一種高活性粉狀畢赤酵母菌粉及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高活性粉狀畢赤酵母菌粉及其制備方法，該制備方法包括活化培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、制備高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)、補(bǔ)料與添加輔料等步驟。該制備方法可顯著提高單位產(chǎn)量30％左右，降低單位成本20％左右，大大提高了設(shè)備利用率；復(fù)合保護(hù)劑和載體賦予了菌體本身最佳保護(hù)，從而可以獲得高活性粉狀畢赤酵母菌粉；本發(fā)明與傳統(tǒng)離心噴霧干燥生產(chǎn)工藝相比，采用冷風(fēng)干燥技術(shù)干燥溫度較低，更好地保留了生物活性，克服了傳統(tǒng)工藝低活菌、高投入的缺點，具有廣闊的市場前景。
【專利說明】
一種高活性粉狀畢赤酵母菌粉及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種高活性粉狀畢赤酵母菌粉的制備方法，還涉及采用所述制備方法制備得到的高活性粉狀畢赤酵母菌粉。
【【背景技術(shù)】】
[0002]粉狀畢赤酵母作為工業(yè)菌種具有非常廣泛的用途。它不僅可以治理養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)過程中氨氮的排放，還可以為畜禽類提供優(yōu)質(zhì)活性蛋白，提高畜禽產(chǎn)品質(zhì)量;一些研究工作表明，粉狀畢赤酵母不僅對土壤鹽堿性有良好的改良效果，以及對根結(jié)線蟲有較強(qiáng)的抑制作用，而且還可以提高作物產(chǎn)量;粉狀畢赤酵母可促進(jìn)有機(jī)物料腐熟，是有機(jī)物料腐熟劑生產(chǎn)中的重要菌種;粉狀畢赤酵母在有機(jī)肥堆肥發(fā)酵過程中可抑制畜禽糞便氨氣揮發(fā)，起到除氨保氮的作用。由此可見，大力發(fā)展粉狀畢赤酵母產(chǎn)業(yè)有非常廣闊的市場前景。
[0003]目前市場上的粉狀畢赤酵母菌粉較少，活菌數(shù)較低，穩(wěn)定性也較差。主要是由于其本身耐受性較低，不適合進(jìn)行噴霧干燥，然而冷凍干燥成本又相對較高，因此嚴(yán)重制約了粉狀畢赤酵母產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明人在總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)之上，通過大量實驗研究與分析，終于完成了本發(fā)明。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005][要解決的技術(shù)問題]
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種高活性粉狀畢赤酵母菌粉的制備方法。
[0007]本發(fā)明的另一個目的是提供采用所述制備方法制備得到的高活性粉狀畢赤酵母菌粉。
[0008][技術(shù)方案]
[0009]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0010]本發(fā)明涉及一種粉狀畢赤酵母高活性菌粉的制備方法。
[0011]該制備方法的步驟如下:
[0012]A、活化培養(yǎng)
[0013]用無菌吸管吸取0.3?0.5mL麥芽汁液體培養(yǎng)基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內(nèi)，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養(yǎng)基中，在溫度26?30°C下活化培養(yǎng)2?3d;
[0014]按照以YPD培養(yǎng)基重量計3?5%接種量，將活化培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于Yro培養(yǎng)基斜面上，在溫度26?30 °C下斜面培養(yǎng)2?3d;
[0015]B、一級種子培養(yǎng)
[0016]使用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于50?80mL YPD液體培養(yǎng)基中，在溫度28?32°C與轉(zhuǎn)速200?250rad/min條件下振蕩培養(yǎng)，直到培養(yǎng)液OD60qim達(dá)到12.0?15.0時得到一級種子液；
[0017]C、制備高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基
[0018]將I?3重量份葡萄糖、0.5?1.5重量份蛋白胨、0.1?0.5重量份磷酸二氫鉀、0.01?0.05重量份硫酸鎂、0.03?0.06重量份硫酸亞鐵、0.03?0.06重量份硫酸錳與補(bǔ)充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.11?0.15MPa與溫度121°C?125 °C的條件下滅菌18?22min，接著使用濃度為以體積計22?28%的氨水將其pH值調(diào)節(jié)至5.0?6.0，得到一種高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0019]D、發(fā)酵培養(yǎng)
[0020]按照以液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量計6?10%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度28?32°C、初始pH 5.5、壓力0.03?0.06MPa、轉(zhuǎn)速200?350rad/min與通氣比1:1?2.5的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);與此同時，通過通氣比、壓力與轉(zhuǎn)速調(diào)整，將整個發(fā)酵過程中溶解氧DO控制在320%，通過滴加濃度為以體積計22?28%的氨水將在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值控制在5.5?6.5;
[0021]E、補(bǔ)料
[0022]在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中，在通氣量、壓力與轉(zhuǎn)速不變時，如果溶解氧DO在Imin內(nèi)升高30 %以上時，需要按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計18?22 %的添加量，往發(fā)酵培養(yǎng)液中添加由35?45重量份葡萄糖與5?15重量份硫酸鎂組成的補(bǔ)料培養(yǎng)基；
[0023]F、添加輔料
[0024]在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前0.5?lh，按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計I?3%的添加量添加甘露醇保護(hù)劑與2?6%的添加量添加吐溫80，充分混勻;接著在離心轉(zhuǎn)速2000?4000rpm的條件下離心濃縮2?4倍;再按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計20?30%的添加量添加米糠載體、20?30%的添加量添加加益粉載體，充分混勻，接著輸送至冷風(fēng)干燥機(jī)中進(jìn)行冷風(fēng)干燥，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在步驟A中，在按照大麥芽與水的重量比1:3?5，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度55?60°C下進(jìn)行糖化3.5?4.5h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.5?0.7kg/cm2下滅菌38?42min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到一種麥芽汁液體培養(yǎng)基。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在步驟C與步驟D中，所述的氨水濃度是以體積計22?28 %。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在步驟C中，高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基由2重量份葡萄糖、I重量份蛋白胨、0.3重量份磷酸二氫鉀、0.03重量份硫酸鎂、0.05重量份硫酸亞鐵、0.05重量份硫酸猛與補(bǔ)充至1000重量份蒸饋水組成。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在步驟E中，所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基在蒸汽壓力102?104kPa與溫度110?117°C的條件下滅菌18?22min。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在步驟E中，在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加8?10次所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，整個發(fā)酵培養(yǎng)時間是36?48h。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在步驟F中，在溫度為5?15°C的條件下進(jìn)行冷風(fēng)干燥4?5h。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在步驟F中，所述的米糠載體粒度是100?150目。
[0033]本發(fā)明還涉及采用所述制備方法制備得到的高活性粉狀畢赤酵母菌粉。所述的粉狀畢赤酵母有效活菌數(shù)CFU ^ 60.0億/g ；雜菌率= 10.0%;水分5.5-7.0%； pH值5.5?6.5;在溫度25°C以下保存6個月時菌數(shù)保存率375%。
[0034]下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0035]本發(fā)明涉及一種高活性粉狀畢赤酵母菌粉的制備方法。
[0036]該制備方法的步驟如下:
[0037]A、活化培養(yǎng)
[0038]用無菌吸管吸取0.3?0.5mL麥芽汁液體培養(yǎng)基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內(nèi)，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養(yǎng)基中，在溫度26?30°C下活化培養(yǎng)2?3d;
[0039]按照以YPD培養(yǎng)基重量計3?5%接種量，將活化培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于Yro培養(yǎng)基斜面上，在溫度26?30 °C下斜面培養(yǎng)2?3d;
[0040]粉狀畢赤酵母ACCC20136是由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心獲得的。使用75%酒精脫脂棉對裝有凍干粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿管外表面進(jìn)行消毒，用火焰加熱其頂端，滴少量無菌水至加熱安瓿頂端使之破裂，用銼刀或鑷子敲下已經(jīng)破裂的安瓿頂端。然后把麥芽汁液體培養(yǎng)基滴入安瓿內(nèi)。
[0041]根據(jù)本發(fā)明，所述的麥芽汁液體培養(yǎng)基制備方法如下:按照大麥芽與水的重量比1:3?5，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度55?60°C下進(jìn)行糖化
3.5?4.5h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.5?0.7kg/cm2下滅菌38?42min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到所述的麥芽汁液體培養(yǎng)基。
[0042]在本發(fā)明中，使用的大麥芽是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由鄭州龍海啤酒物資有限公司銷售的大麥芽。
[0043]所述的麥芽汁液體培養(yǎng)基的pH是自然的pH。
[0044]YPD培養(yǎng)基是本技術(shù)領(lǐng)域里技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)基，它的制備方法如下:將1g酵母膏、20g蛋白胨與20g葡萄糖溶于900mL水中，在溫度^丨^下滅菌]。!!!；^，得到所述的YF1D培養(yǎng)基。
[0045]B、一級種子培養(yǎng)
[0046]使用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于50?80mL YPD液體培養(yǎng)基中，在溫度28?32°C與轉(zhuǎn)速200?250rad/min條件下振蕩培養(yǎng)，直到培養(yǎng)液OD6OQnm達(dá)到12.0?15.0時得到一級種子液；
[0047]Yro液體培養(yǎng)基已在前面描述，因此這里不再贅述。
[0048]在本發(fā)明中，振蕩培養(yǎng)使用的設(shè)備例如是由蘇州威爾實驗用品有限公司以商品名振蕩培養(yǎng)箱銷售的設(shè)備。
[0049]通常利用分光光度法來測量單細(xì)胞微生物培養(yǎng)液的濃度，從而估計菌體的生長情況，所以0D_nm通常用來指菌體細(xì)胞密度。例如測量細(xì)菌培養(yǎng)液在波長600?處的吸光值，得至IJ的OD600nm的數(shù)值如果在0.6-0.8之間，表明細(xì)菌處于旺盛生長的對數(shù)生長期，超過0.8就要稀釋培養(yǎng)液。
[0050]培養(yǎng)液(?_?為12.0?15.0表明粉狀畢赤酵母正處于對數(shù)生長期，開始大量、快速繁殖。
[0051]測定0D6QQnm使用的設(shè)備是本技術(shù)領(lǐng)域里通常使用的分光光度計，測定0D6QQnm的方法是常規(guī)方法。
[0052]C、制備高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基
[0053]將I?3重量份葡萄糖、0.5?1.5重量份蛋白胨、0.1?0.5重量份磷酸二氫鉀、0.01?0.05重量份硫酸鎂、0.03?0.06重量份硫酸亞鐵、0.03?0.06重量份硫酸錳與補(bǔ)充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.1IM?0.15MPa與溫度121°C?125 °C的條件下滅菌18?22min，接著使用濃度為以體積計22?28%的氨水將其pH值調(diào)節(jié)至5.0?6.0，得到一種高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0054]優(yōu)選地，高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基由2.0重量份葡萄糖、1.0重量份蛋白胨、0.3重量份磷酸二氫鉀、0.03重量份硫酸鎂、0.05重量份硫酸亞鐵、0.05重量份硫酸錳與補(bǔ)充至1000重量份蒸餾水組成。
[0055]本發(fā)明使用的葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳都是目前市場上銷售的產(chǎn)品。
[0056]在這個步驟中，所述的氨水濃度是以體積計22?28%。
[0057]D、發(fā)酵培養(yǎng)
[0058]按照以液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量計6?10%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度28?32°C、初始pH 5.5、壓力0.03?0.06MPa、轉(zhuǎn)速200?350rad/min與通氣比1:1?2.5的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);與此同時，通過通氣比、壓力與轉(zhuǎn)速調(diào)整，將整個發(fā)酵過程中溶解氧DO控制在320%，通過滴加濃度為以體積計22?28%的氨水將在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值控制在5.5?6.5;
[0059]溶解于水中的分子態(tài)氧稱為溶解氧，通常記作D0，用每升水里氧氣的毫克數(shù)表示。溶解氧通常采用碘量法進(jìn)行測定，即水樣中加入硫酸錳和堿性碘化鉀，水中溶解氧將低價錳氧化成高價錳，生成四價錳氫氧化物棕色沉淀。加酸后，氫氧化物沉淀溶解，并與碘離子反應(yīng)而釋放出游離碘。以淀粉為指示劑，用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定釋放出的碘，據(jù)滴定溶液消耗量計算溶解氧含量。
[0060]在本發(fā)明中，將整個發(fā)酵過程中溶解氧DO控制在3 20 %，如果溶解氧D0<20%時，則粉狀畢赤酵母會因缺氧而進(jìn)行厭氧呼吸途徑產(chǎn)生大量乙醇，通過反饋抑制作用抑制菌體生長。
[0061 ]根據(jù)本發(fā)明，在這個步驟中，所述的氨水濃度是以體積計22?28%。
[0062]在本發(fā)明中，如果在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值控制在5.5以下，則會引起細(xì)胞質(zhì)膜的電性改變，影響營養(yǎng)吸收和代謝途徑;如果在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)液的PH值控制在6.5以上，則會影響粉狀畢赤酵母自身酶系的酶活性及基質(zhì)和產(chǎn)物性質(zhì)，從而導(dǎo)致菌體生長速度變慢;因此，在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值控制在5.5?6.5是合理的，優(yōu)選地是5.8?6.2 ；更優(yōu)選地是5.9?6.1。
[0063]E、補(bǔ)料
[0064]在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中，在通氣量、壓力與轉(zhuǎn)速不變時，如果溶解氧DO在Imin內(nèi)升高30 %以上時，需要按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計18?22 %的添加量，往發(fā)酵培養(yǎng)液中添加由35?45重量份葡萄糖與5?15重量份硫酸鎂組成的補(bǔ)料培養(yǎng)基；
[0065]在這個步驟中，溶解氧DO在Imin內(nèi)升高30%以上時，表明發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖已耗盡，會造成菌體衰老死亡，同時出現(xiàn)pH升高，應(yīng)及時補(bǔ)充碳源。因此，需要添加由35?45重量份葡萄糖與5?15重量份硫酸鎂組成的補(bǔ)料培養(yǎng)基，其中葡萄糖的主要作用是為粉狀畢赤酵母菌體生長補(bǔ)充必需的碳源，延長對數(shù)期，促進(jìn)菌體大量積累；而硫酸鎂是許多酶的活化劑，能促進(jìn)碳水化合物的新陳代謝、核酸的合成、磷酸鹽的轉(zhuǎn)化等。
[0066]在這個步驟中，所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基在蒸汽壓力102?104kPa與溫度110?117°C的條件下滅菌18?22min。
[0067]在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中，所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基通常需要添加8?10次。
[0068]根據(jù)本發(fā)明，整個發(fā)酵培養(yǎng)時間是36?48h。如果整個發(fā)酵培養(yǎng)時間小于36h，則發(fā)酵仍處于對數(shù)生長期，不能獲取最高濃度的發(fā)酵液;如果整個發(fā)酵培養(yǎng)時間長于48h，則發(fā)酵已進(jìn)入穩(wěn)定期乃至衰亡期，菌體數(shù)量將按幾何級數(shù)下降；因此，整個發(fā)酵培養(yǎng)時間為36?48h是合理的。
[0069]F、添加輔料
[0070]在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前0.5?lh，按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計I?3%的添加量添加甘露醇保護(hù)劑與2?6%的添加量添加吐溫80，充分混勻;接著在離心轉(zhuǎn)速2000?4000rpm的條件下離心濃縮2?4倍;再按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計20?30%的添加量添加米糠載體、20?30%的添加量添加加益粉載體，充分混勻，接著輸送至冷風(fēng)干燥機(jī)中進(jìn)行冷風(fēng)干燥，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。
[0071]在本發(fā)明中，添加甘露醇保護(hù)劑的主要目的是可與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的完整性。如果甘露醇保護(hù)劑的添加量小于1%，則會影響粉狀畢赤酵母菌體存活率;如果甘露醇保護(hù)劑的添加量大于3%，則會使細(xì)胞間隙內(nèi)的液體逐漸濃縮，從而使電解質(zhì)的濃度顯著增加，發(fā)生溶質(zhì)損傷效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞脫水死亡;因此，甘露醇保護(hù)劑的添加量為I?3 %是恰當(dāng)?shù)摹?br>[0072]添加吐溫80保護(hù)劑的主要目的是減少細(xì)胞暴露于氧氣和介質(zhì)中的面積，同時在菌體表面形成保護(hù)層，減少由于細(xì)胞壁損傷而引起的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏。如果吐溫80保護(hù)劑的添加量小于2%，則起不到最佳保護(hù)效果;如果吐溫80保護(hù)劑的添加量大于6%，則容易造成樣品發(fā)粘，不易干燥、保存；因此，吐溫80保護(hù)劑的添加量為2?6%是適當(dāng)?shù)摹?br>[0073]在本發(fā)明中，添加米糠載體的主要目的是吸附粉狀畢赤酵母菌體。如果米糠的添加量小于20 %，則不能將發(fā)酵液中的菌體充分吸附；如果米糠的添加量大于30 %，則會減少單位質(zhì)量中有效活菌數(shù)，影響產(chǎn)品質(zhì)量；因此，米糠的添加量為20?30%是可行的。所述的米糠粒度是100?150目。
[0074]添加加益粉載體的主要目的是在產(chǎn)品使用過程中為菌體繁殖提供多種礦物質(zhì)和無機(jī)鹽;改善產(chǎn)品外觀。如果加益粉載體的添加量小于20%，則不能為菌體生長繁殖提供充足的營養(yǎng);如果加益粉載體的添加量大于30%，則會減少單位質(zhì)量中有效活菌數(shù)，影響產(chǎn)品質(zhì)量;因此，加益粉載體的添加量為20?30%是恰當(dāng)?shù)摹?br>[0075]冷風(fēng)干燥技術(shù)是利用空調(diào)除濕原理，即將干燥空氣強(qiáng)制循環(huán)于物料間，使其含水量逐漸減少以達(dá)到干燥的目的。低溫低濕空氣在強(qiáng)制循環(huán)中不斷吸收物料表面水分，達(dá)到飽和狀態(tài)的空氣經(jīng)過蒸發(fā)器被降溫并析出，析出的水分由集水盤排出庫體，達(dá)到循環(huán)干燥的目的。冷風(fēng)干燥設(shè)備運行費用低，易于控制，干燥溫度為中低溫(5-50°C )，對微生物菌體損傷小。
[0076]在本發(fā)明中，在溫度為5?15°C的條件下進(jìn)行冷風(fēng)干燥4?5h。冷風(fēng)干燥所使用的設(shè)備例如是由湖北歐勝電器有限公司以商品名冷風(fēng)干燥機(jī)銷售的產(chǎn)品。
[0077]本發(fā)明還涉及采用所述制備方法制備得到的高活性粉狀畢赤酵母菌粉。
[0078]根據(jù)農(nóng)用微生物菌劑(GB20287-2006)標(biāo)準(zhǔn)分析方法測定，所述粉狀畢赤酵母粉的有效活菌數(shù)CFU ^ 60.0億/g ；雜菌率蘭10.0 % ;
[0079]根據(jù)農(nóng)用微生物菌劑(GB20287-2006)標(biāo)準(zhǔn)分析方法測定，所述粉狀畢赤酵母粉的水分5.5-7.0% ；
[0080]根據(jù)農(nóng)用微生物菌劑(GB 20287-2006)標(biāo)準(zhǔn)分析方法測定，pH值5.5?6.5;
[0081 ] 根據(jù)農(nóng)用微生物菌劑(GB 20287-2006)標(biāo)準(zhǔn)分析方法測定，在溫度25°C以下保存6個月時菌數(shù)保存率3 75 %。
[0082]所述的粉狀畢赤酵母為灰黃色粉末，無潮解結(jié)塊。
[0083]所述粉狀畢赤酵母菌粉應(yīng)該在陰涼、通風(fēng)、干燥處貯存，本發(fā)明高活性粉狀畢赤酵母菌粉的保藏曲線列于附圖3中。由附圖3可以看出溫度越低越有利于粉狀畢赤酵母菌粉的保存，4 °C保存6個月時，菌數(shù)保存率為85.7%, 25 °C保存6個月時，菌數(shù)保存率為77.8 %，均達(dá)到規(guī)定指標(biāo)。
[0084]本發(fā)明的粉狀畢赤酵母菌粉主要應(yīng)用于有機(jī)物料腐熟劑的生產(chǎn)和有機(jī)肥堆肥發(fā)酵;它的使用方法是將該產(chǎn)品與所需發(fā)酵的物料充分混勻，調(diào)整水分為以重量計35-45%，進(jìn)行堆堆發(fā)酵，溫度超過50°C時要及時補(bǔ)水、翻堆降溫;它的使用量通常是2_4kg每噸物料，或根據(jù)需要可適當(dāng)加大用量。
[0085][有益效果]
[0086]本發(fā)明的有益效果是:
[0087]通過粉狀畢赤酵母高密度補(bǔ)料發(fā)酵，顯著提高了單位產(chǎn)量約30%，降低了單位成本約20%，設(shè)備利用率提高。
[0088]通過復(fù)配正交試驗篩選出保護(hù)劑和載體的最佳種類及配比，賦予菌體本身最佳保護(hù)，從而獲得高活性粉狀畢赤酵母菌粉。
[0089]與傳統(tǒng)離心噴霧干燥生產(chǎn)工藝相比，采用冷風(fēng)干燥技術(shù)干燥溫度較低，更好地保留了生物活性，克服了傳統(tǒng)工藝低活菌、高投入的缺點，具有廣闊的市場前景。
【【附圖說明】】
[0090]圖1是實施例1粉狀畢赤酵母高密度補(bǔ)料發(fā)酵與pH控制時與對比實施例1不補(bǔ)料和不控制pH時OD6qqim隨發(fā)酵時間而變化的示意圖；
[0091]圖2是實施例2使用復(fù)合保護(hù)劑和載體與對比實施例2使用單一載體和保護(hù)劑對粉狀畢赤酵母菌體存活率影響示意圖。
[0092 ]圖3是本發(fā)明高活性粉狀畢赤酵母菌粉的保藏曲線。
【【具體實施方式】】
[0093]通過下述實施例將能夠更好地理解本發(fā)明。
[0094]實施例1:粉狀畢赤酵母高活性菌粉的制備
[0095]該實施例的實施步驟如下:
[0096]A、活化培養(yǎng)
[0097]制備麥芽汁液體培養(yǎng)基:按照大麥芽與水的重量比1:4，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度58°C下進(jìn)行糖化3.8h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.5kg/cm2下滅菌40min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到麥芽汁液體培養(yǎng)基；
[0098]用無菌吸管吸取0.3mL上述麥芽汁液體培養(yǎng)基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內(nèi)，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養(yǎng)基中，在溫度26°C下活化培養(yǎng)2d;
[0099]按照以YPD培養(yǎng)基重量計3%接種量，將活化培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于Yro培養(yǎng)基斜面上，在溫度26 °C下斜面培養(yǎng)2d ；
[0100]B、一級種子培養(yǎng)
[0101]使用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于60mLYPD液體培養(yǎng)基中，在溫度28 °C與轉(zhuǎn)速220rad/min條件下振蕩培養(yǎng)，直到培養(yǎng)液OD6qqim達(dá)到12.0時得到一級種子液；
[0102]C、制備高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基
[0103]將2重量份葡萄糖、0.5重量份蛋白胨、0.5重量份磷酸二氫鉀、0.01重量份硫酸鎂、0.03重量份硫酸亞鐵、0.06重量份硫酸錳與補(bǔ)充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.12MPa與溫度125°C的條件下滅菌18min，接著使用濃度為以體積計26%的氨水將其pH值調(diào)節(jié)至5.4，得到一種高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0104]D、發(fā)酵培養(yǎng)
[0105]按照以液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量計6%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度30 °C、初始pH 5.5、壓力0.03MPa、轉(zhuǎn)速300rad/min與通氣比1:1.0的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);與此同時，通過通氣比、壓力與轉(zhuǎn)速調(diào)整，將整個發(fā)酵過程中溶解氧DO控制在3 20 %，通過滴加濃度為以體積計26 %的氨水將在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值控制在5.5 ；
[0106]E、補(bǔ)料
[0107]在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中，在通氣量、壓力與轉(zhuǎn)速不變時，如果溶解氧DO在Imin內(nèi)升高30%以上時，需要按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計18%的添加量往發(fā)酵培養(yǎng)液中添加補(bǔ)料培養(yǎng)基;所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基由42重量份葡萄糖與8重量份硫酸鎂組成，在蒸汽壓力102kPa與溫度110 °C的條件下滅菌22min，在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加9次所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基。整個發(fā)酵培養(yǎng)時間為44h。
[0108]F、添加輔料
[0109]在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前0.5h，按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計I %的添加量添加甘露醇保護(hù)劑，4%的添加量添加吐溫80，充分混勻；接著在離心轉(zhuǎn)速2600rpm的條件下離心濃縮2倍;再按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計20%的添加量添加粒度100?150目米糠、24%的添加量添加加益粉，充分混勻，接著輸送至冷風(fēng)干燥機(jī)中在溫度為5?15°C的條件下進(jìn)行冷風(fēng)干燥4h，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。
[0110]根據(jù)本說明書描述的方法測定所述粉狀畢赤酵母粉的有效活菌數(shù)CFU為60.0億/g;雜菌率蘭10.0 % ;水分5.5%； pH值5.5;在溫度25°C以下保存6個月時菌數(shù)保存率3 75%。
[0111]本實施例制備的粉狀畢赤酵母為灰黃色粉末，無潮解結(jié)塊。
[0112]實施例2:粉狀畢赤酵母高活性菌粉的制備
[0113]該實施例的實施步驟如下:
[0114]A、活化培養(yǎng)
[0115]制備麥芽汁液體培養(yǎng)基:按照大麥芽與水的重量比1:3，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度55°C下進(jìn)行糖化4.5h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.6kg/cm2下滅菌38min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到麥芽汁液體培養(yǎng)基；
[0116]用無菌吸管吸取0.5mL上述麥芽汁液體培養(yǎng)基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內(nèi)，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養(yǎng)基中，在溫度30°C下活化培養(yǎng)2d;
[0117]按照以YPD培養(yǎng)基重量計4%接種量，將活化培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于Yro培養(yǎng)基斜面上，在溫度30 °C下斜面培養(yǎng)2.5d ；
[0118]B、一級種子培養(yǎng)
[0119]使用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于50mLYPD液體培養(yǎng)基中，在溫度30°C與轉(zhuǎn)速200rad/min條件下振蕩培養(yǎng)，直到培養(yǎng)液OD6qqim達(dá)到15.0時得到一級種子液；
[0120]C、制備高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基
[0121 ]將I重量份葡萄糖、1.5重量份蛋白胨、0.1重量份磷酸二氫鉀、0.04重量份硫酸鎂、0.06重量份硫酸亞鐵、0.03重量份硫酸錳與補(bǔ)充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.1lMPa與溫度123°C的條件下滅菌20min，接著使用濃度為以體積計24%的氨水將其pH值調(diào)節(jié)至5.0，得到一種高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0122]D、發(fā)酵培養(yǎng)
[0123]按照以液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量計8%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度28 °C、初始pH 5.5、壓力0.06MPa、轉(zhuǎn)速200rad/min與通氣比I: 2.5的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);與此同時，通過通氣比、壓力與轉(zhuǎn)速調(diào)整，將整個發(fā)酵過程中溶解氧DO控制在3 20%，通過滴加濃度為以體積計24%的氨水將在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值控制在6.0 ；
[0124]E、補(bǔ)料
[0125]在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中，在通氣量、壓力與轉(zhuǎn)速不變時，如果溶解氧DO在Imin內(nèi)升高30%以上時，需要按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計22%的添加量往發(fā)酵培養(yǎng)液中添加補(bǔ)料培養(yǎng)基;所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基由35重量份葡萄糖與5重量份硫酸鎂組成，在蒸汽壓力104kPa與溫度114°C的條件下滅菌18min，在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加8次所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基。整個發(fā)酵培養(yǎng)時間為36h;
[0126]F、添加輔料
[0127]在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前1.0h，按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計3 %的添加量添加甘露醇保護(hù)劑，2%的添加量添加吐溫80，充分混勻；接著在離心轉(zhuǎn)速2000rpm的條件下離心濃縮3倍;再按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計30%的添加量添加粒度100?150目米糠、20%的添加量添加加益粉，充分混勻，接著輸送至冷風(fēng)干燥機(jī)中在溫度為5?15°C的條件下進(jìn)行冷風(fēng)干燥5h，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。
[0128]根據(jù)本說明書描述的方法測定所述粉狀畢赤酵母粉的有效活菌數(shù)CFU為62.2億/g;雜菌率蘭10.0 % ;水分7.0%； pH值6.5;在溫度25°C以下保存6個月時菌數(shù)保存率蘭75%。
[0129]本實施例制備的粉狀畢赤酵母為灰黃色粉末，無潮解結(jié)塊。
[0130]實施例3:粉狀畢赤酵母高活性菌粉的制備[0131 ]該實施例的實施步驟如下:
[0132]A、活化培養(yǎng)
[0133]制備麥芽汁液體培養(yǎng)基:按照大麥芽與水的重量比1:5，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度60°C下進(jìn)行糖化3.5h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.7kg/cm2下滅菌40min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到麥芽汁液體培養(yǎng)基；
[0134]用無菌吸管吸取0.4mL上述麥芽汁液體培養(yǎng)基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內(nèi)，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養(yǎng)基中，在溫度28°C下活化培養(yǎng)3d;
[0135]按照以YPD培養(yǎng)基重量計5%接種量，將活化培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于Yro培養(yǎng)基斜面上，在溫度28 °C下斜面培養(yǎng)3d ；
[0136]B、一級種子培養(yǎng)
[0137]使用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于70mLYPD液體培養(yǎng)基中，在溫度32 °C與轉(zhuǎn)速250rad/min條件下振蕩培養(yǎng)，直到培養(yǎng)液OD6qqim達(dá)到13.0時得到一級種子液；
[0138]C、制備高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基
[0139]將3重量份葡萄糖、1.2重量份蛋白胨、0.2重量份磷酸二氫鉀、0.05重量份硫酸鎂、0.05重量份硫酸亞鐵、0.04重量份硫酸錳與補(bǔ)充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.15MPa與溫度121°C的條件下滅菌22min，接著使用濃度為以體積計22%的氨水將其pH值調(diào)節(jié)至6.0，得到一種高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0140]D、發(fā)酵培養(yǎng)
[0141]按照以液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量計10%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度32 °C、初始pH 5.5、壓力0.04MPa、轉(zhuǎn)速350rad/min與通氣比1:1.6的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);與此同時，通過通氣比、壓力與轉(zhuǎn)速調(diào)整，將整個發(fā)酵過程中溶解氧DO控制在3 20%，通過滴加濃度為以體積計22%的氨水將在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值控制在6.5 ；
[0142]E、補(bǔ)料
[0143]在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中，在通氣量、壓力與轉(zhuǎn)速不變時，如果溶解氧DO在Imin內(nèi)升高30%以上時，需要按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計20%的添加量往發(fā)酵培養(yǎng)液中添加補(bǔ)料培養(yǎng)基;所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基由45重量份葡萄糖與12重量份硫酸鎂組成，在蒸汽壓力102kPa與溫度117 °C的條件下滅菌20min，在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加10次所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基。整個發(fā)酵培養(yǎng)時間為40h ；
[0144]F、添加輔料
[0145]在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前0.8h，按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計2 %的添加量添加甘露醇保護(hù)劑，
6%的添加量添加吐溫80，充分混勾；接著在離心轉(zhuǎn)速4000rpm的條件下離心濃縮4倍;再按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計28%的添加量添加粒度100?150目米糠、30%的添加量添加加益粉，充分混勻，接著輸送至冷風(fēng)干燥機(jī)中在溫度為5?15°C的條件下進(jìn)行冷風(fēng)干燥4h，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。
[0146]根據(jù)本說明書描述的方法測定所述粉狀畢赤酵母粉的有效活菌數(shù)CFU為64.4億/g;雜菌率蘭10.0 % ;水分5.8%； pH值6.0;在溫度25°C以下保存6個月時菌數(shù)保存率3 75%。
[0147]本實施例制備的粉狀畢赤酵母為灰黃色粉末，無潮解結(jié)塊。
[0148]實施例4:粉狀畢赤酵母高活性菌粉的制備
[0149]該實施例的實施步驟如下:
[0150]A、活化培養(yǎng)
[0151]制備麥芽汁液體培養(yǎng)基:按照大麥芽與水的重量比1:4，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度56°C下進(jìn)行糖化4.0h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.6kg/cm2下滅菌42min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到麥芽汁液體培養(yǎng)基；
[0152]用無菌吸管吸取0.4mL上述麥芽汁液體培養(yǎng)基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內(nèi)，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養(yǎng)基中，在溫度26°C下活化培養(yǎng)3d;
[0153]按照以YPD培養(yǎng)基重量計4%接種量，將活化培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于Yro培養(yǎng)基斜面上，在溫度28 °C下斜面培養(yǎng)2.5d ；
[0154]B、一級種子培養(yǎng)
[0155]使用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于80mLYPD液體培養(yǎng)基中，在溫度30 °C與轉(zhuǎn)速230rad/min條件下振蕩培養(yǎng)，直到培養(yǎng)液OD6qqim達(dá)到14.0時得到一級種子液；
[0156]C、制備高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基
[0157]將2重量份葡萄糖、0.8重量份蛋白胨、0.4重量份磷酸二氫鉀、0.03重量份硫酸鎂、0.04重量份硫酸亞鐵、0.05重量份硫酸錳與補(bǔ)充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.14MPa與溫度124°C的條件下滅菌20min，接著使用濃度為以體積計28%的氨水將其pH值調(diào)節(jié)至6.0，得到一種高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0158]D、發(fā)酵培養(yǎng)
[0159]按照以液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量計8%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度30 °C、初始pH 5.5、壓力0.05MPa、轉(zhuǎn)速250作(1/1]1；[11與通氣比1:2.0的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);與此同時，通過通氣比、壓力與轉(zhuǎn)速調(diào)整，將整個發(fā)酵過程中溶解氧DO控制在3 20%，通過滴加濃度為以體積計28%的氨水將在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值控制在6.2 ；
[0160]E、補(bǔ)料
[0161]在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中，在通氣量、壓力與轉(zhuǎn)速不變時，如果溶解氧DO在Imin內(nèi)升高30%以上時，需要按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計20%的添加量往發(fā)酵培養(yǎng)液中添加補(bǔ)料培養(yǎng)基;所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基由38重量份葡萄糖與15重量份硫酸鎂組成，在蒸汽壓力104kPa與溫度116°c的條件下滅菌20min，在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加9次所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基。整個發(fā)酵培養(yǎng)時間為48h;
[0162]F、添加輔料
[0163]在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前0.5h，按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計2 %的添加量添加甘露醇保護(hù)劑，5%的添加量添加吐溫80，充分混勻；接著在離心轉(zhuǎn)速3400rpm的條件下離心濃縮3倍;再按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計24%的添加量添加粒度100?150目米糠、28%的添加量添加加益粉，充分混勻，接著輸送至冷風(fēng)干燥機(jī)中在溫度為5?15°C的條件下進(jìn)行冷風(fēng)干燥5h，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。
[0164]根據(jù)本說明書描述的方法測定所述粉狀畢赤酵母粉的有效活菌數(shù)CFU為61.2億/g;雜菌率蘭10.0 % ;水分6.6%； pH值5.9;在溫度25°C以下保存6個月時菌數(shù)保存率3 75%。
[0165]本實施例制備的粉狀畢赤酵母為灰黃色粉末，無潮解結(jié)塊。
[0166]對比實施例1:
[0167]該對比實施例按照與實施例1相同的方式進(jìn)行，只是不添加本發(fā)明補(bǔ)料培養(yǎng)基，也不控制在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值。
[0168]實施例1與對比實施例1的OD6qqim隨發(fā)酵時間而改變的情況列于圖1中。
[0169]附圖1的結(jié)果非常清楚地顯示，通過粉狀畢赤酵母高密度補(bǔ)料發(fā)酵，顯著提高了發(fā)酵液的單位產(chǎn)量，單位產(chǎn)量提高30.4%，降低了單位成本，單位成本降低19.2%，設(shè)備利用率提尚O
[0170]對比實施例2:
[0171]該對比實施例按照與實施例2相同的方式進(jìn)行，只是使用甘露醇、吐溫80單一保護(hù)劑，使用米糠、加益粉單一載體。
[0172]實施例2與對比實施例2使用不同保護(hù)劑與載體對粉狀畢赤酵母菌體存活率影響列于附圖2中。
[0173]附圖2的結(jié)果非常明顯地顯示，在選用單一保護(hù)劑和單一載體時，粉狀畢赤酵母的存活率明顯低于通過正交試驗篩選出的最佳種類及配比的保護(hù)劑和載體。由此說明，復(fù)合保護(hù)劑和載體賦予了菌體本身最佳保護(hù)，從而獲得了高活性粉狀畢赤酵母菌粉。
【主權(quán)項】
1.一種粉狀畢赤酵母高活性菌粉的制備方法，其特征在于該制備方法的步驟如下: A、活化培養(yǎng) 用無菌吸管吸取0.3?0.5mL麥芽汁液體培養(yǎng)基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內(nèi)，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養(yǎng)基中，在溫度26?30°C下活化培養(yǎng)2?3d; 按照以YB)培養(yǎng)基重量計3?5%接種量，將活化培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于YI3D培養(yǎng)基斜面上，在溫度26?30 °C下斜面培養(yǎng)2?3d; B、一級種子培養(yǎng) 使用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于50?80mL YPD液體培養(yǎng)基中，在溫度28?32 °C與轉(zhuǎn)速200?250rad/min條件下振蕩培養(yǎng)，直到培養(yǎng)液OD6(X)r?達(dá)到12.0?15.0時得到一級種子液； C、制備高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基 將I?3重量份葡萄糖、0.5?1.5重量份蛋白胨、0.1?0.5重量份磷酸二氫鉀、0.01?0.05重量份硫酸鎂、0.03?0.06重量份硫酸亞鐵、0.03?0.06重量份硫酸錳與補(bǔ)充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.11?0.1510^與溫度121°(:?125°(:的條件下滅菌18?22min，接著使用濃度為以體積計22?28%的氨水將其pH值調(diào)節(jié)至5.0?6.0，得到一種高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基； D、發(fā)酵培養(yǎng) 按照以液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量計6?10%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度2 8?3 2 °C、初始P H 5.5、壓力0.0 3?0.06MPa、轉(zhuǎn)速200?350rad/min與通氣比1:1?2.5的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);與此同時，通過通氣比、壓力與轉(zhuǎn)速調(diào)整，將整個發(fā)酵過程中溶解氧DO控制在320%，通過滴加濃度為以體積計22?28%的氨水將在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值控制在5.5?6.5; E、補(bǔ)料 在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中，在通氣量、壓力與轉(zhuǎn)速不變時，如果溶解氧DO在Imin內(nèi)升高30 %以上時，需要按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計18?22 %的添加量，往發(fā)酵培養(yǎng)液中添加由35?45重量份葡萄糖與5?15重量份硫酸鎂組成的補(bǔ)料培養(yǎng)基； F、添加輔料 在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前0.5?lh，按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計I?3%的添加量添加甘露醇保護(hù)劑與2?6%的添加量添加吐溫80，充分混勻;接著在離心轉(zhuǎn)速2000?4000rpm的條件下離心濃縮2?4倍;再按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積計20?30 %的添加量添加米糠載體、20?30 %的添加量添加加益粉載體，充分混勻，接著輸送至冷風(fēng)干燥機(jī)中進(jìn)行冷風(fēng)干燥，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟A中，在按照大麥芽與水的重量比1:3?5，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度55?600C下進(jìn)行糖化3.5?4.5h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.5?0.7kg/cm2下滅菌38?42min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到一種麥芽汁液體培養(yǎng)基。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟C與步驟D中，所述的氨水濃度是以體積計22?28 %。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟C中，高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)基由2重量份葡萄糖、I重量份蛋白胨、0.3重量份磷酸二氫鉀、0.03重量份硫酸鎂、0.05重量份硫酸亞鐵、0.05重量份硫酸猛與補(bǔ)充至1000重量份蒸饋水組成。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟E中，所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基在蒸汽壓力102?104kPa與溫度110?117°C的條件下滅菌18?22min。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟E中，在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加8?10次所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于整個發(fā)酵培養(yǎng)時間是36?48h。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活性菌粉，其特征在于在步驟F中，在溫度為5?15°C的條件下進(jìn)行冷風(fēng)干燥4?5h。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活性菌粉，其特征在于在步驟F中，所述的米糠載體粒度是100?150目。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法制備得到的高活性粉狀畢赤酵母菌粉，其特征在于粉狀畢赤酵母有效活菌數(shù)CFU ^ 60.0億/g ；雜菌率= 10.0%;水分5.5-7.0%; pH值5.5?6.5;在溫度25°C以下保存6個月時菌數(shù)保存率375%。
【文檔編號】C12N1/16GK105925495SQ201610564272
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月18日
【發(fā)明人】趙躍進(jìn), 趙躍文, 趙躍民, 易卿, 杜亞楠, 趙潔, 趙科, 謝松, 張盼, 任寸娟, 秦中輝, 趙九生
【申請人】三門峽龍飛生物工程有限公司