一株短小芽孢桿菌及其在解磷解鉀產(chǎn)酸中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株短小芽孢桿菌及其在解磷解鉀產(chǎn)酸中的應用。所述的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) YJ04于2016年3月11日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），菌種保藏號為 GDMCC No：60019。所述菌株在含Ca3(PO4)2和鉀長石的培養(yǎng)基上具有明顯解磷解鉀效果，在含淀粉碳源培養(yǎng)基上能夠顯著降低pH值，具有產(chǎn)酸能力。所述的短小芽孢桿菌能夠顯著地促進水稻、油麥菜等作物的生長和提高產(chǎn)量，可應用于各種農(nóng)作物種植應用。在經(jīng)本發(fā)明的短小芽孢桿菌處理后，顯著促進水稻、油麥菜等作物的生長。GDMCC No：6001920160311
【專利說明】
-株短小芽抱桿菌及其在解磯解鐘產(chǎn)酸中的應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，設(shè)及一株短小芽抱桿菌及其在解憐解鐘產(chǎn) 酸中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國大多數(shù)±壤中憐含量較低，因為±壤中的憐主要W憐酸鹽的形式存在而不利 于植物的吸收利用。雖然施加憐肥，可W保證作物對憐的吸收，但卻易造成±壤板結(jié)與環(huán)境 的污染，不利于可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。在自然界中存在著一類溶憐微生物，它們能將±壤中難 溶態(tài)的憐轉(zhuǎn)化為可供植物吸收利用的有效態(tài)憐。溶憐菌之所W能提高上壤中有效憐的含量 是因為溶憐菌在自身的代謝過程中能分泌一些酸性物質(zhì)，運些酸性物質(zhì)與上壤中的憐酸巧 等難溶態(tài)憐作用之后產(chǎn)生了可供植物吸收利用的有效憐。鐘也是植物生長所必需的=大營 養(yǎng)元素之一，它可促進植物莖桿健壯及改善果實的品質(zhì)。鐘一般W云母、鐘長石等難溶態(tài)鐘 的形式存在于±壤中而不利于植物的吸收利用。解鐘微生物能將±壤中難溶態(tài)的鐘轉(zhuǎn)化為 可供植物吸收利用的速效鐘從而促進植物的生長。許多研究表明解鐘菌通過分泌有機酸的 能力促進植物對憐及鐘的吸收從而促進作物的生長。
[0003] 芽抱桿菌廣泛地存在于自然界，具有繁殖快速、代謝快的特點。該屬細菌的重要特 性是能夠產(chǎn)生對不利條件具有特殊抵抗力的芽抱。尤其是該屬的許多菌能水解淀粉，分解 蛋白質(zhì)、果膠、藻酸鹽等，工業(yè)上用于提取淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、葡聚糖酶、纖維素酶等。 它們也存在于±壤、植物組織內(nèi)、水和空氣中，與自然界物質(zhì)轉(zhuǎn)化、±壤肥力、環(huán)境衛(wèi)生均密 切相關(guān)。同時它們對有機質(zhì)分解力強，增殖的同時，會釋放出高活性的分解酵素，合成多種 有機酸、酶、生理活性等物質(zhì)，及其它多種容易被利用的養(yǎng)分，促進作物生長。隨著±壤的生 物多樣性退化及±壤堿化，芽抱桿菌能夠在逆境中存活和生長，為±壤提供各種酶類和增 加±壤微生物多樣性。篩選能夠產(chǎn)酸的芽抱桿菌應用在堿性±壤，促進作物生長具有重要 的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一株短小芽抱桿菌（Bacillus pumilus) YJ04。所述菌株為具有解憐、解鐘能力、同時具有產(chǎn)酸能力、生長勢良好、對環(huán)境適應性強等 特征的短小芽抱桿菌菌株。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述菌株在解憐、解鐘、產(chǎn)酸中的應用。所述短小芽抱 桿菌產(chǎn)酸菌株的應用能夠釋放±壤中難溶憐、鐘為可溶性憐、鐘，大大提高±壤中憐、鐘的 利用率，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，有效提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過W下技術(shù)方案予W實現(xiàn)的。
[0007] 一株短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)YJ04,所述菌株于2016年3月11日保藏于 廣東省微生物菌種保藏中屯、(GDMCC)，菌種保藏號為GDMCC No: 60019，分類命名為短小芽抱 桿菌(BaciIlus P皿iIus);保藏地址為廣東省廣州市先烈中路100號。
[0008] 現(xiàn)有已公開的解憐解鐘芽抱桿菌主要是巨大芽抱桿菌、膠質(zhì)芽抱桿菌、枯草芽抱 桿菌等，短小芽抱桿菌很少見，而本發(fā)明公布的短小芽抱桿菌解憐、解鐘量分別為 21.56mg丄-哺20.62mg丄-1，溶液抑值降為3.0~3.2之間，經(jīng)查找已有公開的短小芽抱桿菌 基本沒有能降低溶液抑值的試驗結(jié)果。因此，本發(fā)明相較于現(xiàn)有技術(shù)具有意想不到的技術(shù) 效果。
[0009] 所述短小芽抱桿菌(BaciIlus pumiIus)YJ04菌株具有如下形態(tài)和生理、生化特 性：
[0010] a、菌體形態(tài)特性:短小芽抱桿菌YJ04為革蘭氏陽性菌，細胞呈短桿狀，圓末端，單 個或呈短鏈排列。能夠產(chǎn)生楠圓形芽抱，中生或次端生。
[0011] b、菌落形態(tài)特性：菌落在LB培養(yǎng)基（膜蛋白腺（IYyptone) IOg. 1/1，酵母提取物 (Yeast extract) 5g丄-1，氯化鋼(化Cl) IOg丄-1，抑自然，固體培養(yǎng)基加瓊脂1 Sg丄-1)平板上 生長速度較快，菌落圓形，半透明。30°C，生長48小時，菌落直徑5-7毫米。生長溫度范圍10 °C -45 °C及pH生長范圍為3.0-8.0，最佳抑值生長范圍5.0-7.0。細胞短桿狀，形成芽抱，細胞 大小0.7-0.祉m Xl. 9-2.祉m，中生或次端生芽抱。
[0012] C、生理生化特性:革蘭氏陽性，菌株在改良PDA液體培養(yǎng)基上生長產(chǎn)酸，使培養(yǎng)液 的抑值由6.7降低到pH3.0左右。淀粉水解、甲基紅試驗、產(chǎn)氨試驗、嗎I噪試驗、過氧化氨酶， 脈酶試驗均為陽性，VP(voges proskauer)試驗、明膠液化陰性。能W淀粉、糊精、N-乙酷基- D-葡萄糖胺、側(cè)金盞花醇、レ阿拉伯糖、D-海藻糖、D-阿拉伯糖、赤藻糖醇、D-纖維二糖、D-果 糖、龍膽二糖、レ果糖、日-D-葡萄糖、m-肌醇、a-D-乳糖、麥芽糖、D-甘露醇、D-蜜二糖、D，レ乳 酸、e-甲基-D-葡萄糖巧、阿洛酬糖、D-棉子糖、薦糖、D-山梨醇、松立糖、順-烏頭酸（丙締立 簇酸）、巧樣酸、D-半乳糖醒酸、レ組氨酸、D-葡萄糖酸、(6-?基下酸、a-酬戊二酸、丙二酸、奎 尼酸、D-丙氨酸、漠下二酸、班巧酸、癸二酸、D-葡萄二酸、^丙氨酸a-天口冬氨酸、^丙氨 酷甘氨酸、^天冬酷胺酸、徑基-^脯氨酸、6-憐酸葡萄糖a-谷氨酸、甘氨酷-^天口冬氨 酸、^絲氨酸、己六醇、^焦谷氨酸a-脯氨酸a-蘇氨酸、尿巧、丙=醇、丫-氨基下酸、苯丙 氨酸、1-憐酸葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長。抑生長范圍抑3.0-P冊.0;對化Cl較敏感，在低 于3.5%化Cl濃度下可生長;菌株對卡拉霉素、慶大霉素敏感，低濃度巧iig.ml/1)的運兩種抗 生素就能抑制其生長;對鏈霉素、新霉素和四環(huán)素的耐受性差、較低濃度(5化g.ml/i)的運幾 種抗生素就能抑制其生長?？稍诘陀趌〇〇yg.ml/i的氨節(jié)青霉素、5yg.ml/i紅霉素和氯霉素培 養(yǎng)基上生長。
[0013] 進一步地，所述菌株的16S rRNA序列如沈Q ID N0:1所示。
[0014] -種具有解憐、解鐘及產(chǎn)酸效果的接種劑，含有短小芽抱桿菌（Baci Ilus pumi Ius) YJ04 菌株。
[001引優(yōu)選地，所述菌株的發(fā)酵液濃度為3X IO9~5X IO9C即.mL-i，按IL發(fā)酵液與化g賠 石的比例混合，制備成菌數(shù)達1.5~2.5 X IO9CFU.的接種劑。
[0016] -種促進農(nóng)作物生長的方法，將短小芽抱桿菌(BaciIlus pumiIus)YJ04菌株制成 液體或固體菌劑或菌肥，將所述菌劑或菌肥用于種植農(nóng)作物。
[0017] 優(yōu)選地，所述農(nóng)作物為水稻或油麥菜。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果在于：
[0019] 本發(fā)明提供了一株來源于藥用野生稻植物組織內(nèi)生的短小芽抱桿菌YJ04,所述菌 株在含化3(P〇4)2和鐘長石的培養(yǎng)基上具有明顯解憐解鐘效果，在含淀粉碳源培養(yǎng)基上能夠 顯著降低pH值，具有產(chǎn)酸能力。所述的短小芽抱桿菌能夠顯著地促進水稻、油麥菜等作物的 生長和提高產(chǎn)量，可應用于各種農(nóng)作物種植應用。在經(jīng)本發(fā)明的短小芽抱桿菌處理后，顯著 促進水稻、油麥菜等作物的生長。
【附圖說明】
[0020] 圖1為短小芽抱桿菌YJ04的芽抱染色結(jié)果圖;標尺1皿。
[0021] 圖2為短小芽抱桿菌YJ04的解憐(A)、解鐘(B)效果。
[0022] 圖3為短小芽抱桿菌YJ04促油麥菜生長效果(A); (B)為未施用短小芽抱桿菌對照。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，但實施例并不對 本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常 規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0024] 實施例1菌株的分離
[0025] 本發(fā)明菌株的分離純化方法如下：將采集的新鮮藥用野生稻樣本用蒸饋水洗凈， 然后剪下根置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用3%的雙氧水化2〇2)浸泡4min( W除去根表面的腐爛 物質(zhì)），無菌水洗涂一次，再用0.1 %的升隸化gCb)浸泡5min，無菌水中振動洗涂5~7次，每 次5~lOmin，并將最后一次洗涂液涂布于LB固體培養(yǎng)基上，W檢測消毒是否徹底。將表面消 毒完全的根用已滅菌手術(shù)刀切碎，接種到裝有5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，膠塞密封后，置 于3(TC的人工培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，整個操作均在無菌條件下完成。待長出菌體后，將含有菌 液試管置于80°C處理20分鐘，殺死非芽抱菌，取50化、100化和2(K)化分別涂布于含酪紅指示 劑的LB平板上(酪紅在培養(yǎng)基中用作抑值的指示劑，中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時 為紫色）d30°C，濕度為85%條件下，進行厭氧及好氧培養(yǎng)。再挑取單菌落(并記錄產(chǎn)酸、產(chǎn)堿 性狀)分別再涂平板，直至菌落的形狀、顏色、質(zhì)地、透明度一致。最后通過簡單染色和鏡檢， 進一步觀察其形態(tài)，W長度均一、寬度一致、染色情況統(tǒng)一為菌株純化標準。
[0026] 保存:將分離純化后的菌株在分離培養(yǎng)基平板及斜面上培養(yǎng)2~3d后，收集平板上 的菌體。部分保存于15%滅菌甘油中（-20°C)和(-80°C)。
[0027] 實施例2鑒定及保藏
[00%]實施例1分離得到的一株短小芽抱桿菌具有如下形態(tài)和生理、生化特性：
[0029] a、菌體形態(tài)特性:短小芽抱桿菌的細胞為革蘭氏陽性菌，細胞短桿狀，形成芽抱， 大小0.7~0.祉m X 1.9~2.祉m，中生或次端生芽抱(見圖1)。
[0030] b、菌落形態(tài)特性;菌落在LB培養(yǎng)基平板上生長速度較快，菌落圓形，乳白色，半透 明。30°C，生長48小時，菌落直徑5~7mm。
[0031] C、生理生化特性:兼性厭氧，革蘭氏陽性，菌株在改良PDA液體培養(yǎng)基上生長產(chǎn)酸， 使培養(yǎng)液的pH值由6.7降低到抑3.0左右。淀粉水解、甲基紅試驗、產(chǎn)氨試驗、嗎I噪試驗、過氧 化氨酶，脈酶試驗均為陽性，VP(voges proskauer)試驗、明膠液化陰性。能W淀粉、糊精、N- 乙酷基-D-葡萄糖胺、側(cè)金盞花醇、レ阿拉伯糖、D-海藻糖、D-阿拉伯糖、赤藻糖醇、D-纖維二 糖、D-果糖、龍膽二糖a-果糖、a-D-葡萄糖、m-肌醇、a-D-乳糖、麥芽糖、D-甘露醇、D-蜜二 糖、D，レ乳酸、(6-甲基-D-葡萄糖巧、阿洛酬糖、D-棉子糖、薦糖、D-山梨醇、松=糖、順-烏頭 酸(丙締=簇酸）、巧樣酸、D-半乳糖醒酸、レ組氨酸、D-葡萄糖酸、(6-?基下酸、a-酬戊二酸、 丙二酸、奎尼酸、D-丙氨酸、漠下二酸、班巧酸、癸二酸、D-葡萄二酸、レ丙氨酸a-天口冬氨 酸、^丙氨酷甘氨酸天冬酷胺酸、徑基-^脯氨酸、6-憐酸葡萄糖、^谷氨酸、甘氨酷-レ 天口冬氨酸、レ絲氨酸、己六醇、レ焦谷氨酸、レ脯氨酸、レ蘇氨酸、尿巧、丙=醇、丫-氨基下 酸、苯丙氨酸、1-憐酸葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長。抑生長范圍抑3.0-P冊.0;對化Cl較敏 感，在低于3.5%化Cl濃度下可生長;菌株對卡拉霉素、慶大霉素敏感，低濃度(5iig.ml/i)的 運兩種抗生素就能抑制其生長；對鏈霉素、新霉素和四環(huán)素的耐受性差、較低濃度（50y g.血-1)的運幾種抗生素就能抑制其生長?？稍诘陀?0化g.mL-i的氨節(jié)青霉素、5yg.血-1紅霉 素和氯霉素培養(yǎng)基上生長。
[0032] 該菌株的16S rDNA序列如沈Q ID N0:1所示。
[0033] 所述的短小芽抱桿菌（BaciIlus pumiIus)分子分類地位的確定：采用細菌16S rRNA基因通用引物25f和149化進行擴增，將PCR產(chǎn)物直接進行序列測定。將獲得的DNA序列 輸入GenBank進行Blast比對，初步確定本發(fā)明的短小芽抱桿菌(BaciIlus pumiIus)菌株在 分類學中的屬、種的位置。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的短小芽抱桿菌屬于芽抱桿菌屬(Bacillus),與 短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)模式菌株DSM 27T同源性為99.8%，但二者的序列不完 全一致，有0.2%的差異，表明二者是同種內(nèi)不同的菌株。結(jié)合上述的生理生化特性、16S rDNA序列分析及文獻查閱，本發(fā)明的短小芽抱桿菌(Baci 1 Ius pumiIus)應歸屬于芽抱桿菌 屬（Bacillus)。
[0034] 本發(fā)明所述的短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus YJ04)已于2016年3月11日保藏 于廣東省微生物菌種保藏中屯、(GDMCC)，菌種保藏號為GDMCC No: 60019，分類命名為短小芽 抱桿菌(Bacillus P皿ilus);保藏地址為廣東省廣州市先烈中路100號。
[0035] 本發(fā)明的菌種可作為解憐、解鐘及產(chǎn)酸效果的接種劑W促進水稻、油麥菜等作物 生長。如可將分離純化得到的單菌落采用LB液體培養(yǎng)基于3(TC培養(yǎng)48小時，菌數(shù)達3X109 ~5X 10化即.mL-i，用賠石作載體。按IL短小芽抱桿菌發(fā)酵液與賠石發(fā)酵液與2kg賠石的比 例混合，制備成菌數(shù)達1.5~2.5 X IO9CFU.的菌劑。
[0036] 實施例3解憐、解鐘效果
[0037] 將分離純化到的短小芽抱桿菌進行活化后，用無菌水制成濃度為IO8細胞.ml/i的 菌懸液，吸取10化菌懸液分別點植于解憐篩選PKO平板及解鐘細菌篩選平板，于30°C細菌培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)4她，觀察有無透明圈生成，測定透明圈直徑化）、菌落直徑化）。試驗的短小芽抱 桿菌在解憐篩選PKO平板及解鐘細菌篩選平板中得L/1)比值分別為1.29和1.15(見圖2)，相 對應的解憐、解鐘量分別為21.56mg丄-哺20.62mg丄-1。
[003引解憐篩選 PKO 培養(yǎng)基（1L):葡萄糖 10g，（NH4)2S04 0.5g，化 Cl 0.2g，KCl 0.2邑， MgS04?7H20 0.03g，MnS04 0.03g，F(xiàn)eS04 0.003g，Yeast exhact 0.5g，Agar 15-20g，Ca3 (P04)2 5g，pH 6.8-7.0。
[0039] 解鐘細菌篩選培養(yǎng)基（IL):鐘長石2.5g，Na2冊〇4 0.2g，MgS〇4 ? 7此0 0.2g，化Cl 0.2g，&C〇3 5g，Glucose 10g，CaS〇4?7出0 0.1g，Agar 15-20g，pH 6.8-7.0。
[0040] 實施例4發(fā)酵產(chǎn)酸試驗
[0041] 在IL如下發(fā)酵液中，含有葡萄糖5g，淀粉5g，±豆汁液500mL(200g±豆切薄片于 SOOmL水中煮沸騰，過濾），K此P〇4 0.02g，氯化鋼0.5g，K2HPO40.02g，溶液初始抑值為6.6，室 溫下發(fā)酵3~7天，溶液抑值降為3.0~3.2之間。
[0042] 實施例5促水稻生長效果
[0043] 采用盆栽法試驗解憐、解鐘、產(chǎn)酸的短小芽抱桿菌YJ04菌株接菌水稻品種中嘉早 17號的效果。
[0044] 將菌株活化后，在對數(shù)生長期內(nèi)，制成菌懸液IO8細胞.ml/i濃度浸泡有12d苗齡的 水稻苗根部36h，對照用無菌水浸泡。然后轉(zhuǎn)接到裝有540g水稻±的塑料大杯中，每個塑料 大杯中再加入SOmL植物少氮營養(yǎng)液，3個重復，放室溫下進行培養(yǎng)。每天及時觀察、添加水。 培養(yǎng)觀察至20d后，試驗組加入相應的濃度為IO8細胞.mL-i的菌液30mL及50mL植物少氮營養(yǎng) 液，對照組加入等量無菌水及50mL植物無氮營養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)觀察至15d后拍照記錄，并測 定水稻的葉長、根長、分葉數(shù)、鮮重、干重及根重。
[0045] 植物少氮培養(yǎng)液成分:硝酸巧0.003 %，硫酸巧0.046 %，憐酸氨二鐘0.0136 %，氯 化鐘0.0075 %，硫酸儀0.0046 %，巧樣酸鐵0.0075 %，微量元素液Iml;微量元素液組成： 也B03 2.86g，MnS〇4 1.81g，ZnS〇4 0.22g，CuS〇4 0.8g，也Mo〇4 0.02g，也0 lOOOmL。
[0046] 短小芽抱桿菌YJ04接種水稻經(jīng)盆栽培養(yǎng)35d后，拍照并測量水稻的葉長、根長、分 葉數(shù)、鮮重、干重及根重。結(jié)果見表1。由表1可W看出，短小芽抱桿菌YJ04接種水稻之后，與 沒有接種菌株的對照相比水稻的葉長、根長、鮮重、根重都達到了顯著差異，對水稻有明顯 的促生作用。其中葉長增加了 35.3%，根增長了 42.7%，鮮重增加了 81.9%，干重增加了 83.6%，根重增加了80%。
[0047] 表1短小芽抱桿菌YJ04接種水稻后的促生效果 「OfURl
[0049] 注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(p<0.05)
[0050] 實施例6促進油麥菜生長試驗
[0051 ]將活化得到的單菌落采用LB液體培養(yǎng)基于30°C培養(yǎng)48小時，菌數(shù)達5X IO9CFlhmL -1，用賠石作載體。將短小芽抱桿菌發(fā)酵液與賠石（1:2)混合(如1升培養(yǎng)液混合2公斤賠石）， 制備成菌數(shù)達1.5~2.OX IO9C即.g-i的菌劑。將短小芽抱桿菌-賠石接種劑化g施用45棵田 間移栽5天后的油麥菜，不接種的45棵田間移栽5天后的油麥菜為對照。25天后與未接種的 油麥菜對照相比（見圖3)，油麥菜干重平均增加20%，植株葉綠素平均增加14%，根長平均 增長15%。
【主權(quán)項】
1. 一株短小芽孢桿菌YJ04,其特征在于，所述菌株于2016年3月 11日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，菌種保藏號為GDMCC N〇:60019。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO: 1 所示。3. -種具有解磷、解鉀及產(chǎn)酸效果的接種劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述菌株。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的接種劑，其特征在于，所述菌株的發(fā)酵液濃度為3 X IO9~5 X IO9CFU.mL-1，按I L發(fā)酵液與2kg蛭石的比例混合，制備成菌數(shù)達1 · 5~2 · 5 X IO9 CFU· g-1的 接種劑。5. -種促進農(nóng)作物生長的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1所述菌株制成液體或固體菌 劑或菌肥，將所述菌劑或菌肥用于種植農(nóng)作物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述農(nóng)作物為水稻或油麥菜。
【文檔編號】C12R1/07GK105925497SQ201610249913
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】彭桂香, 譚志遠, 李永濤
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學