一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，其特征在于其包括如下步驟：（1）菌種低溫保藏：取真姬菇液體菌種1.5ml，加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，?20℃液體管冷凍保藏；（2）解凍：取凍存種，立即放入35?40℃的水中，搖晃快速解凍，然后轉(zhuǎn)入GPY固體培養(yǎng)基，25?28℃恒溫培養(yǎng)。本發(fā)明保持真姬菇菌種活力高、不退化、操作簡便、價格低廉、設備要求低、占據(jù)空間小、易于推廣。
【專利說明】
一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法
[0001 ] 技術(shù)領域:
本發(fā)明涉及一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，涉及微生物菌種保藏技術(shù)領域。
[0002]【背景技術(shù)】:
真姬燕^ypsizygus marmoreus ),別名玉蕈、斑玉蕈，屬擔子菌門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬。真姬菇含有人體所需的八種必須氨基酸，且味道鮮美，熱量低，享有“聞則松茸，食則玉蕈”的美譽，是一種營養(yǎng)豐富的食用兼藥用的珍稀食用菌，也是目前進入工廠化生產(chǎn)的重要食用菌之一，具有提高人體免疫力、預防衰老、延長壽命等多種功效，廣受消費者的喜愛，也是一種極具潛力的生產(chǎn)品種。隨著真姬菇科研及工廠化生產(chǎn)規(guī)模的日益加大，急需一種應用廣泛、簡便、有效、經(jīng)濟的真姬菇菌種保藏方法。
[0003]目前常用的菌種保藏方式為液氮超低溫保存、冷凍干燥保存、石蠟油保存、試管斜面?zhèn)鞔４娴取?br>[0004]液氮超低溫保存、冷凍干燥保存方法雖然效果良好，但其需要良好的設備及技術(shù)，投入過高，不適合在企業(yè)推廣;石蠟油保存、試管斜面?zhèn)鞔４娣椒m然簡單、廉價，但保存時間短，每隔一段時間就得重新轉(zhuǎn)管、傳代，這對于遺傳穩(wěn)定性較高的菌株影響不大，但對于遺傳穩(wěn)定性較差的菌株則影響很大，會由于保藏時間長及轉(zhuǎn)接次數(shù)過多導致培養(yǎng)基縮水、染菌、菌種退化，而且這兩種方法占用空間體積大，需要配備較多的冷藏設備空間。
[0005]液體管凍存方法操作簡單、占用空間面積小、保藏時間長，但卻并不適用于所有食用菌菌種保藏。許多食用菌菌種冷凍會致死。液體管凍存分為-20°C凍存(普通家用冰箱)和-70°C凍存(超低溫冰箱)兩種。超低溫冰箱凍存效果更好，但設備價格價格昂貴，在企業(yè)極少配備;而家用冰箱價格低廉，企業(yè)單位普遍配備。所以研究菌種的_20°C液體管冷凍保藏方法，更有推廣價值。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術(shù)的不足而提供一種保持真姬菇菌種活力高、不退化、操作簡便、價格低廉、設備要求低、占據(jù)空間小、易于推廣的真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法。
[0007]本發(fā)明的目的可以通過如下措施來達到:一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，其特征在于其包括如下步驟:
(1)菌種低溫保藏:取真姬菇液體菌種1.5ml，加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，-20°C液體管冷凍保藏；
(2)解凍:取凍存種，立即放入35-400C的水中，搖晃快速解凍，然后轉(zhuǎn)入GPY固體培養(yǎng)基，25-28 °C恒溫培養(yǎng)。
[0008]為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，其特征在于其包括如下步驟:
(I)菌種低溫保藏:
①真姬菇液體菌種的培養(yǎng):
無菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養(yǎng)基中，GPY液體培養(yǎng)基的配方組分以g/L計為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養(yǎng)10-12 天；
②保護液的制備:
制備1%濃度的黃原膠作為保護液:準確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min;
③超凈工作臺內(nèi)，采用無菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，然后加入準備好的真姬菇液體菌種I.5ml ；
④將準備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于-20°C冷凍保藏；
(2)解凍:
①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止；
②取0.5ml保藏菌種，無菌操作移至GPY固體培養(yǎng)基上25-28 °(:恒溫培養(yǎng)，觀察測定菌絲生長狀況。
[0009]本發(fā)明同已有技術(shù)相比可產(chǎn)生如下積極效果:
1.采用-20°C低溫冷凍保藏法，通過加入保護劑低溫進行冷藏。其所需設備條件及操作程序遠遠低于液氮冷藏，只需一臺普通冰箱就可完成。
[0010]2.通過篩選保護液及其濃度后，將保護液與菌種混合，放置于-20°c保存即可，不需要補充液氮，也不用像傳代培養(yǎng)一樣定期活化，保藏方法簡便易行，價格低廉，非常適合應用于普通科研單位及廣大生產(chǎn)單位。
[0011]3.保藏于2ml凍存管中，占用保藏體積小，一個一百平方厘米的凍存盒能裝一百個凍存管。
[0012]4.可以按盒分類，用時取出一管，管理方便。
[0013]5.保存時間2年以上，不需要定期傳代，減少染菌及菌種退化的幾率。
[0014]6.采用1%濃度的黃原膠作為保護液，黃原膠為微生物產(chǎn)生的生物大分子，無毒，易于降解，來源廣泛。具有快速吸水能力，吸收細胞外的水分，增加粘度，使菌液懸浮，減少冰晶的形成，同時使形成的刺狀冰晶尖端變鈍，從而降低細胞外水分低溫形成的冰晶刺破細胞的幾率;降低溶液中電解質(zhì)濃度，減少溶質(zhì)損傷;黃原膠是由微生物莢膜產(chǎn)生，對于微生物本身具有保護作用，且其受PH、鹽等條件影響較小。研究表明，黃原膠在溫度升高到120°C時，其粘度僅下降3%，非常適合保藏過程中的高溫滅菌環(huán)節(jié)。黃原膠來源廣泛，價格便宜，保存效果好。
[0015]7.所用培養(yǎng)基及溫度等培養(yǎng)條件，均為試驗后得出的結(jié)果，適合真姬菇菌絲生長。
[0016]【具體實施方式】:下面對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細說明:
實施例1:
(I)菌種低溫保藏:
①真姬菇液體菌種的培養(yǎng):
無菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養(yǎng)基中，GPY液體培養(yǎng)基的配方組分以g/L計為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養(yǎng)10-12 天。
[0017]②保護液的制備:
制備1%濃度的黃原膠作為保護液:準確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min。
[0018]③超凈工作臺內(nèi)，采用無菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，然后加入準備好的真姬菇液體菌種1.5ml。
[0019]④將準備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于-20°C冷凍保藏。
[0020](2)解凍:
①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止，盡量減少形成的冰晶對細胞的傷害。
[0021]②取0.5ml保藏菌種，無菌操作移至GPY固體培養(yǎng)基上25-28°C恒溫培養(yǎng)，觀察測定菌絲生長狀況。
[0022]實施例2:
(I)菌種低溫保藏:
①真姬菇液體菌種的培養(yǎng):
無菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養(yǎng)基中，GPY液體培養(yǎng)基的配方組分以g/L計為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養(yǎng)10-12 天。
[0023]②保護液的制備:
制備1%濃度的黃原膠作為保護液:準確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min。
[0024]③超凈工作臺內(nèi)，采用無菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入Iml的1%濃度的黃原膠保護液，然后加入準備好的真姬菇液體菌種lml。
[0025]④將準備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于_20°C冷凍保藏。
[0026](2)解凍:
①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止，盡量減少形成的冰晶對細胞的傷害。
[0027]②取0.5ml保藏菌種，無菌操作移至GPY固體培養(yǎng)基上25-28°C恒溫培養(yǎng)，觀察測定菌絲生長狀況。
[0028]實施例3:
(I)菌種低溫保藏:
①真姬菇液體菌種的培養(yǎng):
無菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養(yǎng)基中，GPY液體培養(yǎng)基的配方組分以g/L計為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養(yǎng)10-12 天。
[0029]②保護液的制備:
制備1%濃度的黃原膠作為保護液:準確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min。
[0030]③超凈工作臺內(nèi)，采用無菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入1.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，然后加入準備好的真姬菇液體菌種0.5ml。
[0031]④將準備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于_20°C冷凍保藏。
[0032](2)解凍: ①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止，盡量減少形成的冰晶對細胞的傷害。
[0033]②取0.5ml保藏菌種，無菌操作移至GPY固體培養(yǎng)基上25-28°C恒溫培養(yǎng)，觀察測定菌絲生長狀況。
[0034]以上的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設計精神的前提下，本領域普通工程技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進，均應落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，其特征在于其包括如下步驟: (1)菌種低溫保藏:取真姬菇液體菌種1.5ml，加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，-20°C液體管冷凍保藏； (2)解凍:取凍存種，立即放入35-40°C的水中，搖晃快速解凍，然后轉(zhuǎn)入GPY固體培養(yǎng)基，25-28 °C恒溫培養(yǎng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，其特征在于其包括如下步驟: (1)菌種低溫保藏: ①真姬菇液體菌種的培養(yǎng): 無菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養(yǎng)基中，GPY液體培養(yǎng)基的配方組分以g/L計為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養(yǎng)10-12 天； ②保護液的制備: 制備1%濃度的黃原膠作為保護液:準確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min; ③超凈工作臺內(nèi)，采用無菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，然后加入準備好的真姬菇液體菌種I.5ml ； ④將準備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于-20°C冷凍保藏； (2)解凍: ①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止； ②取0.5ml保藏菌種，無菌操作移至GPY固體培養(yǎng)基上25-28°C恒溫培養(yǎng)，觀察測定菌絲生長狀況。
【文檔編號】C12N1/14GK105925483SQ201610308335
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】程顯好, 孫磊, 劉靜, 李維煥
【申請人】魯東大學