一種分批補(bǔ)鹽提高乳酸菌耐鹽能力的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種分批補(bǔ)鹽提高乳酸菌耐鹽能力的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）CGMCC no. 3792為出發(fā)菌株，在發(fā)酵0小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)分別添加6%（w/v）、3%和3%的NaCl至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)96小時(shí)，收集所獲得的菌體，接種至含18% NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)120小時(shí)，活菌數(shù)比一次性加鹽培養(yǎng)的活菌數(shù)提高了3倍。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、便于操作，可用于乳酸菌的發(fā)酵生產(chǎn)。CGMCC No.379220100429
【專利說(shuō)明】
-種分批補(bǔ)鹽提高乳酸菌耐鹽能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種分批補(bǔ)鹽提高乳酸菌耐鹽能力的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragaoococctzs AaJo如，廣泛存在于高鹽環(huán)境中，特別是 醬油膠、豆瓣和魚(yú)醬等鹽潰食品中。將嗜鹽四聯(lián)球菌應(yīng)用于豆鼓及醬油發(fā)酵中，產(chǎn)生了更多 的揮發(fā)性特征風(fēng)味物質(zhì)，并且使產(chǎn)品的色澤更加光亮，運(yùn)將有助于改善高鹽發(fā)酵調(diào)味品的 品質(zhì)。然而，在運(yùn)些傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品工業(yè)應(yīng)用中，嗜鹽四聯(lián)球菌不可避免地遭受高鹽脅迫環(huán) 境，從而嚴(yán)重抑制了菌體的正常生理代謝，使其制造食品的效率降低，并且使產(chǎn)品的品質(zhì)受 到影響。因此，如何提高嗜鹽四聯(lián)球菌的耐鹽能力已成為產(chǎn)業(yè)界和學(xué)術(shù)界共同關(guān)注的焦點(diǎn) 問(wèn)題。
[0003] 應(yīng)對(duì)鹽脅迫，乳酸菌往往會(huì)誘發(fā)多種脅迫響應(yīng)機(jī)制，包括調(diào)控胞內(nèi)碳代謝、誘導(dǎo)表 達(dá)脅迫應(yīng)激蛋白W及保持細(xì)胞膜生理功能等。此外，適應(yīng)性反應(yīng)也是乳酸菌常見(jiàn)的一種應(yīng) 激保護(hù)方式，當(dāng)細(xì)胞處于脅迫環(huán)境中時(shí)，由一種適應(yīng)性反應(yīng)所誘導(dǎo)的保護(hù)作用，可W保護(hù)細(xì) 胞抵御更為惡劣的環(huán)境脅迫。W分批補(bǔ)鹽的方式，使菌體逐步適應(yīng)高鹽環(huán)境，從而提高其耐 鹽能力，運(yùn)些反應(yīng)可W用于提高乳酸菌在脅迫條件下的存活和改進(jìn)它們的生產(chǎn)工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種利用分批補(bǔ)鹽提高乳酸菌耐鹽能力的方法。
[0005] 所述的分批補(bǔ)鹽方式為:在發(fā)酵初始時(shí)刻，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加6% NaCl,在發(fā)酵 24小時(shí)和48小時(shí)分別補(bǔ)加3% NaCl，發(fā)酵培養(yǎng)基NaCl終濃度為12%。
[0006] 菌株:嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococctzs AaJo如_z7t/s)CGMCC 3792,實(shí)驗(yàn)室從醬油 膠中分離，經(jīng)形態(tài)、生理生化特性試驗(yàn)和16S rDNA測(cè)序鑒定，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中屯、（畑ina General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研 究所;保藏日期為2010年4月29日，保藏編號(hào)為CGMCC no. 3792,并分類命名為嗜鹽四聯(lián)球 舊iTetragenococcus halophilus)。
[0007] -種利用分批補(bǔ)鹽提高乳酸菌耐鹽能力的方法，包括W下步驟： (1) 種子培養(yǎng)方法:取-8(TC保藏的嗜鹽四聯(lián)球菌甘油管儲(chǔ)存液W5%(v/v)的接種量接 種于種子培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)24小時(shí)。種子培養(yǎng)基為:80 g/L膜蛋白腺，64 g/L大豆蛋 白腺，5 g/L葡萄糖，0.5 g/L抗壞血酸，0.25 g/L MgS〇4'7也0,抑為7.0; (2) 發(fā)酵培養(yǎng)方法:取上述種子液，W5%(v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在0 小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)補(bǔ)力日6%、3%和3%的化Cl，30°C靜置培養(yǎng)96小時(shí)。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:80 g/L膜蛋白腺，64 g/L大豆蛋白腺，5 g/L葡萄糖，0.5 g/L抗壞血酸，0.25 g/L MgS〇4'7也0， 抑為7.0。
[000引生物量的測(cè)定:取發(fā)酵液離屯、（10000 r/min, 5 min, 4°C)收集菌體，用無(wú)菌水離 屯、洗涂3次后稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，搖勻，用TU-1901雙束光紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，于600 nm處比 濁測(cè)定OD值。
[0009] 耐鹽能力的測(cè)定:收集發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體，用無(wú)菌水洗涂3次后，重懸于無(wú)菌水中， 調(diào)節(jié)菌體濃度至ODsoo = 2.0，W5%(v/v)的接種量接種于含有18%化Cl(v/v)的發(fā)酵培養(yǎng)基 中，靜置培養(yǎng)120小時(shí)，取發(fā)酵液離屯、（10000 r/min, 5 min, 4°C)收集菌體，用無(wú)菌水離屯、 洗涂3次后，適當(dāng)稀釋涂布于固體平板(含2%瓊脂粉的種子培養(yǎng)基）中，將平板置于3(TC恒溫 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后，計(jì)算活菌數(shù)。
[0010] 本發(fā)明的有益效果:在高鹽發(fā)酵過(guò)程中，采用分批補(bǔ)鹽的方式，顯著提高了細(xì)胞的 耐鹽能力，將菌體接種于含18%化Cl的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，活菌數(shù)比一次性加鹽培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù) 量提高了 3倍。本發(fā)明提供一種分批補(bǔ)鹽提高嗜鹽四聯(lián)球菌耐鹽能力的方法，簡(jiǎn)單易行，為 乳酸菌工業(yè)化高鹽發(fā)酵提供了理論指導(dǎo)。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 實(shí)例1 (對(duì)照組）:一次性加鹽培養(yǎng)的嗜鹽四聯(lián)球菌CGMCC 3792的耐鹽能力(表1) (1) 種子培養(yǎng)方法:取-80°C保藏的甘油儲(chǔ)存液W5%(v/v)的接種量接種于種子培養(yǎng)基 中，30°C靜置培養(yǎng)24小時(shí)。種子培養(yǎng)基為:80 g/L膜蛋白腺，64 g/L大豆蛋白腺，5 g/L葡萄 糖，0.5 g/L抗壞血酸，0.25 g/L MgS〇4'7出0，抑為7.0; (2) 發(fā)酵培養(yǎng)方法：取上述種子液，按5%的接種量接種至含12%(v/v)化Cl的發(fā)酵培養(yǎng) 基，靜置培養(yǎng)96小時(shí)。發(fā)酵培養(yǎng)基為:80 g/L膜蛋白腺，64 g/L大豆蛋白腺，5 g/L葡萄糖， 0.5 g/L抗壞血酸，0.25 g/L MgS〇4'7出0，抑為7.0; (3) 耐鹽能力的測(cè)定:取上述發(fā)酵液離屯、（10000 r/min，4°C，5 min)收集菌體，重懸于 無(wú)菌水中，調(diào)節(jié)菌體濃度至ODsoo = 2.0，W5%(v/v)的接種量接種于含有18%化Cl(v/v)的 發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)120小時(shí)。取發(fā)酵液離屯、（10000 r/min, 5 min, 4°C)收集菌體，用 無(wú)菌水離屯、洗涂3次后，適當(dāng)稀釋涂布于固體平板(含2%瓊脂粉的種子培養(yǎng)基）中，將平板置 于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后，計(jì)算活菌數(shù)為3.3 X IO6個(gè)/mL。
[0012] 實(shí)例2(實(shí)驗(yàn)組）:分批補(bǔ)鹽培養(yǎng)的嗜鹽四聯(lián)球菌CGMCC 3792的耐鹽能力(表1) (1) 種子培養(yǎng)方法:同實(shí)例1; (2) 發(fā)酵培養(yǎng)方法:取上述種子液，按5%(v/v)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在0 小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)補(bǔ)力日6%、3%和3%的化Cl，30°C靜置培養(yǎng)96小時(shí)。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:80 g/L膜蛋白腺，64 g/L大豆蛋白腺，5 g/L葡萄糖，0.5 g/L抗壞血酸，0.25 g/L MgS〇4'7此0， 抑為7.0; (3) 耐鹽能力的測(cè)定：同實(shí)例1，并最終計(jì)算活菌數(shù)為1.0 X IO7個(gè)/mL。
[0013] 表1不同加鹽方式對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌耐鹽能力的影響
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分批補(bǔ)鹽提高乳酸菌耐鹽能力的方法，包含以下步驟： (1)種子培養(yǎng):取-80°c保藏的乳酸菌甘油管儲(chǔ)存液，以5%(v/v)的接種量接種于種子培 養(yǎng)基中，30 °C靜置培養(yǎng)24小時(shí)； (2 )發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子液以5%( v/v)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中30 °C靜置培養(yǎng)96 小時(shí)； (3)在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中分階段添加 NaCl，至培養(yǎng)基最終含鹽量為12%(w/v)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種分批補(bǔ)鹽提高乳酸菌耐鹽能力的方法，其特征在于:所述乳 酸菌為嗜鹽四聯(lián)球菌（reiragaoococcus Aa_/〇j〇Ai_/t/s)，保藏編號(hào)為CGMCC no. 3792。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種分批補(bǔ)鹽提高乳酸菌耐鹽能力的方法，其特征在于:所述種 子培養(yǎng)基為:80 g/L胰蛋白胨，64 g/L大豆蛋白胨，5 g/L葡萄糖，0.5 g/L抗壞血酸，0.25 g/L MgS〇4.7H20，pH 7.0。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種分批補(bǔ)鹽提高乳酸菌耐鹽能力的方法，其特征在于:所述發(fā) 酵培養(yǎng)基為:80 g/L胰蛋白胨，64 g/L大豆蛋白胨，5 g/L葡萄糖，0.5 g/L抗壞血酸，0.25 g/L MgS〇4.7H20，pH 7.0。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種分批補(bǔ)鹽提高乳酸菌耐鹽能力的方法，其特征在于:所述分 批補(bǔ)鹽方式為在發(fā)酵第〇小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)分別補(bǔ)加6%(w/v)、3%和3%的NaCl，使培養(yǎng)基 最終含鹽量為12%(w/v)。
【文檔編號(hào)】C12N1/36GK105925521SQ201610545726
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年7月13日
【發(fā)明人】吳重德, 鄧靖程, 何桂強(qiáng), 黃鈞, 周榮清
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)