一種可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá)載體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá)載體及其應(yīng)用，所述表達(dá)載體克隆區(qū)上游包含人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP6)的編碼序列，下游為人類堿性成纖維細(xì)胞生長因子的編碼序列，兩個(gè)基因的編碼區(qū)之間包含一段柔性接頭編碼序列，F(xiàn)ABP6的氨基端包含His?Tag標(biāo)簽編碼序列。本發(fā)明提供了一種新型堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá)載體，其特點(diǎn)是：1)可溶性蛋白與包涵體蛋白的比值大于70％；2)容易借助組氨酸標(biāo)簽(His?Tag)親和純化獲得目標(biāo)蛋白。
【專利說明】
-種可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá)載體及其 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種可溶性細(xì)胞因子蛋白表達(dá)技術(shù)，尤其是設(shè)及一種可溶性人堿性成 纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá)載體及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 早在1940年，Hoftman等在腦和垂體的抽提物中發(fā)現(xiàn)一種能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞生 長的物質(zhì)。1974年該物質(zhì)被分離純化，并命名為成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)。接著，人們又分離出一種與之高度同源的物質(zhì)，由于它含有較多的酸性氨基 酸堿基，等電點(diǎn)為酸性(pi = 5.6)，故命名為酸性FGF(aFGF)。先發(fā)現(xiàn)的FGF因?qū)λ岷蜔崦舾校?等電點(diǎn)偏堿(PI = 9.6)，則稱為堿性FGF (bFGF)。aFGF和bFGF與后發(fā)現(xiàn)的int-2、FGF-5、角質(zhì) 細(xì)胞生長因子化GF/FGF-7)、hst-1 Af gf、FGF-6等同屬于FGF家族。
[0003] 隨著bFGF的高度純化(Bohlen，1984)、測(cè)序巧sch，1985 ,Simpson，1987)和DNA克隆 成功（Araham，1986 ,Gospodarowicz，1984)引入肝素-瓊脂糖親和層析提純bFGF,可得到 90 % W上純度，從此bFGF的研究進(jìn)入了新的階段。
[0004] bFGF是含155個(gè)氨基酸的促有絲分裂的堿性蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與aFGF有55% 的同源性，但其生物學(xué)活性比aFGF強(qiáng)30-100倍。bFGF分子量為16~18.5KD。bFGF分子結(jié)構(gòu)中 有4個(gè)半脫氨基酸(切S)，用絲氨酸取代半脫氨酸，bFGF的生物學(xué)活性不變，更容易在大腸桿 菌中表達(dá)。
[0005] bFGF成熟膚的簇基端較氨基端更穩(wěn)定，將氨基端截去24個(gè)氨基酸時(shí)，尚不影響其 生物學(xué)活性。bFGF在生物進(jìn)化上具有很強(qiáng)的保守性，人和牛的bFGF蛋白同源性達(dá)98.7%。
[0006] bFGF主要分布于腦垂體、腦和神經(jīng)組織及視網(wǎng)膜、腎上腺、胎盤等部位，W垂體組 織含量最高，每公斤垂體組織可純化bFGF 0.5mg，其它組織含量很少，約為其1/10~1/50。 bFGF不存在或W極低濃度存在于血清和體液中。
[0007] bFGF作為細(xì)胞分裂原，主要作用在起源于中胚層和神經(jīng)外胚層的骨骼肌細(xì)胞、成 纖維細(xì)胞和骨細(xì)胞等，其受體也相應(yīng)的分布于上述細(xì)胞表面。FGF存在兩類受體:一類是親 和力受體，屬跨膜性酪氨酸蛋白激酶類受體;另一類是低親和力受體，即肝素樣受體，為硫 酸乙酷肝素蛋白多糖類物質(zhì)。
[000引bFGF通過與祀細(xì)胞上的受體結(jié)合而發(fā)生作用，因此細(xì)胞內(nèi)合成的bFGF需分泌至細(xì) 胞外才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。但bFGF的mRNA翻譯產(chǎn)物缺少引導(dǎo)它們向細(xì)胞外分泌的信號(hào)序 列，其分泌途徑與經(jīng)典途徑不同，除了可能是細(xì)胞受損或死亡后釋出，還有自分泌和旁分泌 起作用。
[0009] bFGF與受體結(jié)合后，能通過W下途徑將信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞核，從而調(diào)控基因表達(dá)：
[0010] (1)激活腺巧酸環(huán)化酶與鳥巧酸環(huán)化酶，憐脂酶C^LC-rl)憐酸化，又使憐脂酷肌 醇-4,5二憐酸(PIP2)分解為甘油二醋(DG)和S憐酸肌醇（IP3)，導(dǎo)致蛋白激酶C激活和化化 內(nèi)流；
[0011] (2)與受體結(jié)合后定位于細(xì)胞核，影響RNA聚合酶I，加強(qiáng)核蛋白體基因的轉(zhuǎn)錄，W 加速細(xì)胞由GO^Gl和^Gl^S期的轉(zhuǎn)換，刺激細(xì)胞的DNA合成增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞的分裂與增殖； [001^ (3)bFGF與FGFR復(fù)合物的內(nèi)部化。
[0013] 現(xiàn)今資料表明，bFGF的生物學(xué)作用極其廣泛，它在組織修復(fù)、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合與血管 形成、促進(jìn)組織再生和神經(jīng)組織生長發(fā)育過程中起著十分重要的作用。bFGF的生物學(xué)效應(yīng) 分體內(nèi)和體外兩大部分。體外作用十分強(qiáng)烈，成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì) 胞、腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等具有很強(qiáng)的促細(xì)胞分裂增殖活性。體 外細(xì)胞培養(yǎng)中能在低濃度（Img ? ml-1)發(fā)揮其作用。bFGF是重要的促有絲分裂因子，也是 形態(tài)發(fā)生和分化的誘導(dǎo)因子。其主要生物學(xué)作用有：（1)作為血管生長因子；（2)促進(jìn)創(chuàng)傷愈 合與組織修復(fù)；（3)促進(jìn)組織再生；（4)參與神經(jīng)再生等。
[0014] bFGF在體內(nèi)含量甚微，但分布廣泛，生理功能復(fù)雜多樣。bFGF生物活性的多效性W 及神經(jīng)營養(yǎng)的廣譜性，為其從基礎(chǔ)走向臨床提供了保證。在皮膚衰老的修復(fù)和預(yù)防皮膚衰 老的研究中，神經(jīng)-體液因子的聯(lián)合營養(yǎng)調(diào)控早已得到認(rèn)證。肢體神經(jīng)損傷，肢體萎縮;皮膚 神經(jīng)末稍萎縮或功能異常，皮膚松弛，感覺遲純，營養(yǎng)障礙，出現(xiàn)神經(jīng)性皮炎、色素沉著、色 斑、或老年斑。皮膚表面的臨床使用證明，少量的吸收(毛囊或汗腺口），經(jīng)過一段時(shí)間后，皮 膚質(zhì)感豐實(shí)，皺紋減少、溝紋變淺。運(yùn)些發(fā)現(xiàn)使得bFGF在日用護(hù)膚抗衰領(lǐng)域拓開了巨大的應(yīng) 用前景。
[001引目前，國際日化名牌極少有bFGF的添加，添加表皮生長因子巧GF)的居多，EGF使表 皮新生、眼觀嫩麗，但對(duì)深層結(jié)締組織作用較弱，修復(fù)能力不夠，配合bFGF聯(lián)合應(yīng)用，將形成 全方位皮膚抗衰調(diào)控，由內(nèi)向外、由里及表的全層維持細(xì)胞與組織的優(yōu)良狀態(tài);不僅表皮代 謝旺盛、皮下成纖維細(xì)跑合成和更新膠原蛋白過程也加強(qiáng)，皮膚的血液供應(yīng)改善，神經(jīng)末稍 功能得W適當(dāng)維護(hù)，神經(jīng)-體液的雙重營養(yǎng)得到提高，運(yùn)將是醫(yī)學(xué)生理學(xué)需要的全方位仿生 生物學(xué)皮膚抗衰老科學(xué)。
[0016] 隨著bFGF在醫(yī)藥和日化領(lǐng)域的應(yīng)用市場擴(kuò)大，對(duì)bFGF的需求量快速上升，目前常 見的原核細(xì)胞bFGF基因表達(dá)工程獲得的bFGF因子，可溶性低，包涵體多，經(jīng)常借助體外復(fù) 性，造成產(chǎn)量低、活性低、工藝繁，不利于大工藝生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 鑒于W上bFGF的生產(chǎn)與應(yīng)用問題，本發(fā)明的目的在于提供一種可溶性堿性成纖維 細(xì)胞生長因子融合蛋白。
[0018] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá) 載體，W提高可溶性bFGF的表達(dá)產(chǎn)量。
[0019] 本發(fā)明的又一目的在于提供上述可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá) 載體的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明通過W下技術(shù)方案得W實(shí)現(xiàn)：
[0021] -種可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白，是如下（1)或(2)的蛋白質(zhì)：
[0022] (1)由脂肪酸結(jié)合蛋白FABP和堿性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白融合得到的融合蛋 白；
[0023] 所述的脂肪酸結(jié)合蛋白FABP是FABPl~FABP9中的任意一種或亞種，所述FABPl~ FABP9的氨基酸序列如下所示：
[0024] 所述的FABPl為氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白質(zhì)；
[0025] 所述的FABPl-I為氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的蛋白質(zhì)；
[00%] 所述的FABP1-2為氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的蛋白質(zhì)；
[0027]所述的FABP2為氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白質(zhì)；
[002引所述的FABP3為氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的蛋白質(zhì)；
[0029] 所述的FABP4為氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示的蛋白質(zhì)；
[0030] 所述的FABP5為氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的蛋白質(zhì)；
[0031] 所述的FABP6為氨基酸序列是SEQ ID N0:8第2~127位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)；
[0032] 所述的FABP7為氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示的蛋白質(zhì)；
[0033] 所述的FABP8為氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示的蛋白質(zhì)；
[0034] 所述的FABP9為氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示的蛋白質(zhì)；
[0035] 或者，為將SEQ ID N0:1~11所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取 代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白質(zhì)；
[0036] 所述堿性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白為氨基酸序列如SEQ ID N0:12所示的蛋白質(zhì)， 或者為將SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白質(zhì)；
[0037] 所述的脂肪酸結(jié)合蛋白FABP和堿性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白通過柔性接頭連接；
[0038] (2)將(1)的N端連接組氨酸標(biāo)簽得到帶標(biāo)簽融合蛋白。
[0039] 作為一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述的脂肪酸結(jié)合蛋白FABP優(yōu)選為人類FABP6。
[0040] 上述的柔性接頭優(yōu)選為6~30個(gè)氨基酸，進(jìn)一步優(yōu)選為15~20個(gè)氨基酸，更進(jìn)一步 優(yōu)選的所述柔性接頭的序列如SEQ ID N0:15所示;所述組氨酸標(biāo)簽包含5-8個(gè)化S，優(yōu)選6個(gè) 化S，更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述組氨酸標(biāo)簽的序列如SEQ ID N0:13所示。
[0041] 更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白的氨基酸序列 如沈Q ID NO: 16所示。
[0042] 上述可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白的編碼基因。
[0043] 作為一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白的編碼基 因的核巧酸序列如SEQ ID NO: 17所示。
[0044] 含有上述編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和表達(dá)工程菌。
[0045] -種可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá)載體，該表達(dá)載體是將上述融 合蛋白的編碼基因插入到原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的NcoIAhoI酶切位點(diǎn)之間得到;優(yōu)選的:所述 融合蛋白的編碼基因的核巧酸序列如SEQ ID N0:17所示；所述的原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒為 pET28a〇
[0046] -種制備可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白的方法，將上述的表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化感受態(tài)表達(dá)菌株獲得表達(dá)工程菌，并進(jìn)行培養(yǎng)得到可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合 蛋白。
[0047] 上述可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá)載體在表達(dá)可溶性堿性成纖 維細(xì)胞生長因子融合蛋白中的應(yīng)用。
[0048] 本發(fā)明可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá)載體pFABP6-bFGF的詳細(xì)制 備過程：
[0049] 1)基于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的全基因人工合成方法，合成了人游離脂肪酸結(jié)合 蛋白6巧48口6)與人6尸6尸的融合蛋白尸48口6-6尸6尸(569 10^:16)的0麻編碼序列（569 10 N0:17)。
[0化0] 2)將上述FABP6-bFGF編碼DNA經(jīng)過NcoIAhoI DNA內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳分 離純化，得到插入片段。
[0051] 3)經(jīng)過內(nèi)切酶Ncol/Xhol雙酶切并瓊脂糖凝膠電泳分離純化原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒 pET28a，但不限于該表達(dá)質(zhì)粒。
[0052] 4)用T4DNA連接酶將載體祀T28a與FABP6-bFGF編碼DNA插入片段相連接，轉(zhuǎn)化感受 態(tài)菌D冊(cè)a，獲得正確序列的陽性克隆pFABP6-bFGF，即為工程質(zhì)粒。
[0053] 5)將pFABP6-bFGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化化2UDE3)感受態(tài)表達(dá)菌株，卡那霉素存在下篩選與誘 導(dǎo)表達(dá)測(cè)試，獲得表達(dá)工程菌株化21 (DE3) /pFABP6-bFGF。
[0054] W上所述的FABP優(yōu)選人類FABP，本發(fā)明采用人類FABP6(SEQ ID N0:8)，但不限于 FABP6,可W是FABPl~FABP9的任何一種或亞種(SEQ ID N0:1~11)。
[0055] 所述的FABP優(yōu)選置于bFGF上游。在FABP與bFGF之間優(yōu)選放置柔性接頭DNA編碼序 列，柔性接頭優(yōu)選編碼6~30個(gè)氨基酸，進(jìn)一步優(yōu)選編碼15~20個(gè)氨基酸。
[0056] 所述的FABP編碼序列上游包含組氨酸標(biāo)簽，所述的組氨酸標(biāo)簽5-8個(gè)化S密碼子不 等，優(yōu)選6個(gè)。所述的組氨酸編碼序列位于起始密碼子ATP的下游。
[0057] 本發(fā)明所述的pFABP6-bFGF表達(dá)載體在表達(dá)目標(biāo)蛋白中具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[005引1)可溶性蛋白與包涵體蛋白的比值大于70 % ;
[0059] 2)容易借助組氨酸標(biāo)簽化is-Tag)親和純化獲得目標(biāo)蛋白；
【附圖說明】
[0060] 圖l、FABP-bFGF融合蛋白示意圖
[0061 ] 圖2、pFABP6-bFGF表達(dá)載體物理圖
【具體實(shí)施方式】
[0062] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用進(jìn)行說明，所舉的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明的應(yīng) 用作概括性例示，有助于更好地理解本發(fā)明的用途，但并不會(huì)限制本發(fā)明應(yīng)用范圍。下述實(shí) 施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法;所述試劑和材料，如無特殊說明，均可 從商業(yè)途徑獲得。
[0063] 實(shí)施例1
[0064] -種可溶性表皮生長因子蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括W下步驟：
[0065] 步驟一、人類FABP與人類bFGF的編碼DNA的人工合成和優(yōu)化，本實(shí)施例W人類 FABP6為例(SEQ ID N0:8)，人類bFGFWl55個(gè)氨基酸的成熟膚為例(SEQ ID N0:12):
[0066] (1)將His-Tag氨基酸序列（SEQ ID NO: 13)、去除起始甲硫氨酸的FABP6氨基酸序 列（SEQ ID N0:14)、柔性接頭氨基酸序列（SEQ ID N0:15)、去除起始甲硫氨酸的bFGF氨基 酸序列（569 10側(cè)：12)，按次序合并為巧13-1曰旨一。48?6-柔性接頭一6。6口'（569 10顯： 16)，但不限于此序列，W蛋白質(zhì)氨基酸序列同源性等于或大于85%為限。
[0067] (2)將該編碼序列輸入NCBI軟件DNAworks(v3.2.3):
[0068] ①獲得逆翻譯的并且密碼子優(yōu)化了的DNA編碼序列（SEQ ID NO: 17);
[0069] ②獲得用于PCR方法全基因合成的引物(SEQ ID N0:18~41)。
[0070] ③在第一個(gè)引物的起始密碼5'-端添加NcoI內(nèi)切酶位點(diǎn)和四個(gè)保護(hù)堿基(SEQ ID N0:18)。
[0071] ④在最后一個(gè)引物的終止密碼5'-端添加趾Ol內(nèi)切酶位點(diǎn)和四個(gè)保護(hù)堿基（SEQ ID N0:41)。
[0072] (3)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法合成全長編碼DNA序列第一步：
[0073] ①將引物用無菌去離子水分別稀釋至IOiiMole濃度；
[0074] ②從每管引物分別取化L加入1支20化L PCR管；
[00巧]③然后依次加入dNTP化L，IOx PCR Buffer化^無菌去離子水加至50化；
[0076] ④最后加入高保真DNA聚合酶0.25化；
[0077] ⑤PCR參數(shù)：預(yù)變性95°C/3min;變性94°C/30sec，退火58°C/30sec，延伸72°C/ 2min,20個(gè)循環(huán);補(bǔ)全延伸72°C/5min。
[0078] (4)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法合成全長編碼DNA序列第二步：
[0079] ①取第一步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物化L加入至Ij200化新的PCR管；
[0080] ②分別加入第一個(gè)引物和最后一個(gè)引物各
[0081 ] ③然后依次加入dNTP化L，IOx PCR Buffer化^無菌去離子水加至50化；
[0082] ④最后加入高保真DNA聚合酶0.25化；
[0083] ⑤PCR參數(shù)：預(yù)變性95°C/3min;變性94°C/30sec，退火60°C/30sec，延伸72°C/ 2min,35個(gè)循環(huán);補(bǔ)全延伸72°C/5min。
[0084] (5)PCR產(chǎn)物的純化與酶切
[00化]PCR產(chǎn)物經(jīng)微型硅膠柱離屯、純化，Nco IAho I限制性內(nèi)切酶雙酶切過夜。
[00化](6)酶切DNA產(chǎn)物的純化
[0087]采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳回收獲得兩端分別是化O I和趾O I的粘性接頭的插入 片段。
[008引步驟二、載體DNA制備：
[0089] 制備表達(dá)載體祀T28a，但不限于該表達(dá)載體：
[0090] (1)取祀T28a載體化g，用限制性內(nèi)切酶化O巧日趾O I雙酶切。
[0091] (2)瓊脂糖凝膠電泳分離、純化線性化后的祀T28a載體。
[0092] 步驟=、連接與轉(zhuǎn)化
[0093] (1)用T4DNA連接酶將包含F(xiàn)ABP6-bFGF序列的插入片段和步驟二制備好的祀T28a 表達(dá)載體連接。
[0094] (2)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)菌株D冊(cè)a,含卡那霉素化an)抗生素的瓊脂培養(yǎng)皿培養(yǎng)過 夜，然后挑取單菌落，常規(guī)PCR法鑒定陽性克隆。
[00M] (3)將陽性克隆送交DNA序列分析，選取和保留序列正確的克隆，常規(guī)制備DNA質(zhì) 粒。
[0096] (4)獲得的工程載體質(zhì)粒命名為pFABP6-bFGF(SEQ ID N0:42)
[0097] 實(shí)施例2
[0098] 載體的表達(dá)測(cè)試：
[0099] (1)將得到的pFABP6-bFGF載體DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)感受態(tài) 細(xì)胞，獲得卡那霉素化an)抗性的菌落。
[0100] (2)挑取單菌落數(shù)個(gè)，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)4-12小時(shí)，收集菌液ImL,離屯、收集 菌體，1 X PBS洗涂一次，再懸浮于0.5mL 1 X PBS，超聲破碎菌體，離屯、去沉淀。
[0101] (3)取適量20化上清與SDS-PAGE上樣緩沖液混合，95 °C加熱變性10分鐘，離屯、收集 至管底，置于冰上。
[0102] (4)取10化上樣，12%聚丙締酷胺電泳，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，觀察蛋白質(zhì)條帶和 FABP6-bFGF蛋白的表達(dá)情況。
[0103] (5)重組FABP6-EGF，包括N-HisTag、柔性接頭、多克隆區(qū)，共310aa，分子量 33.73kDa JABPe-bFGF占菌體總蛋白的20-25 %，可溶性蛋白占60-70 %，包涵體占30-40 %， 顯著優(yōu)于既往文獻(xiàn)記載的bFGF裸露表達(dá)的可溶性蛋白占比(現(xiàn)有技術(shù)中bFGF裸露表達(dá)的可 溶性蛋白僅占0~10%，幾乎不值得單獨(dú)分離可溶性組分，全部按包涵體變性處理，然后體 外復(fù)性，工藝步驟復(fù)雜）。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白，其特征在于是如下（1)或(2)的蛋白 質(zhì)： (1) 由脂肪酸結(jié)合蛋白FABP和堿性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白融合得到的融合蛋白； 所述的脂肪酸結(jié)合蛋白FABP是FABPl~FABP9中的任意一種或亞種，所述FABPl~FABP9 的氨基酸序列如下所示： 所述的FABPl為氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白質(zhì)； 所述的FABPl-I為氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白質(zhì)； 所述的FABP1-2為氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的蛋白質(zhì)； 所述的FABP2為氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示的蛋白質(zhì)； 所述的FABP3為氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的蛋白質(zhì)； 所述的FABP4為氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示的蛋白質(zhì)； 所述的FABP5為氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的蛋白質(zhì)； 所述的FABP6為氨基酸序列是SEQ ID NO:8第2~127位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)； 所述的FABP7為氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示的蛋白質(zhì)； 所述的FABP8為氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示的蛋白質(zhì)； 所述的FABP9為氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示的蛋白質(zhì)； 或者，為將SEQ ID NO: 1~11所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白質(zhì)； 所述堿性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白為氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示的蛋白質(zhì)，或者 為將SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白質(zhì)； 所述的脂肪酸結(jié)合蛋白FABP和堿性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白通過柔性接頭連接； (2) 將(1)的N端連接組氨酸標(biāo)簽得到帶標(biāo)簽融合蛋白。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白，其特征在于所述 的脂肪酸結(jié)合蛋白FABP優(yōu)選為人類FABP6。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白，其特征在于所述 的柔性接頭優(yōu)選為6~30個(gè)氨基酸，進(jìn)一步優(yōu)選為15~20個(gè)氨基酸，更進(jìn)一步優(yōu)選的所述柔 性接頭的序列如SEQ ID NO: 15所示;所述組氨酸標(biāo)簽包含5-8個(gè)His，優(yōu)選6個(gè)His，更進(jìn)一步 優(yōu)選的，所述組氨酸標(biāo)簽的序列如SEQ ID NO: 13所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白，其特征在于該融 合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。5. 權(quán)利要求1~4中任意一項(xiàng)所述可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白的編碼基 因。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白的編碼基因，其特征 在于該編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示。7. 含有權(quán)利要求5或6所述編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和表達(dá)工程菌。8. -種可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體是 將權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述融合蛋白的編碼基因插入到原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的NcoI/ Xho頂每切位點(diǎn)之間得到;優(yōu)選的：所述融合蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:17 所示;所述的原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒為pET28a。9. 一種制備可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白的方法，其特征在于將權(quán)利要求 8所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)表達(dá)菌株獲得表達(dá)工程菌，并進(jìn)行培養(yǎng)得到可溶性堿性成纖 維細(xì)胞生長因子融合蛋白。10. 權(quán)利要求8所述可溶性堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá)載體在表達(dá)可溶性 堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK105924532SQ201610403079
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】李萬波, 陜婧婧, 盧嬋
【申請(qǐng)人】盤古基因生物工程(南京)股份有限公司