cè)反應(yīng)基本完全，S蒸水洗掉溶劑，用二氯甲燒萃取S次 后機(jī)相用無水硫酸鋼干燥化后抽濾除去硫酸鋼，減壓濃縮，硅膠柱層析得化合物3 700mg， 取上述化合物3 200111旨溶于101111乙臘中，加入325111旨（1.24111111〇1川?？，油浴升溫至75-80°(：，磁 力攬拌24h后化C檢測(cè)反應(yīng)基本完全，減壓蒸干溶劑后，厚制備版制備得黃色化合物I- CIOOmgO
[0070] 合成路線如下：
[007
[007^」 頭她例4:化甘物ii-a制街
[0073]將白枠?biāo)幔?.5g，1.09mmol)與抓 C(0.527g，2.73mmol)、DMAP(54mg，0.44mmol)、5- 漠戊酸（0.817g,4.36mmol)混合置于100ml圓底燒瓶中，加入20ml二氯甲燒，常溫反應(yīng)約 1化，TLC檢測(cè)反應(yīng)達(dá)平衡，加入S蒸水洗S次后有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥化后抽濾除去硫 酸鋼，減壓濃縮，硅膠柱層析得化合物4的白色粉末250mg，將此白色粉末溶于IOml乙臘中， 加入292mg( 1.1 Immol)TPP，油浴升溫至75-80°C，磁力攬拌2地后化C檢測(cè)反應(yīng)基本完全，減 壓蒸干溶劑后，硅膠柱層析，得白色固體II-aeData for II-a:Mp: 135-143°C[a]D2D = + 15.2°(c0.1，Ol3〇H)，iHNMR(CDCl3,400MHz)7.85(dd，J=12.6,7.5Hz，6H)，7.79(dd，J = 8.0,6.1Hz，3H)，7.69(td，J = 7.6,3.4Hz，6H)，4.73(s，lH)，4.61(s，lH)，4.37(dd，J=10.6， 5.8Hz，lH)，3.91(t J = 14.1Hz，2H)，3.01(td J=10.5,4.5Hz，lH)，2.38(t，J = 6.細(xì)z，2H)， 2.28(d，J=12.8Hz，lH)，2.18(td，J=12.6,3.4Hz，lH)，2.04(dd，J = 14.6,7.1Hz，2H)，1.96 (dd，J=16.4,7.1Hz，2H)，1.69,0.96,0.81 0.75,0.72(s，3H)(6-CH3).i3c 醒R(CDCl3, lOOMHz)，172.94，150.47，1：M.98，133.75，130.48，118.77，117.92，109.68，80.86，77.36， 77.05,76.73,65.31,56.33,55.38,50.37,49.29,46.94,42.41,41.96,40.67,38.36， 37.78,37.10,34.20,33.89,32.17,30.58,30.13,29.70,29.12,28.02,25.44,23.71, 23.35,23.10,22.85,21.98,20.87,19.37,18.13,16.56,16.13,14.65,14.10,11.1I;皿- ESI-MS(m/z):801.5020[M-化r。
[0074]合成路線如下：
[007
[0076] 實(shí)施例5:化合物n-b制備
[0077] 將白枠?biāo)幔?.0 g，2.19mmol)與抓C( I. 〇5g，5.47mmol)、DMAP( 108mg，0.88mmol)、5- 漠戊酸（1.63g, 8.76mmo I)混合置于200ml圓底燒瓶中，加入40ml二氯甲燒，常溫反應(yīng)約I Ih， TLC檢測(cè)反應(yīng)達(dá)平衡，加入S蒸水洗S次后有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥化后抽濾除去硫酸鋼， 減壓濃縮，硅膠柱層析得化合物4的白色粉末600mg，將此白色粉末300mg (0.48mmo 1)與CHsI (127.5化，L2.04mmol)、K2C03(284.5mg，2.04mmo 1)溶于20mL DMF中常溫反應(yīng)2地后lie檢測(cè) 反應(yīng)結(jié)束，加入=蒸水洗掉DMF和K2CO3，有機(jī)相用二氯甲燒萃取，萃取=次后棄掉水層，有機(jī) 層用無水硫酸鋼干燥化后抽濾除去硫酸鋼，減壓濃縮，硅膠柱層析得化合物5的白色固體 20〇111邑，將此白色固體溶于1〇1111乙臘中，加入376111邑（1.2431111]1〇1川口口，油浴升溫至75-80°[，磁 力攬拌2地后化C檢測(cè)反應(yīng)基本完全，減壓蒸干溶劑后，硅膠柱層析得產(chǎn)物乳黃色固體n-b。 Data forn-b:iH 醒R(MeOD 600MHz)S7.91-7.88(m，3H)，7.83-7.79(m，6H)，7.76(ddd，J = 8.2,5.5,2.8Hz，6H)，4.72(dJ=l.Wz，lH)，4.60(dJ=1.4Hz，lH)，4.40(ddJ=11.6, 4.9Hz，lH)，3.66(s，3H),3.51-3.44(m，2H),3.00(td,J=10.9,5.1Hz，1H),2.40(t,J= 7.1Hz，2H)，1.69(d，J = 7.Wz，3H)，1.01(s，3H)，0.94(s，3H)，0.86(s，3H)，0.80(s，3H)， 0.77( S，3H).UC 匪 R(MeOD 150MHz )5176.23,173.06,150.44,1:34.95,134.93,133.46， 133.39,130.23,130.14,118.74,118.16,108.91,81.06,59.64,56.34,55.38,50.43， 49.16,42.17,40.57,38.24,38.11,37.46,36.88,36.55,34.02,33.11,31.73,30.26， 29.36,27.16,25.64,25.52,25.42,23.34,21.68,21.66,21.27,20.92,20.71,18.16, 17.85，15.66，15.37，15.21，13.76，13.30;HR-ESI-MS(m/z):815.5176[M-^]+.
[0078]合成路線如下：
[0079
[0080] 實(shí)施例6:化合物V制備：
[0081 ]將TPP(2g，6.84mmo 1)與 1，5-二漠戊燒(4.7mL，34.2mmo 1)溶于20mL乙臘中，油浴升 溫至75-80°C，磁力攬拌1化后化C檢測(cè)反應(yīng)基本完全，減壓蒸干溶劑后，硅膠柱層析得化合 物6的黃色油狀液體2.8g。將該油狀液體(2.8旨，5.69111111〇1)與乙二胺（1.91111，28.44111111〇1)溶 于30mL四氨巧喃中室溫?cái)埌杌蠡疌檢測(cè)反應(yīng)基本完全，減壓蒸干溶劑后，使用Sphadex LH-20凝膠柱分離得化合物7的黃色油狀液體2g。取11-幾基-0-乙酷乳香酸(AKBA，80mg, 0.156111111〇1)溶于21]11^氯化亞諷中，油浴升溫至75-80°日，磁力攬拌化后化〔檢測(cè)反應(yīng)完全，將 氯化亞諷減壓蒸干后，將產(chǎn)物溶于10血二氯甲燒中，加入S乙胺(64.祉L，0.468mmol)，冰浴 下緩慢滴加上述化合物7 221.2mg，30min后升至室溫?cái)埌?2h后化C檢測(cè)反應(yīng)基本完全，減 壓抽濾后，用2M HCl萃取S次，有機(jī)相用無水硫酸鋼干燥化后抽濾除去硫酸鋼，厚制備版制 備得黃色化合物VSOmgeData forV:Mp:148-157°C[a]D2〇 = +37.8° (C 0.1，C出0H)，1H NMR (CDCI3 600MHz)S7.80(dt J = 6.9,3.4Hz，3H)，7.77-7.73(m，細(xì)），7.70(tdJ = 7.8,3.細(xì)z， 6H)，7.44(d，J = 4.7Hz，lH)，5.50(s，lH)，4.10(q，J = 7.2Hz，lH)，3.81-3.75(m，lH)，3.61- 3.54(m，3H)，3.53-3.46(m，2H)，3.21-3.16(m，lH)，3.01(dd，J=10.8,7.0Hz，lH)，2.96- 2.86(m,3H),2.04(s,3H),1.31(s,3H),1.23(s,3H),1.14(s,3H),1.02(s,3H),0.92(s,3H), 0.79(s，3H) ,0.77 (d，J = 6.4Hz，3H).UC 醒 R(CDCl3 150MHz )5199.46,176.50,170.30， 164.90,135.20,135.18,133.57,133.51,130.62,130.53,130.45,118.27,117.70,73.96， 60.51,60.38,59.Ol,50.41,48.45,47.94,46.65,45.03,43.75,40.89,39.26,37.31， 36.57,34.86,33.96,32.93,30.88,29.66,28.87,27.48,27.11,26.68,26.57,24.56， 24.04,23.95,22.05,21.71,21.55,21.52,21.43,21.11,21.04,20.45,19.35,18.32, 17.40，14.17，13.09.HR-ESI-MS(m/z):885.5721[M-^] -。
[0082]合成路線如下：
[0083]
[0084] 實(shí)施例7 :白枠醇，白枠?biāo)峤Y(jié)構(gòu)改造化合物與白枠醇，白枠?biāo)峥鼓[瘤活性對(duì)照研究
[0085] 1.實(shí)驗(yàn)材料
[0086] 對(duì)照藥物：白枠醇，白枠?biāo)幔?br>[0087] 實(shí)驗(yàn)藥物:本發(fā)明實(shí)施例制備的化合物I-a，化合物I-b，化合物Il-a。
[0088] 細(xì)胞培養(yǎng):K562細(xì)胞株：中科院上海細(xì)胞庫，A549細(xì)胞株：山東大學(xué)藥學(xué)院;RPMI- 1640培養(yǎng)液，胎牛血清：W色列Bioind;膜蛋白酶:美國Amresco公司;MTT(四甲基偶氮挫）， DMSO(二甲基亞諷）：美國Sigma公司;青霉素-鏈霉素溶液(100X，過濾除菌）：中國賽爾斯公 司;PBS(憐酸鹽緩沖液）：索萊寶生物有限公司。
[0089] 儀器：酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：美國Bio-Rad ;移液器：法國Gi 1 son ;生物安全柜 ISOOseries A2,二氧化碳培養(yǎng)箱:美國化ermo公司；滅菌鍋：日本松下。
[0090] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0091] 將人慢性髓原白血病細(xì)胞K562和人肺腺癌細(xì)胞A549在含10%胎牛血清，10011/1111 青霉素和lOOmg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)在5%C02,飽和濕度的37°C培養(yǎng)箱 中。
[0092] 對(duì)于K562細(xì)胞:收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成 濃度為2 X 104/mL細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板，每孔50化L，隨后每孔加入用含10 %胎牛血 清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋的50化L不同濃度的化合物，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)對(duì)照。培養(yǎng)4她后，每 孔加入10化MTT溶液(0.5mg/ml，1 %MTT)。地后終止培養(yǎng)，使用平板離屯、機(jī)將96孔板2500巧m 離屯、IOmin后小屯、洗掉上清液。每孔加入10化1二甲基亞諷，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié) 晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀〇D570nm處測(cè)量各孔的吸光值(630nm校準(zhǔn)）。
[0093] 對(duì)于A549細(xì)胞:收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成 濃度為2 X 104/mL細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板，每孔0.1 mL，生長(zhǎng)16-24h待細(xì)胞完全貼壁后 每孔加入0.1 ml不同濃度的化合物，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)對(duì)照。培養(yǎng)4她后，每孔加入IOiiLMlT溶液 (0.5mg/ml，1 %MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)地。終止培養(yǎng)，輕輕吸掉孔內(nèi)上清液。每孔加入10化1二甲基 亞諷，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀0D570nm處測(cè)量各孔 的吸光值(630nm校準(zhǔn)）。
[0094] 所有結(jié)果按公式：lgIC50 = Xm-I*(sigP-(3-Pm-h)/4)，計(jì)算出 IC50,其中 Xm:藥物 最高濃度的對(duì)數(shù)值;SigP:所有抑制率的總和；I :lg(藥物最高濃度/與最高濃度相鄰的藥物 濃度）；化:最大殺傷率;Pn:最小殺傷率。
[0095] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0096] 活性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1-表2,圖1-圖2。
[0097] 表1，化合物I-a、化合物I-b與白枠醇的眼〇(山〇比較
[009引
[0099]
[0100]
[0101] 由表1、表2,圖1，圖2可W看出：本發(fā)明制備的白枠醇，白枠?biāo)岬腡PP衍生物與母藥 相比對(duì)K562細(xì)胞株和A549細(xì)胞株表現(xiàn)出了明顯的增值抑制作用的提高，最低提高了 12.4 倍，最高提高了 31.3倍。為開發(fā)應(yīng)用新一代抗腫瘤藥物開拓了新途徑。
[0102] 同樣藥物濃度(5咖)下，本發(fā)明制備的化合物I -a，I -b，II -a，W及白枠醇、白枠?biāo)?對(duì)A549細(xì)胞的抑制率結(jié)果見圖3。
[0103] 由圖3可W看出，同等藥物濃度下，本發(fā)明制備的化合物I-a，I-b，II-a的藥理活性 與白枠醇，白枠?biāo)嵯啾龋瑢?duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用有了明顯提高。
[0104] 實(shí)施例8:化合物I-a在不同濃度下對(duì)K562細(xì)胞作用的形態(tài)變化 [01化]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0106] 實(shí)驗(yàn)藥物:本發(fā)明實(shí)施例制備的化合物I-a。
[0107] 細(xì)胞培養(yǎng):K562細(xì)胞株：中科院上海細(xì)胞庫;RPMI-1640培養(yǎng)液，胎牛血清：W色列 Bioind;膜蛋白酶:美國Amresco公司；青霉素-鏈霉素溶液（100 X，過濾除菌）：中國賽爾斯 公司
[0108] 儀器：移液器：法國Gilson;生物安全柜1300series A2,二氧化碳培養(yǎng)箱：美國 Thermo公司；滅菌鍋：日本松下。
[0109] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0110] 將人慢性髓原白血病細(xì)胞K562在含10%胎牛血清，10011/1111青霉素和100111肖/1111鏈 霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)在5 % C〇2，飽和濕度的37 °C培養(yǎng)箱中。
[0111] 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成濃度為lOVmL 細(xì)胞懸液，接種在6孔培養(yǎng)板，每孔2mL，分別設(shè)置OiiM，0.5iiM，1，5iiM，5iiM，IOiiM五個(gè)濃度梯度 加入化合物I-a，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，于倒置巧光顯微鏡下拍攝細(xì)胞形態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 4。
[0112] 由圖4可W看出，低濃度下作用24h后細(xì)胞形態(tài)尚可維持，隨濃度的增大，破裂的細(xì) 胞逐漸增多，IOyM濃度作用2地后細(xì)胞已全部死亡。由此得出結(jié)論，化合物I-a對(duì)K562的增值 抑制作用具有濃度依賴性。
[0113] 實(shí)施例9:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)化合物I-a誘發(fā)K562細(xì)胞調(diào)亡
[0114] 1.實(shí)驗(yàn)材料
[0115] 實(shí)驗(yàn)藥物:本發(fā)明實(shí)施例制備的化合物I-a。
[0116] 細(xì)胞培養(yǎng):同實(shí)施例8
[0117] 儀器：移液器：法國Gilson;生物安全柜1300series A2,二氧化碳培養(yǎng)箱：美國 Thermo公司；滅菌鍋：日本松下。流式細(xì)胞儀:美國抓。
[011引2.實(shí)驗(yàn)方法
[0119] 將人慢性髓原白血病細(xì)胞K562在含10%胎牛血清，10011/1111青霉素和100111肖/1111鏈 霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)在5 % C〇2，飽和濕度的37 °C培養(yǎng)箱中。
[0120] 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成濃度為lOVmL 細(xì)胞懸液，接種在6孔培養(yǎng)板，每孔2mL，分別設(shè)置OiiM，0.4iiM，0.6iiM，0.祉M，1. OiiM，1.六 個(gè)濃度梯度加入化合物I-a，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4她后，將細(xì)胞收集至15mL離屯、管中，170化pm 離屯、7min，棄掉上清液，用冰PBS洗一遍，棄上清。用碧云天Annexin V-FITC/PI細(xì)胞調(diào)亡試 劑盒對(duì)細(xì)胞染色:每管中加入50化L buffer重懸細(xì)胞，分別加入AnnexinV扣L，PI扣L，避 光放置染色15min。化之內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。
[0121] 由圖5可W看出，化合物I-a在0.4測(cè)濃度下對(duì)K562細(xì)胞有了明顯的調(diào)亡作用。隨著 濃度的升高，發(fā)生調(diào)亡的細(xì)胞比例逐漸增多，濃度下，有約51.8%的細(xì)胞發(fā)生了調(diào)亡。
[0122] 上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范 圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不 需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍W內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一類五環(huán)三萜衍生物，其結(jié)構(gòu)式如式i、式π、式m、式ιν或式v所示：其中，Ri為氫、甲?；⒁阴；騺V11=1-19)，R3為羥基，甲氧基或乙氧基：（n = H9)〇2. 如權(quán)利要求1所述的五環(huán)三萜衍生物，其特征在于，其是選自下列結(jié)構(gòu)的化合物：3. 權(quán)利要求1或2所述的五環(huán)三萜衍生物在制備抗腫瘤藥物中的用途。4. 一種權(quán)利要求1或2所述的五環(huán)三萜衍生物的制備方法，所述方法包括：以五環(huán)三萜 化合物為起始原料，使五環(huán)三砲化合物的至少一個(gè)羥基進(jìn)行酯化反應(yīng)，得中間體化合物，然 后將中間體化合物與三苯基膦發(fā)生成鹽反應(yīng)，生成式I、式Π 、式m或式IV所示的五環(huán)三萜 衍生物； 或者，將三苯基膦與1，5_二溴戊烷在乙腈中發(fā)生成鹽反應(yīng)，然后將成鹽反應(yīng)的產(chǎn)物與 乙二胺在四氫呋喃中發(fā)生取代反應(yīng);將乳香酸與氯化亞砜發(fā)生酯化反應(yīng)后，再與上述取代 反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，生成式v所示的五環(huán)三萜衍生物。5. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，生成式I、式π、式m或式IV所示的五環(huán) 三萜衍生物的過程中，所述酯化反應(yīng)采用的是EDC/DMAP法，以二氯甲烷作為溶劑，室溫下反 應(yīng)，五環(huán)三萜化合物、EDC、DMAP與5-溴戊酸和二氯甲烷加入量的比為：lmol: (2 · 5-2 · 6)mol: (0.4-0.5)mol:(4-4.1)mol:2000mL〇6. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，生成式I、式Π 、式m或式IV所示的五環(huán) 三萜衍生物的過程中，所述成鹽反應(yīng)是以乙腈作為溶劑，中間體化合物、三苯基膦和乙腈加 入量的比為lmo 1: (3-3 · 1 )mo 1:1 OOOmL，70-80 °C 加熱回流。7. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1或2所述的五環(huán)三萜衍生物。8. 如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物還包含一種或多種藥 學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。9. 如權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為固體口服制劑 或腸胃外給藥制劑。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為片劑、分散片、 腸溶片、咀嚼片、口崩片、膠囊、糖衣劑、顆粒劑、干粉劑、口服溶液劑、注射用小水針、注射用 凍干粉針、大輸液或小輸液。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105924492SQ201610280277
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月28日
【發(fā)明人】范培紅, 葉雅晴, 婁紅祥
【申請(qǐng)人】山東大學(xué)