豬tlr4多克隆抗體的制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬TLR4多克隆抗體的制備方法，將重組TLR4蛋白(抗原)與弗氏佐劑乳化后免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體血清；其中，重組TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。試驗(yàn)表明，本發(fā)明制備的抗體反應(yīng)性和特異性良好，由于TLR4基因是針對(duì)固有免疫應(yīng)答的重要模式識(shí)別受體Toll樣受體家族的成員，其在抗細(xì)菌性和病毒性感染疾病中發(fā)揮重要的作用，因此本發(fā)明可應(yīng)用于豬TLR4蛋白的檢測(cè)及相關(guān)研究，為研究豬細(xì)菌性和病毒性感染疾病與TLR4的相互作用機(jī)理以及病毒免疫逃避機(jī)制的打下良好基礎(chǔ)，為新型疫苗和藥物的研制提供新的靶標(biāo)。同時(shí)，本發(fā)明構(gòu)建的原核表達(dá)載體表達(dá)重組蛋白效率高，分離純化方法簡(jiǎn)單易操作。
【專利說明】
豬TLR4多克隆抗體的制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于多克隆抗體制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種豬化R4多克隆抗體的制備方 法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 化R4屬于I型跨膜蛋白，是化R家族中極為重要的成員，是固有免疫系統(tǒng)識(shí)別病原 微生物的主要受體。TLR4可識(shí)別革蘭氏陰性菌的脂多糖而在細(xì)菌感染性疾病的發(fā)生中起重 要作用。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，TLR4還廣泛參與病毒感染性疾病的發(fā)生和病毒的免 疫逃逸。TLR4是化R家族中唯--個(gè)能利用四種接頭分子(MyD88、MAL/TIRAP、TRIF和TRAM) 傳遞級(jí)聯(lián)信號(hào)的受體，通過下游IRAKW及TAF3和TRAF6,活化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如NF-kB、AP-1 和一系列的干擾素調(diào)節(jié)因子，引起炎性因子和I型干擾素的產(chǎn)生，啟動(dòng)固有免疫和獲得性免 疫應(yīng)答。
[0003] 近年來，抗病毒固有免疫研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，針對(duì)固有免疫應(yīng)答的重要模 式識(shí)別受體--Tol 1樣受體(Tol 1-1 ike receptor,化R)所研制的新型疫苗和治療藥物已 經(jīng)在臨床上用于HIV、皿V和肥V的防治。在研究豬細(xì)菌性W及病毒性疾病與化R4(豬Toll樣 受體4,TolI-Uke receptors 4)相互作用過程中，需要運(yùn)用到Western-blot、IFA、Co-IPW 及FCM等多種實(shí)驗(yàn)方法，而運(yùn)些研究方法無一不需要抗豬化R4多克隆抗體作為支撐，生物市 場(chǎng)上豬源抗體的缺乏嚴(yán)重制約著豬TLR4的相關(guān)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種豬化R4多克隆抗體的制備方法，用于研究豬 細(xì)菌性和病毒性疾病的感染機(jī)制，并通過掲示該蛋白抗細(xì)菌及病毒的機(jī)制，為開發(fā)新型疫 苗或藥物提供依據(jù)。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案:豬化R4多克隆抗體的制備方法， 將重組化R4蛋白（抗原）與弗氏佐劑乳化后免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體血清;重組化R4蛋白具 有序列表SEQ. ID. No. 1氨基酸序列。
[0006] 免疫動(dòng)物按W下操作進(jìn)行:采用第1、7、21、35天背部皮下多點(diǎn)注射的方式免疫8只 4周齡昆明小白鼠；首免時(shí)，重組蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合乳化，每只小鼠蛋白免疫 量約50化g;后續(xù)免疫則采用等量的弗氏不完全佐劑與重組蛋白進(jìn)行乳化每只小鼠蛋白免 疫量約300-50化邑。
[0007] 重組化R4蛋白是由IPTG誘導(dǎo)基因工程菌表達(dá)目的蛋白，并通過低濃度尿素溶液多 次洗涂包涵體獲得(純度較高的重組TLR4蛋白）。
[000引基因工程菌由化R4原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)獲得;TLR4原核表 達(dá)載體是由RT-PCR獲得并構(gòu)建含有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的重組載體，通過PCR獲得 序列表SEQ. ID.No.2堿基序列連接至原核表達(dá)質(zhì)粒祀T-32a( + )構(gòu)建而成。
[0009]上述制備方法獲得的豬TLR4多克隆抗體。
[0010] 豬TLR4多克隆抗體在制備抗豬攝病毒疫苗或藥物方面的應(yīng)用。
[0011] 針對(duì)目前缺乏抗豬化R4多克隆抗體用于研究豬細(xì)菌性W及病毒性疾病的現(xiàn)狀，發(fā) 明人建立了一種豬化R4多克隆抗體的制備方法，將重組化R4蛋白（抗原)與弗氏佐劑乳化后 免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體血清;其中，重組化R4蛋白具有序列表SEQ. ID.No. 1氨基酸序列。 試驗(yàn)表明，本發(fā)明制備的抗體反應(yīng)性和特異性良好，由于化R4基因是針對(duì)固有免疫應(yīng)答的 重要模式識(shí)別受體Toll樣受體家族的成員，其在抗細(xì)菌性和病毒性感染疾病中發(fā)揮重要的 作用，因此本發(fā)明可應(yīng)用于豬化R4蛋白的檢測(cè)及相關(guān)研究，為研究豬細(xì)菌性和病毒性感染 疾病與化R4的相互作用機(jī)理W及病毒免疫逃避機(jī)制的打下良好基礎(chǔ)，為新型疫苗和藥物的 研制提供新的祀標(biāo)。同時(shí)，本發(fā)明構(gòu)建的原核表達(dá)載體表達(dá)重組蛋白效率高，分離純化方法 簡(jiǎn)單易操作。
【附圖說明】
[0012] 圖 1是IIJM-KZ大片段DNA PCR電泳圖，圖中：M:DNA Marker DL2000, IJLIM-KZ大 片段DNA PCR產(chǎn)物。
[OOK] 圖2是原核表達(dá)質(zhì)粒PCR(左）和EcoR I/Not I雙酶切電泳圖（右），圖中：M:DNA Marker化2000/5000，1:原核表達(dá)質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，2:原核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。
[0014] 圖3是SDS-PAGE分析重組菌pET-l'LIM(170)表達(dá)的化34結(jié)果，圖中：M:非預(yù)染蛋白 Marker，1:未進(jìn)行誘導(dǎo)的重組菌菌體2:0.05mM IPTG 30°C誘導(dǎo)重組菌化后收集的菌體，3和 4:分別為0.05mM IPTG 30°C誘導(dǎo)重組菌化后裂解菌體得到的上清和沉淀。
[001引圖4是重組蛋白HIS標(biāo)簽的檢測(cè)，圖中：M:預(yù)染蛋白Marker。
[0016]圖5是多克隆抗體與重組蛋白反應(yīng)性的檢測(cè)結(jié)果圖，圖中:M:預(yù)染蛋白Marker。 [0017]圖6是多克隆抗體應(yīng)用的檢測(cè)結(jié)果圖，圖中:M:預(yù)染蛋白Marker,0-4化.p.i分別是 PK-15細(xì)胞感染豬攝病毒0、12、24、36和4她后收集的細(xì)胞總蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)施例1構(gòu)建TLR4原核表達(dá)載體和基因工程菌。
[0019] 根據(jù) GenBank 中 Sus scrofa toll-like receptor A(^ra)IiiRNA(登錄號(hào)： KF460453.1)氨基酸序列分析其親疏水性及線性表位，確定原核表達(dá)基因序列為2043-2052 共510bp，核巧酸序列和氨基酸序列分別如S序列表SEQ.ID.No.3和序列表SEQ.ID.No.l所 示，并設(shè)計(jì)目的基因的克隆引物F1/R1和原核表達(dá)引物F2/R2。采集感染豬攝病毒的PK-15細(xì) 胞，抽提細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄，利用引物F1/R1擴(kuò)增出TLR4-KZ大片段(621bp)(圖1)，其核巧 酸序列如序列表SEQ. ID.No. 2所示。W化R4-KZ質(zhì)粒為模板，利用引物F2/R2PCR擴(kuò)增得到原 核表達(dá)序列化R4(170)，其核巧酸序列如序列表SEQ. ID.No. 3所示。反轉(zhuǎn)錄體系如下:RNA模 板 15]iL，01igo 肌化L，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶化L，5 Xfirst buffer 扣L，RNase inhibitor 化L， dNTP化L。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?2°Clh，95°C5min。PCR反應(yīng)體系如下：模板化L，2XTaqPCR Mastermix 12.扣L，上游引物和下游引物各0.扣L，d地2〇 9.5化。PCR程序如下：95°C預(yù)變性 5min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)30次;72°C終延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后 進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收目的基因片段，與PMD18-T載體連接，所獲得質(zhì)粒經(jīng)華 大基因公司測(cè)序確認(rèn)與GenBank中目的基因序列一致。
[0020] 設(shè)計(jì)的克隆引物：Fl: 5 ' -GCCGTCATTAGTGCGTCAGTT-3 '（ SEQ. ID. No . 4)，Rl: 5 ' - GGCTGTTGTATCATGCTGGTTGCT-3 '（沈Q. ID. No. 5)。
[0021] 原核表達(dá)引物：F2:5 ' -CGGAATTCTATGGCAGAGGTGAAAGC-3 '（沈Q. ID. No. 6)，R2:5 ' - CGGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGTGTATCATGCTGGTTGCT-3 '（沈Q. ID. No. 7)。（下劃線分別為 核酸限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I識(shí)別位點(diǎn)）
[0022] 將所獲得的目的基因質(zhì)粒和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a( + )同時(shí)用核酸限制性內(nèi)切酶 EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，純化酶切產(chǎn)物后，通過T4DNA Iigase將目的基因片段與用祀T- 32a( + )連接，構(gòu)建TLR4原核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)，利用氨節(jié)青霉 素鑒定篩選基因工程陽性菌(圖2)。
[0023] 實(shí)施例2獲取和純化重組TLR4蛋白
[0024] 將陽性基因工程菌接種于含氨節(jié)青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，37°C20化pm培養(yǎng)至菌 液光密度值(0D600)達(dá)0.6，加入IPTG至終濃度0.05mM，30 °C誘導(dǎo)表達(dá)化，4°C6000巧m離屯、 20min收集菌體，裂解緩沖液重懸菌體，超聲波裂解破碎菌體，4°C eOOOrpm離屯、30min，分別 收集上清和沉淀。沉淀用PBS重懸后，與上清分別加入5 X上樣緩沖液沸水煮5min，SDS-PAGE 檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量W及表達(dá)形式（圖3)。
[0025] 本發(fā)明獲得的重組蛋白W包涵體形式表達(dá)，與Ni-NTA親和層析柱親和力差，故菌 體超聲波破碎后收集的沉淀分別用含1M、2M、3M和4M尿素的包涵體洗涂液(NaCl 5.85邑， Tris 6.06g，EDTA O.SSSgJrition X-IOOSmL,水 1L，PH>8)多次洗涂，將雜蛋白溶解去除。 將洗涂后的沉淀置于包涵體溶解液(Na此P04*2出0 15.6g，Tris 0.121g，Urea 480.48g，水 1L，PH>8)中4°C變性溶解過夜，離屯、后，將上清置于透析袋中，采用梯度透析法，將透析袋 分別依次置于添加6、4、2和OM尿素的復(fù)性液(Tris 12.1g，EDTA 3.722g，精氨酸20g，甘油 IOOmUGSH 0.3073g，GSSH 0.1225g，水2L)中透析12h，對(duì)變性的重組蛋白進(jìn)行復(fù)性。 Western-blot檢測(cè)重組蛋白的化S標(biāo)簽，確定復(fù)性過程中重組蛋白未丟失（圖4)。復(fù)性后的 重組蛋白若濃度較低則用PEG20000濃縮，測(cè)濃度后分裝，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0026] 實(shí)施例3多克隆抗體的制備和獲得
[0027] 采用第1、7、21、35天背部皮下多點(diǎn)注射的方式免疫8只4周齡昆明小白鼠。首免時(shí)， 重組蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合乳化，每只小鼠蛋白免疫量約50化g。后續(xù)免疫則采用 等量的弗氏不完全佐劑與重組蛋白進(jìn)行乳化，每只小鼠蛋白免疫量約30化g。^免后第7天， 隨機(jī)選一只小鼠斷尾采血100-200化至EP管中，室溫靜置化，4 °C 12，OOOrpm離屯、IOmin，分裝 析出血清，Western-blot檢測(cè)制備的多克隆抗體血清與重組蛋白的反應(yīng)性，確定小鼠產(chǎn)生 特異性抗體，且多克隆抗體稀釋度可達(dá)1:16000(圖5)。四免后第7天采血，室溫靜置化后4°C 12，00化pm離屯、1 Omin，分裝析出血清，-80°C保存?zhèn)溆茫礊樗眯∈罂关iTLR4多克隆抗體。
[0028] 實(shí)施例4Western Blot檢測(cè)多克隆抗體的應(yīng)用
[0029] PK-15細(xì)胞感染豬攝病毒后收集0、12、24、36、4化的蛋白樣品，進(jìn)行508斗46￡電泳， 通過半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5 %脫脂牛奶封閉，分別W抗CSFV E2單克隆抗體和 制備的小鼠抗豬化R4多克隆體作為一抗進(jìn)行WeStern B101檢測(cè)，確定所制備的小鼠抗豬 化R4多克隆抗體特異性良好，效價(jià)為1:1000,且能檢測(cè)到感染豬攝病毒后化R4蛋白表達(dá)上 升（圖6)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種豬TLR4多克隆抗體的制備方法，其特征在于將重組TLR4蛋白與弗氏佐劑乳化后 免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體血清;所述重組TLR4蛋白具有序列表SEQ. ID. No. 1氨基酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬TLR4多克隆抗體的制備方法，其特征在于所述免疫動(dòng)物按 以下操作進(jìn)行:采用第1、7、21、35天背部皮下多點(diǎn)注射的方式免疫8只4周齡昆明小白鼠；首 免時(shí)，重組蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合乳化，每只小鼠蛋白免疫量約500yg;后續(xù)免疫 則采用等量的弗氏不完全佐劑與重組蛋白進(jìn)行乳化每只小鼠蛋白免疫量約300-500yg。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬TLR4多克隆抗體的制備方法，其特征在于:所述重組TLR4蛋 白是由IPTG誘導(dǎo)基因工程菌表達(dá)目的蛋白，并通過低濃度尿素溶液多次洗滌包涵體獲得。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬TLR4多克隆抗體的制備方法，其特征在于:所述基因工程菌 由TLR4原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta DE3獲得;所述TLR4原核表達(dá)載體是由RT-PCR獲得并構(gòu)建含有序列表SEQ . ID . No . 2堿基序列的重組載體，通過PCR獲得序列表 SEQ.ID.N0.3堿基序列連接至原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a( + )構(gòu)建而成。5. 權(quán)利要求1至4任一制備方法獲得的豬TLR4多克隆抗體。6. 權(quán)利要求5所述豬TLR4多克隆抗體在制備抗豬瘟病毒疫苗或藥物方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/42GK105924525SQ201610310992
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年5月11日
【發(fā)明人】羅廷榮, 趙倩楠, 李曉寧, 李曉泉, 應(yīng)雪, 陶倩, 姜炳星
【申請(qǐng)人】廣西大學(xué)