源于骨髓神經(jīng)嵴細(xì)胞的施旺氏祖細(xì)胞及其在促進(jìn)神經(jīng)再生中的應(yīng)用【專利摘要】本發(fā)明涉及組織工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種源于骨髓神經(jīng)嵴細(xì)胞的施旺氏祖細(xì)胞及其在促進(jìn)神經(jīng)再生中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞N1，保藏號(hào)為CCTCCNO：C201647，即BM?NCC克隆N1，具備施旺氏祖細(xì)胞(SCP)的性能。本發(fā)明還提供了BM?NCC克隆N1的傳代培養(yǎng)方法，以及向施旺氏細(xì)胞(SC)定向誘導(dǎo)分化的方法。本發(fā)明的BM?NCC克隆N1有望應(yīng)用于細(xì)胞為基礎(chǔ)的促神經(jīng)再生治療。CCTCCNO：C20164720160416【專利說(shuō)明】源于骨髓神經(jīng)嵴細(xì)胞的施旺氏祖細(xì)胞及其在促進(jìn)神經(jīng)再生中的應(yīng)用
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[0001]本發(fā)明涉及組織工程
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，具體涉及一種源于骨髓神經(jīng)嵴細(xì)胞的施旺氏祖細(xì)胞及其在促進(jìn)神經(jīng)再生中的應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]在神經(jīng)系統(tǒng)中，施旺氏細(xì)胞(Schwanncell，SC)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞，在軸突成髓鞘、周圍神經(jīng)元的組織化、神經(jīng)元正常功能的維持、突觸的形成以及對(duì)神經(jīng)損傷和神經(jīng)痛的反應(yīng)等方面起著關(guān)鍵的作用。在周圍神經(jīng)損傷后的WalIerian變性階段，SC去分化為未成熟SC或前體樣SC，參與髓磷脂和軸突碎片的清除，產(chǎn)生多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，增殖并迀移形成利于軸突再生長(zhǎng)的Bungner帶，最后又重新分化為成熟的成髓鞘SC支持軸突重新形成髓鞘。目前，基于SC的神經(jīng)組織工程具有很多應(yīng)用目標(biāo)，包括周圍神經(jīng)疾病或損傷的治療，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的治療潛能，以及SC相關(guān)疾病體外模型階段的治療。然而SC的來(lái)源和純度仍然限制著其在細(xì)胞治療方面的應(yīng)用。[0003]施旺氏祖細(xì)胞(Schwanncellprecursor，SCP)代表著施旺氏細(xì)胞的早期階段。在脊椎動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程中，SCP和未成熟的SC起源于迀移的神經(jīng)嵴細(xì)胞(neuralcrestcell，NCC)，到成體階段神經(jīng)嵴組織就消失了。將從胚胎周圍神經(jīng)富集的SCP和成熟的SC移植到CNS后，前者比后者具有更好的生存和迀移能力。SCP也可以分化為成髓鞘的中樞膠質(zhì)細(xì)胞修復(fù)大腦損傷。此外，在腸神經(jīng)系統(tǒng)的出生后神經(jīng)發(fā)生中還發(fā)現(xiàn)有SCP向神經(jīng)元的分化。[0004]目前，已經(jīng)有多種不同的外源性干細(xì)胞類型被用來(lái)衍生SC，包括胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞[MaMS,BoddekeE,CoprayS.PluripotentstemcellsforSchwanncellengineering.StemCellRev.2015；11:205-18.][Liff,HuangL,Linff,KeQ1ChenR,LaiXjetal.EngraftableneuralcreststemcelIsderivedfromcynomolgusmonkeyembryonicstemcells.B1materials.2015；39:75-84.][LiuQjSpustaSC,MiR，LassiterRNjStarkMRjHokeA,eta1.HumanneuralcreststemcellsderivedfromhumanESCsandinducedpluripotentstemcells:1nduct1n,maintenance,anddifferentiat1nintofunct1nalschwanncells.StemCellsTranslMed.2012；1:266-78.][RenYJ,ZhangSjMiRjLiuQjZengXjRaoM,etal.Enhanceddifferentiat1nofhumanneuralcreststemcellstowardstheSchwanncelllineagebyalignedelectrospunfibermatrix.ActaB1mater.2013；9:7727-36.][WangAjTangZjParkIHjZhuYjPatelSjDaleyGQ,etal.1nducedpluripotentstemcellsforneuraltissueengineering.B1materials.2011;32:5023_32.]，均顯不出它們對(duì)受損神經(jīng)元的修復(fù)作用。事實(shí)上，成體干細(xì)胞在體外具有多系分化潛能，而且它們能從自體獲得，可避免免疫排斥作用和倫理問(wèn)題的困擾，因此成體干細(xì)胞看來(lái)是更具前景的可替代SC來(lái)源的細(xì)胞類型，包括間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell，MSC)和迀移后NCC[NeirinckxV,CosteCjRogisterB,Wislet-GendebienS.Concisereview:adultmesenchymalstemcells,adultneuralcreststemcells,andtherapyofneurologicalpathologies:astateofplay.StemCellsTranslMed.2013；2:284-96.]o[0005]已有報(bào)道，迀移后NCC和衍生的SC可從背根神經(jīng)節(jié)(DRG)獲得[NagoshiNjShibataS,KubotaY,NakamuraMjNagaiY,SatohE，etal.0ntogenyandmultipotencyofneuralcrest-derivedstemcellsinmousebonemarrow,dorsalrootganglia,andwhiskerpad.CellStemCell.2008;2:392-403][LiHY,SayEHjZhouXF.1solat1nandcharacterizat1nofneuralcrestprogenitorsfromadultdorsalrootganglia.StemCells.2007；25:2053-65.][VidalMjManiglierMjDebouxCjBachelinC，ZujovicVjBaron-VanEvercoorenA.AdultDRGStem/ProgenitorCellsGeneratePericytesinthePresenceofCentralNervousSystem(CNS)DevelopmentalCues,andSchwannCellsinResponsetoCNSDemyelinat1n.StemCells.2015；33:2011-24.][ZujovicV,ThibaudJ,BachelinC,VidalM,CoulpierF,CharnayP,etal.BoundarycapcellsarehighlycompetitiveforCNSremyelinat1n:fastmigrat1nandefficientdifferentiat1ninPNSandCNSmyelin-formingcells.StemCells.2010;28:470-9.]，還可從受損的或完好的周圍神經(jīng)富集培養(yǎng)出多潛能的Schwann細(xì)胞球[TakagiTjIshiiK,ShibataS,YasudaA,SatoMjNagoshiN,etal.Schwann-spheresderivedfrominjuredperipheralnervesinadultmice—theirinvitrocharacterizat1nandtherapeuticpotential.PLoSOne.2011；6:e21497.][MartinI,NguyenTD,KrelIVjGreinerJF,MulIerJ,HauserS,etal.Generat1nofSchwanncell-derivedmultipotentneurospheresisolatedfromintactsciaticnerve.StemCellRev.2012;8:1178-87.]，具有著NCC的身份和向SC定向分化的潛能，這些Schwann細(xì)胞球可為神經(jīng)再生提供自體細(xì)胞來(lái)源，但相應(yīng)的活檢手段對(duì)供體神經(jīng)所導(dǎo)致的損傷，事實(shí)上對(duì)于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)來(lái)說(shuō)是不現(xiàn)實(shí)的。所以，學(xué)者們旨在尋找到可獲取成體NCC和衍生SC的非神經(jīng)組織來(lái)源。有最新報(bào)道[Mendez-Fe^erSjMichurinaTVjFerraroF,MazloomAR,MacarthurBDjLiraSA，etal.Mesenchymalandhaematopoieticstemcellsformauniquebonemarrowniche.Nature.2010；466:829-34.][IsernJ,Martin-Anton1BjGhazanfariRjMartinAMjLopezJA，delToroR，etal.Self-renewinghumanbonemarrowmesenspherespromotehematopoieticstemcellexpans1n.CellRep.2013;3:1714-24.][IsernJjGarcia-GarciaAjMartinAM，ArranzL,Martin-PerezD,TorrojaC,etal.Theneuralcrestisasourceofmesenchymalstemcellswithspecializedhematopoieticstemcellnichefunct1n.Elife.2014;3:e03696.]，發(fā)現(xiàn)Nestin陽(yáng)性的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bonemarrowstromalcell，BMSC)與神經(jīng)嵴來(lái)源的SCP具有共同的神經(jīng)-上皮發(fā)育起源，而且這兩種細(xì)胞可能同時(shí)居留在長(zhǎng)骨骨髓，共同建立了造血干細(xì)胞的微環(huán)境；體外培養(yǎng)時(shí)，這些Nestin陽(yáng)性，血小板源生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)陰性的BMSC可形成具有自我更新能力和多分化潛能的細(xì)胞球，而且這些間充質(zhì)球(Mesensphere)中包含有神經(jīng)嵴干細(xì)胞(neuralcreststemcell，NCSC)和神經(jīng)嵴祖細(xì)胞(neuralcrestprecursor，NCP)，并由此進(jìn)一步推斷骨髓中有著SCP細(xì)胞群的居留。[0006]盡管BMSC是眾所周知的高異質(zhì)性細(xì)胞群，本發(fā)明人所在的課題組前期研究工作已表明[ShiH,ZhangT1QiangL,ManL,ShenY,DingF.Mesenspheresofneuralcrest-derivedcellsenrichedfrombonemarrowstromalcellsubpopulat1n.NeurosciLett.2013;532:70-5.],通過(guò)條件培養(yǎng)，可以從骨髓中應(yīng)答表皮生長(zhǎng)因子/成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的BMSC(EGF/FGF2-responsiveBMSC，E/Fr_BMSC)亞群募集到懸浮生長(zhǎng)的間充質(zhì)細(xì)胞球(Mesensphere)，即居留于骨髓的迀移后NCC，關(guān)鍵在于，骨髓源神經(jīng)嵴細(xì)胞(bonemarrowderivedneuralcrestcell，BM_NCC)具有自我更新能力和定向分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的潛能?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種BM-NCC克隆NI，以及BM-NCC克隆NI的傳代培養(yǎng)方法、向SC誘導(dǎo)分化的方法，以及BM-NCC克隆NI在制備促進(jìn)神經(jīng)再生藥物中的應(yīng)用。[0008]本發(fā)明旨在探究如何從BM-NCC衍生SCP。于是，我們?cè)讷@得大鼠BM-NCC后，分離出多個(gè)可以凍存和復(fù)蘇的細(xì)胞克隆，然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明BM-NCC克隆可被誘導(dǎo)分化為SlOOi^H性的SC，而其中的NI克隆的細(xì)胞所衍生的SC純度高于其它細(xì)胞克隆，無(wú)須基因調(diào)控或進(jìn)一步純化，NI細(xì)胞衍生的SC還具有體外成髓鞘潛能。[0009]檢測(cè)結(jié)果還表明，在蛋白水平和mRNA水平，NCC標(biāo)志在NI細(xì)胞高表達(dá)，而在衍生的SC表達(dá)下調(diào);在衍生的SC，與SC分化狀態(tài)有關(guān)的SC標(biāo)志則上調(diào)。我們進(jìn)一步用NI細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(Nl-CM)，即細(xì)胞培養(yǎng)液上清處理氧糖剝奪(O⑶)損傷后的DRG神經(jīng)元，神經(jīng)元的存活和軸突的生長(zhǎng)均得到改善;另外，我們將NI細(xì)胞注射入擠壓損傷后的大鼠坐骨神經(jīng)，結(jié)果顯示NI細(xì)胞比NI細(xì)胞衍生的SC(NlderivedSchwanncell，Nl-d_SC)具有更好的促神經(jīng)再生和功能修復(fù)作用，表明NI細(xì)胞在體內(nèi)外均可促進(jìn)受損神經(jīng)元的修復(fù)。本發(fā)明表明NI細(xì)胞可被認(rèn)定為SCP身份(或未分化的SCP樣狀態(tài))，源于BM-NCC的SCP有望將來(lái)應(yīng)用于細(xì)胞為基礎(chǔ)的促神經(jīng)再生治療。[0010]本發(fā)明的第一方面，提供了一種大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞NI，保藏號(hào)為CCTCCNO:C201647。[0011]本發(fā)明所述的大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞NI，即BM-NCC克隆NI，具備施旺氏祖細(xì)胞(SCP)的性能。[0012]本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:N1克隆相比于同時(shí)獲得的其它BM-NCC克隆(如N3、N4和N13)，具有最強(qiáng)的向SC分化的潛能，定向誘導(dǎo)分化后S100即日性的SC比率達(dá)到95%以上，不需要后續(xù)的細(xì)胞分選步驟；同時(shí)，顯示具有膠質(zhì)細(xì)胞分化潛能的NCC標(biāo)志CD44、HES1和S0X10，其mRNA表達(dá)水平在NI克隆高于其它的BM-NCC克隆(如N4);而顯示具有神經(jīng)元分化潛能的NCC標(biāo)志W(wǎng)NTl、ID2、p75NTR和CXCR4，其mRNA表達(dá)水平在NI克隆則低于其它的BM-NCC克隆(如N4)。[0013]本發(fā)明的第二方面，還提供了BM-NCC克隆NI的傳代培養(yǎng)方法。[0014]所述的傳代培養(yǎng)方法，是將保藏號(hào)為CCTCCN0:C201647的細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)至大多數(shù)細(xì)胞球增大而球中心細(xì)胞開始發(fā)暗時(shí)，用accutase酶將細(xì)胞球消化為單細(xì)胞懸液，然后細(xì)胞按<14個(gè)/ml的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)板，進(jìn)行成球傳代培養(yǎng)，每周半量換液2次;每7?14d傳代I次，或根據(jù)需要傳代。[0015]本發(fā)明的第三方面，還提供了BM-NCC克隆NI向施旺氏細(xì)胞(SC)定向誘導(dǎo)分化的方法。[0016]所述的定向誘導(dǎo)分化方法，是將保藏號(hào)為CCTCCN0:C201647的細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分離為單個(gè)細(xì)胞，并接種到層黏連蛋白/多聚賴氨酸(laminin/PLL)包被的培養(yǎng)板上，用SC定向誘導(dǎo)分化液孵育培養(yǎng)，即含5%胎牛血清(FBS)、35ng/ml全反式視黃酸(tRA)、5yMforskolin、200ng/mlHRG-Ιβ、10ng/mlFGF2、10ng/mlPDGF-AA和I%N2的DMEM/F12(v/v，l:1)培養(yǎng)液，每2?3d換液I次。[0017]本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單高效的方法，此誘導(dǎo)分化方案對(duì)BM-NCC克隆在2d內(nèi)即開始起效，最長(zhǎng)不超過(guò)I周。[0018]本發(fā)明的第四方面，還提供了BM-NCC克隆NI在制備促進(jìn)神經(jīng)再生藥物中的應(yīng)用。[0019]所述的應(yīng)用具體為細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療，本發(fā)明的BM-NCC克隆NI為促進(jìn)受損神經(jīng)再生的研究提供了無(wú)限的細(xì)胞來(lái)源。[0020]所述的細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療采用方式可以為局部注射入受損組織、靜脈注射或用于制備組織工程神經(jīng)移植物行局部植入等。[0021]所述的藥物可以為細(xì)胞懸液、細(xì)胞的條件培養(yǎng)基、細(xì)胞分泌的因子、細(xì)胞分泌的囊泡(外泌體等)或細(xì)胞分泌的囊泡(外泌體等)提取物等。[0022]本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:[0023]我們培養(yǎng)了BM-NCC和分離獲取了BM-NCC單細(xì)胞克隆，檢測(cè)了它們的NCC標(biāo)志的表達(dá)和自我更新能力。根據(jù)各個(gè)BM-NCC克隆向SC分化的效率，我們選擇了NI克隆作為進(jìn)一步研究的細(xì)胞亞群。NI細(xì)胞與胚胎DRG神經(jīng)元共培養(yǎng)，以檢測(cè)NI細(xì)胞的成髓鞘潛能，結(jié)果表明NI細(xì)胞可衍生SC并在體外促進(jìn)軸突的成髓鞘。Nl-CM用來(lái)處理O⑶損傷的DRG神經(jīng)元，結(jié)果表明可改善DRG神經(jīng)元的存活和軸突生長(zhǎng)狀況。此外，NI細(xì)胞或Nl-d-SC分別被移植入夾傷的大鼠坐骨神經(jīng)，結(jié)果表明可促進(jìn)坐骨神經(jīng)的再生和功能的恢復(fù)。[0024]已有研究者分析了來(lái)源于成年小鼠骨髓的MSC和NCC的相似與差別。還有研究者通過(guò)Wntl和BMP2的作用，從成人BMSC富集到NCC單細(xì)胞克隆，盡管實(shí)驗(yàn)表明Nestin/SOXlO/P75NTR陽(yáng)性的骨髓細(xì)胞，可能是具有向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化潛能的NCC，但是從不同的克隆分化的細(xì)胞中GFAP或Tujl陽(yáng)性細(xì)胞的百分比各不相同，一些克隆傾向于衍生膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽(yáng)性細(xì)胞)，而另一些克隆傾向于衍生神經(jīng)元細(xì)胞(Tujl陽(yáng)性細(xì)胞)。與此類似，本發(fā)明中我們分離獲取了多個(gè)BM-NCC單細(xì)胞克隆，并且發(fā)現(xiàn)4個(gè)克隆的細(xì)胞分化為SC的比率各不相同。結(jié)果表明NI克隆具有最強(qiáng)的向SC分化的能力，顯示SC分化潛能的NCC標(biāo)志⑶44、HES1和S0X10的mRNA表達(dá)水平在NI高于其它的BM-NCC克隆(如N4)，而顯示神經(jīng)元分化潛能的NCC標(biāo)志W(wǎng)NTl、ID2、p75NTR和CXCR4的mRNA表達(dá)水平在NI則低于其它的BM-NCC克隆(如N4)。[0025]為誘導(dǎo)NI細(xì)胞向SC分化，運(yùn)用了laminin/PLL基質(zhì)表面和明確的一組細(xì)胞因子。分化過(guò)程中，我們并未觀察到之前有文獻(xiàn)報(bào)道的短暫呈現(xiàn)的扁平上皮樣細(xì)胞形態(tài)[LobsigerCS,SmithPMjBuchstallerJjSchweitzerBjFranklinRJjSuterU,etal.SpL201:acondit1nalIyimmortalizedSchwanncellprecursorlinethatgeneratesmyelin.Glia.2001;36:31-47.][XuYjX1ngF,LiuL,ZhangC.RatbonemarrowstromalcellscouldbeinducedintoSchwanncellprecursor-likecellsinvitr0.NeurosciLett.2011；488:229-33.]這種形態(tài)的差異可能是由于不同的誘導(dǎo)條件和不同的細(xì)胞來(lái)源。相比之下，本發(fā)明中的NI細(xì)胞在向SC誘導(dǎo)分化過(guò)程中，Oh、12h、24h和48h分別檢測(cè)的基因表達(dá)模式與已有的文獻(xiàn)報(bào)道是基本一致的[ZieglerL,GrigoryanS，YangIHjThakorNVjGoldsteinRS.Efficientgenerat1nofschwanncellsfromhumanembryonicstemcell-derivedneurospheres.StemCellRev.2011；7:394-403.][LiuZjJinYQjChenLjWangYjYangXjChengJjetal.Specificmarkerexpress1nandcellstateofSchwanncellsduringcultureinvitr0.PLoSOne.2015；10:e0123278.][FinzschM,SchreinerS,KichkoT,ReehP,TammERjBoslMR,etal.SoxlOisrequiredforSchwanncellidentityandprogress1nbeyondtheimmatureSchwanncellstage.JCellB1l.2010;189:701-12.]。非常有趣的是，1?黏連蛋白19(Cadherin19)作為SCP特有的細(xì)胞標(biāo)志，隨著NI細(xì)胞向SC的分化呈現(xiàn)倒U形變化，在誘導(dǎo)12h明顯高于Oh，卻在誘導(dǎo)24h和48h明顯低于Olu這些時(shí)間依賴的變化好比模擬了NCC向成熟SC分化的動(dòng)態(tài)過(guò)程[JessenKRjMirskyRjLloydAC.SchwannCells!DevelopmentandRoleinNerveRepair.ColdSpringHarbPerspectB1l.2015;7:a020487.][ffoodhooAjSommerL.DevelopmentoftheSchwanncelllineage:fromtheneuralcresttothemyelinatednerve.Glia.2008;56:1481-90.][TakahashiM,OsumiN.1dentificat1nofanoveltype11classicalcadherin:ratcadherinl9isexpressedinthecranialgangliaandSchwanncellprecursorsduringdevelopment.DevDyn.2005;232:200-8.]，結(jié)果表明NI細(xì)胞的SCP特征可能逐步削弱，而Nl-d-SC可能隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐步由未成熟狀態(tài)向成熟狀態(tài)過(guò)渡。[0026]已有的研究報(bào)道，應(yīng)用Laminin/PLL基質(zhì)和HRG10誘導(dǎo)皮膚祖細(xì)胞(skinprecursor?SKP)向SC分化后，接著再運(yùn)用不同的手段純化SC，可以用一種圓柱筒(cylinder)選擇SC集落，進(jìn)行消化并收集細(xì)胞后傳代培養(yǎng)[BiernaskieJAjMcKenzieIA，TomaJG,Mi11erFD.1solat1nofskin-derivedprecursors(SKPs)anddifferentiat1nandenrichmentoftheirSchwanncellprogeny.NatProtoc.2006；1:2803-12.]，也可以進(jìn)行p75NTR免疫熒光染色為基礎(chǔ)的流式活細(xì)胞分選[KhuongHT，KumarR,SenjayaF,GrochmalJ,IvanovicA,ShakhbazauA，etal.SkinderivedprecursorSchwanncellsimprovebehav1ralrecoveryforacuteanddelayednerverepair.ExpNeurol.2014;254:168-79.]。相比之下，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單高效的方法，運(yùn)用此方法，本發(fā)明中的4個(gè)克隆亞群可有40%到95%的細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為SC，其中NI克隆有95%之多，誘導(dǎo)NI細(xì)胞分化為SC后不需要后續(xù)的細(xì)胞分選步驟。許多已有的研究報(bào)道成體干細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化為SC，比如從骨髓[CaddickJjKinghamPJjGardinerNJjffibergMjTerenghiG.Phenotypicandfunct1nalcharacteristicsofmesenchymalstemcellsdifferentiatedalongaSchwanncellIineage.Glia.2006；54:840-9.][ParkHffjLimMJjJungHjLeeSPjPaikKSjChangMS.Humanmesenchymalstemcell-derivedSchwanncell-likecellsexhibitneurotrophiceffects,viadistinctgrowthfactorproduct1n，inamodelofspinalcordinjury.Glia.2010；58:1118-32.]或臍帶血[PengJjWangYjZhangLjZhaoBjZhaoZjChenJ,eta1.HumanumbilicalcordWharton’sjelly-derivedmesenchymalstemcellsdifferentiateintoaSchwann-cellphenotypeandpromoteneuriteoutgrowthinvitr0.BrainResBull.2011;84:235-43.][LeeJHjChungWHjKangEHjChungDJjChoiCBjChangHS，eta1.Schwanncel1-1ikeremyelinat1nfollowingtransplantat1nofhumanumbilicalcordblood(hUCB)-derivedmesenchymalstemcellsindogswithacutespinalcordinjury.JNeurolSci.2011;300:86-96.]來(lái)源的MSC[PanYjCaiS.CurrentstateofthedevelopmentofmesenchymalstemcellsintoclinicallyapplicableSchwanncelltransplants.MolCellB1chem.2012;368:127-35.]，脂肪來(lái)源的干細(xì)胞[KinghamPJjKalbermattenDFjMahayDjArmstrongSJjWibergMjTerenghiG.Adipose-derivedstemcellsdifferentiateintoaSchwanncellphenotypeandpromoteneuriteoutgrowthinvitr0.ExpNeurol.2007；207:267-74.][KaewkhawRjScuttAM，HaycockJff.Anatomicalsiteinfluencesthedifferentiat1nofadipose-derivedstemcellsforSchwann-cellphenotypeandfunct1n.Glia.2011；59:734-49.]的NCSC[Sieber_BlumMjGrimMjHuYF,SzederV.Pluripotentneuralcreststemcellsintheadulthairfollicle.DevDyn.2004;231:258-69.]和牙髓NCSC[Al_ZerHjApelCjHeilandMjFriedrichRE，JungOjKroegerN，etal.EnrichmentandSchwannCellDifferentiat1nofNeuralCrest-derivedDentalPulpStemCelIs.1nViv0.2015;29:319-26.]等，然而這些研究中分化為SC的比率僅低于40%或者未報(bào)道分化率。本方案不僅可獲取更多的SC，分化速度也比已有文獻(xiàn)報(bào)道的(>1周)快，獲得如此高效的分化可能歸因于衍生的SC是源于NCP克隆而不是NCSC或MSC。特別一提的是，具有SCP的特征NI克隆將有利于建立一個(gè)體外的SC分化體系，并且，此體系包括未成熟SC向成髓鞘SC的分化。[0027]成髓鞘是SC功能成熟的標(biāo)志，成髓鞘的SC不同于其它SC亞型，比如未成熟SC和非成髓鞘SC。本發(fā)明中，NI細(xì)胞和DRG神經(jīng)元共培養(yǎng)體系中形成了成髓鞘SC，并且，MBP和MG陽(yáng)性的髓鞘結(jié)構(gòu)證實(shí)其具有典型的SC功能。結(jié)果表明，SCP定向分化為的成髓鞘SC，除了需要旁分泌信號(hào)以外還需要可溶性因子，而與軸突的親密接觸也是有幫助的[JosephNMjMukouyamaYSjMosherJT,JaegleMjCroneSAjDormandEL，etal.Neuralcreststemcellsundergomultilineagedifferentiat1nindevelopingperipheralnervestogenerateendoneurialfibroblastsinaddit1ntoSchwanncells.Development.2004；131:5599-612.]。[0028]本發(fā)明中所選擇的永生的BM-NCC克隆NI，具有SCP的身份特征，能夠反復(fù)凍存和復(fù)蘇，因此可為細(xì)胞治療提供一個(gè)無(wú)限的細(xì)胞來(lái)源，尤其能促進(jìn)神經(jīng)的再生。此外，這些克隆細(xì)胞還可避免原代細(xì)胞制備中不同批次之間細(xì)胞差異的不良影響。已有學(xué)者報(bào)道從大鼠胚胎坐骨神經(jīng)取出SC，然后運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼的EGFR/neu融合蛋白建立了一個(gè)條件依賴的永生的SCP細(xì)胞系(SpL201)[LobsigerCS,SmithPMjBuchstallerJ,SchweitzerB，F(xiàn)ranklinRJjSuterU,etal.SpL201:acondit1nallyimmortalizedSchwanncellprecursorlinethatgeneratesmyelin.Glia.2001;36:31-47.]。本發(fā)明從成年大鼠遷移后BM-NCC分離獲取了BM-NCC克隆細(xì)胞系，克服了倫理問(wèn)題，且避免了神經(jīng)損傷和基因改造，也不需像SpL201那樣依賴環(huán)境中的EGF才能得以存活。另外，還有學(xué)者應(yīng)用不同的調(diào)控因子，從小鼠表皮建立了永生的出生后NCSC細(xì)胞系[SviderskayaEVjEastyDJjLawrenceMA,SanchezDPjNegulyaevYAjPatelRH，etal.Funct1nalneuronsandmelanocytesinducedfromimmortallinesofpostnatalneuralcrest-likestemcells.FASEBJ.2009；23:3179-92.]，但是需要調(diào)控Wnt、shh和TGF0信號(hào)通路，表皮NCSC可作為SC的一種細(xì)胞來(lái)源[SakaueM,Sieber-BlumM.HumanepidermalneuralcreststemcellsasasourceofSchwanncells.Development.2015;142:3188-97.]。相比之下，本發(fā)明第一次報(bào)道從成年大鼠骨髓可獲取并建立永生的NCC系，并且此NCC系能夠作為生物學(xué)相關(guān)的細(xì)胞來(lái)源提供SCP和進(jìn)一步衍生SC。[0029]本發(fā)明中，N1_CM在體外可修復(fù)O⑶損傷的DRG神經(jīng)元，體內(nèi)移植NI可修復(fù)坐骨神經(jīng)夾傷，表明NI可發(fā)揮細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療作用。Nl-CM中所含有的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在細(xì)胞培養(yǎng)中促進(jìn)了O⑶損傷的DRG神經(jīng)元的存活和軸突的生長(zhǎng)，而NI細(xì)胞注射入夾傷的大鼠坐骨神經(jīng)后，所起的修復(fù)作用優(yōu)于Nl-d-SC。為了更好地應(yīng)用細(xì)胞移植治療神經(jīng)損傷，注射的細(xì)胞在體內(nèi)的存活情況是需要考慮的一個(gè)重要方面，另外也需要考慮注射前細(xì)胞的分化狀態(tài)，從而與周圍組織共建良好的再生微環(huán)境[WalshS,MidhaR.Practicalconsiderat1nsconcerningtheuseofstemcellsforperipheralnerverepair.NeurosurgFocus.2009;26:E2.]。[0030]本發(fā)明的BM-NCC克隆NI有望應(yīng)用于細(xì)胞為基礎(chǔ)的促神經(jīng)再生治療。【附圖說(shuō)明】[0031]圖1是BMSC和衍生的Mesensphere的形態(tài)圖(A)與免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖(B)。[0032]圖2是E/Fr-BMSC和衍生的Mesensphere的流式細(xì)胞儀(FCM)分析圖。[0033]圖3是BM-NCC單細(xì)胞克隆形態(tài)圖(A)和增殖曲線(B)及生長(zhǎng)曲線圖(C)。[0034]圖4是MSC和NCC標(biāo)志在N1、N4和E/Fr-BMSC的mRNA表達(dá)水平:表達(dá)水平在NI和N4高于E/Fr-BMSC的NCC標(biāo)志(A)，表達(dá)水平在NI和N4低于E/Fr-BMSC的MSC標(biāo)志(B)，表達(dá)水平在N1、N4和E/Fr-BMSC無(wú)明顯差異的標(biāo)志(C)。[0035]圖5是BM-NCC克隆向SC的分化:BM-NCC克隆NI向SC分化12h和48h的形態(tài)圖(A和B)，各BM-NCC克隆衍生SC(S100即日性)的比率比較(C)，BM-NCC克隆NI衍生的SC的免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖(D)。[0036]圖6是SC和NCC標(biāo)志在NI衍生SC誘導(dǎo)分化Oh、12h、24h和48h的mRNA表達(dá)水平:SC標(biāo)志的表達(dá)變化(A)，NCC標(biāo)志的表達(dá)變化(B)，SCP標(biāo)志的表達(dá)變化(C)，SC和NCC共有標(biāo)志的表達(dá)變化(D)。[0037]圖7是NI細(xì)胞與DRG神經(jīng)元體外共培養(yǎng)成髓鞘的檢測(cè)圖:共培養(yǎng)0(1、1(1、14(1和21(1的形態(tài)圖和免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖(A)，共培養(yǎng)28d的髓鞘形態(tài)圖(B)，共培養(yǎng)28d的髓鞘免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖(C)，成髓鞘標(biāo)志在共培養(yǎng)7d與28d的mRNA表達(dá)水平(D)。[0038]圖8是Nl-CM體外修復(fù)O⑶損傷的DRG神經(jīng)元CTubulinIII免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖。[0039]圖9是細(xì)胞注射修復(fù)夾傷的大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)與功能檢測(cè)圖:細(xì)胞注射后3周內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的各實(shí)驗(yàn)組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)比較(A)，細(xì)胞注射3周后各實(shí)驗(yàn)組復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(CMAP)波幅比較(B)，細(xì)胞注射3周后各實(shí)驗(yàn)組再生神經(jīng)的免疫組織化學(xué)染色圖(C)。[0040]保藏信息:本發(fā)明的細(xì)胞系，命名為大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞NI，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，地址:中國(guó)武漢大學(xué)，保藏日期2016年4月16日，保藏編號(hào)CCTCCN0:C201647o[0041]在CCTCC保藏的大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞NI為第50和51代細(xì)胞?！揪唧w實(shí)施方式】[0042]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但下列實(shí)施例不應(yīng)看作對(duì)本發(fā)明范圍的限制。[0043]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。[0044]實(shí)施例1.骨髓神經(jīng)嵴細(xì)胞(BM-NCC)的培養(yǎng)和鑒定[0045]BM-NCC的培養(yǎng)，應(yīng)用以下重復(fù)的兩步條件培養(yǎng)程序來(lái)培養(yǎng)獲得BM-NCC:[0046]第一步，成體Wistar大鼠(8周齡)被處死后，立即從脛骨和股骨沖洗出骨髓，將骨髓細(xì)胞接種培養(yǎng)于含10%FBS的頂DM培養(yǎng)液，利用BMSC貼附塑料培養(yǎng)皿生長(zhǎng)的特性，反復(fù)換液去除漂浮的造血干細(xì)胞，分離培養(yǎng)出原代大鼠BMSC;[0047]第二步，用含有20ng/mlEGF，20ng/mlFGF2，I%N2(v/v)，2%B27(v/v))，2mM谷氨酰胺，lOOU/ml青霉素，0.lmg/ml鏈霉素的DMEM/F12(v/v，1:1)成球培養(yǎng)液，對(duì)原代BMSC進(jìn)行成球培養(yǎng)，接種細(xì)胞密度為2?3X15個(gè)/ml，形成原代細(xì)胞球(Sphere)。成球培養(yǎng)液也就是NCC的培養(yǎng)液。[0048]接著，重復(fù)第一步，即收集懸浮的原代細(xì)胞球再次接種培養(yǎng)于含10%FBS的頂DM培養(yǎng)液，利用BMSC貼附塑料培養(yǎng)皿生長(zhǎng)的特性，獲得E/Fr-BMSC；[0049]重復(fù)第二步，用DMEM/F12成球培養(yǎng)液，對(duì)E/Fr-BMSC亞群進(jìn)行成球培養(yǎng)，形成的細(xì)胞球也稱為間充質(zhì)細(xì)胞球(Mesensphere)。[0050]以上培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞或細(xì)胞球用相差顯微鏡觀察并采集圖片；用免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)染色方法檢測(cè)MSC和NCC標(biāo)志蛋白；用流式細(xì)胞儀(FCM)分析細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)。[0051]原代BMSC和E/Fr-BMSC顯示貼壁生長(zhǎng)的成纖維樣細(xì)胞形態(tài);BMSC衍生的Sphere和E/Fr-BMSC衍生的Mesensphere懸浮成球生長(zhǎng)(圖1A)。[0052]分離獲取Mesensphere的過(guò)程:(I)從原代BMSC(al)分離原代BMSC細(xì)胞球(a2)；(2)從原代BMSC細(xì)胞球(a2)衍生E/Fr-BMSC(a3)；(3)從E/Fr_BMSC(a3)分離Mesensphere(a4)。ICC染色結(jié)果顯示E/Fr-BMSC表達(dá)MSC標(biāo)志蛋白CD90，而Mesensphere表達(dá)NCC標(biāo)志蛋白CD29、CD133和p75NTR。E/Fr-BMSC和Mesensphere均表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin和Nestin(圖1B)。[0053]FCM分析結(jié)果顯示，E/Fr-BMSC高表達(dá)MSC標(biāo)志蛋白CD90和CD73，而Mesensphere高表達(dá)NCC標(biāo)志蛋白CDISSJ/Fr-BMSC和Mesensphere均高表達(dá)CD44、CD29和Nestin(圖2)。[0054]實(shí)施例2.BM-NCC克隆的分離與增殖及細(xì)胞標(biāo)志檢測(cè)[0055]應(yīng)用有限稀釋法培養(yǎng)獲取BM-NCC克隆[GlejzerA,LaudetE,LeprinceP,HennuyB,PouletC,ShakhovaO,etal.WntlandBMP2:twofactorsrecruitingmultipotentneuralcrestprogenitorsisolatedfromadultbonemarrow.CelIMolLifeSc1.2011;68:2101-14.]。細(xì)胞球傳代培養(yǎng)到第4代以上后，用accutase酶將細(xì)胞球消化為單個(gè)細(xì)胞懸液，將細(xì)胞按0.7個(gè)/孔的密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行單細(xì)胞成球培養(yǎng)(每孔細(xì)胞數(shù)隨機(jī)為O個(gè)、I個(gè)或2個(gè)等)，每周半量換液2次。顯微鏡觀察每孔細(xì)胞，當(dāng)單個(gè)細(xì)胞增殖形成的單個(gè)細(xì)胞球所含有的細(xì)胞數(shù)達(dá)到100個(gè)以上時(shí)，就用accutase酶將這個(gè)細(xì)胞球消化為單細(xì)胞懸液，再繼續(xù)進(jìn)行傳代的成球培養(yǎng)。單細(xì)胞懸液以<5X14個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種，每7?14d傳代I次，或根據(jù)需要傳代。[0056]所得到的細(xì)胞克隆亞群常規(guī)傳代，其中的細(xì)胞克隆N1、N3、N4和N13長(zhǎng)期增殖，為繪制上述4個(gè)細(xì)胞克隆的長(zhǎng)期增殖曲線，每一個(gè)細(xì)胞克隆在每一代(P)的累計(jì)細(xì)胞總數(shù)用以下公式計(jì)算獲得:Cn=Cn—1XT1VSn,Cn=第η代累計(jì)細(xì)胞總數(shù)，C"—1=第η-l代累計(jì)細(xì)胞總數(shù)，Tn=第η代累計(jì)細(xì)胞總數(shù)，Sn=第η代接種細(xì)胞數(shù)。[0057]為檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)速度，傳代至Ρ31、Ρ32和Ρ33的NI和Ν4克隆細(xì)胞被分別接種在6孔培養(yǎng)板的2ml培養(yǎng)液中，接種密度為IX14個(gè)/ml。培養(yǎng)時(shí)間每隔24h，收集細(xì)胞I次并計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，共培養(yǎng)10d，用10個(gè)時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)的平均細(xì)胞數(shù)繪制出生長(zhǎng)曲線。[0058]結(jié)果顯示，獲得4個(gè)長(zhǎng)期增殖的BM-NCC單細(xì)胞克隆亞群N1、N3、N4和N13(圖3A)，并在體外連續(xù)傳代至少8代，NI和N4傳代超過(guò)37代達(dá)16個(gè)月以上(圖3B)。此外，P31、P32及P33代的NI和N4細(xì)胞的1d生長(zhǎng)曲線(圖3C)表明單細(xì)胞克隆NI和N4在傳代到30代以上還仍然保持很好的自我更新能力。[0059]定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)結(jié)果顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異:NCC標(biāo)志在NI和N4的mRNA表達(dá)水平均明顯高于在E/Fr-BMSCs的mRNA表達(dá)水平，包括Nestin、Musashil、CD133、TFAP2a、HNKl、0)49(1、'^1'1、102475見1?丄044、冊(cè)51和50)(10(圖44);然而，]\^(:標(biāo)志在附和財(cái)?shù)?111?嫩表達(dá)水平均明顯低于在E/Fr-BMSC的mRNA表達(dá)水平，包括CD90、CD73、Vimentin、N_Cadherin和CXCR4(圖4B)。此外，CD29、S0X2和Snail在NI或N4的mRNA表達(dá)水平均類似于在E/Fr-BMSCs的mRNA表達(dá)水平(圖4C)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了NI和N4細(xì)胞克隆保持了BM-NCC身份。[0060]實(shí)施例3.BM-NCC向施旺氏細(xì)胞(SC)的定向誘導(dǎo)分化[0061]應(yīng)用特定分化液誘導(dǎo)BM-NCC單克隆細(xì)胞(N1、N3、N4和N13)向SC分化。[0062]分離獲得的各細(xì)胞克隆在P5?P7代時(shí)被分離為單個(gè)細(xì)胞，并接種到PLL/laminin包被的小圓玻片上，用含5%FBS、35ng/mltRA、5yMforskolin、200ng/mlHRG-Ιβ、10ng/mlFGF2、IOng/mlPDGF-AA和I%N2的DMEM/F12(v/v，1:1)培養(yǎng)液(即SC定向誘導(dǎo)分化液)孵育培養(yǎng)，每3d換液I次。[0063]NI細(xì)胞在誘導(dǎo)分化12h后，貼壁的細(xì)胞開始伸長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)從圓形變?yōu)榧忓N形(圖5A);48h后，紡錘形細(xì)胞呈現(xiàn)肩并肩樣排列(圖5B);60h后，細(xì)胞逐漸衰老和死亡。選擇誘導(dǎo)48h的細(xì)胞進(jìn)行S100f3的ICC染色以證實(shí)BM-NCC單克隆細(xì)胞向SC的分化，并計(jì)數(shù)SlOO即日性表達(dá)的細(xì)胞百分比，比較N1、N3、N4和N13這4個(gè)BM-NCC單克隆的分化效率，結(jié)果顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，NI克隆定向分化為S100I3陽(yáng)性的SC的比率明顯高于其它3個(gè)BM-NCC克隆(圖5C)。此外，ICC染色結(jié)果還顯示SlOO即日性的Nl-d-SC共表達(dá)GFAP、CNPase和p75NTR(圖?)。[0064]qRT-PCR分析48h內(nèi)的不同誘導(dǎo)分化時(shí)間點(diǎn)(Oh、12h、24h和48h)，SC和NCC標(biāo)志在Nl-d-SC的mRNA表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異:SC標(biāo)志，包括S1OO0、GFAP、CNPase、04和ErbB3隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)水平逐漸增高(圖6A);而NCC標(biāo)志，包括⑶44、CD29、0)49(1、0乂0?4、'^1'1、他8乜11、]\11183811丨1、0)133、順1(1、5(?2、102和冊(cè)51，則隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)mRNA表達(dá)水平逐漸降低(圖6B);此外，SCP標(biāo)志Cadherinl9在誘導(dǎo)12h的mRNA表達(dá)水平比在Oh顯著增高，但在誘導(dǎo)24h和48h比在Oh明顯降低，值得注意的是，在誘導(dǎo)12h顯著高于在誘導(dǎo)24h和48h(圖6C)；另外，S0X10和p75NTR作為SC和NCC的共有標(biāo)志，p75NTR隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)mRNA表達(dá)水平逐漸增高，S0X10則是在誘導(dǎo)12h后mRNA表達(dá)水平即顯著增高且始終保持高水平至48h(圖6D)。[0065]實(shí)施例4.DRG神經(jīng)元的培養(yǎng)和DRG神經(jīng)元與NI細(xì)胞共培養(yǎng)形成髓鞘[0066](I)DRG神經(jīng)元的原代培養(yǎng)如已有文獻(xiàn)所述[SheaGK1TsuiAY1ChanYS，ShumDK.Bonemarrow-derivedSchwanncellsachievefatecommitment—aprerequisiteforremyelinat1ntherapy.ExpNeurol.2010；224:448-58.][GuY,ffangJ,DingF,HuN,ffangY,GuX.Neurotrophicact1nsofbonemarrowstromalcellsonprimarycultureofdorsalrootgangl1ntissuesandneurons.JMolNeurosc1.2010；40:332-41.]o[0067]從胚胎大鼠(胚胎14.5?15.5)或新生大鼠脊柱背部?jī)蓚?cè)椎孔處取到DRG，依次應(yīng)用3mg/ml膠原酶和0.25%胰酶分別消化30分鐘后，吸棄酶液，加入含5%FBS的DMEM培養(yǎng)液，輕輕機(jī)械吹打以獲得單細(xì)胞懸液，接著應(yīng)用差速貼壁法去除貼壁較快的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，再應(yīng)用含有抗有絲分裂藥物ΙΟμΜ氟脫氧尿苷和ΙΟμΜ尿苷的神經(jīng)元培養(yǎng)液處理，抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)以進(jìn)一步純化神經(jīng)元。細(xì)胞以5X14個(gè)/cm2的密度接種于PLL包被的培養(yǎng)皿，24孔板每孔約IX15個(gè)神經(jīng)元，神經(jīng)元培養(yǎng)液為含l%B27(v/v)、50ng/mlNGF和2mM的谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)液，每2?3d換液I次，至少培養(yǎng)7d。[0068]當(dāng)細(xì)胞形成致密的神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)時(shí)，胚胎大鼠DRG神經(jīng)元用于成髓鞘實(shí)驗(yàn)。出生后大鼠DRG神經(jīng)元用于神經(jīng)元損傷模型實(shí)驗(yàn)，見實(shí)施例5。[0069](2)DRG神經(jīng)元與NI細(xì)胞共培養(yǎng)形成髓鞘[0070]體外成髓鞘實(shí)驗(yàn)參照已有文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行[SheaGK1TsuiAY1ChanYS1ShumDK.Bonemarrow-derivedSchwanncellsachievefatecommitment—aprerequisiteforremyelinat1ntherapy.ExpNeurol.2010；224:448-58.]0[0071]用NCC培養(yǎng)液將NI細(xì)胞接種于PLL/laminin包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)6h后，換為SC定向分化液孵育12h，誘導(dǎo)后的NI細(xì)胞由圓形細(xì)胞分化為伸展的短梭形細(xì)胞，將NI細(xì)胞收集后接種到上述24孔板每孔的DRG神經(jīng)元神經(jīng)突形成的網(wǎng)絡(luò)中，每孔接種約5X14個(gè)NI細(xì)胞。共培養(yǎng)條件為:不含谷氨酰胺的DMEM/F12和Neurobasal培養(yǎng)基(1:1，v/v)，添加全部的SC誘導(dǎo)分化因子和全部的DRG神經(jīng)元生長(zhǎng)因子(見上文)，每2?3d半量換液I次。[0072]共培養(yǎng)I周后，可觀察到NI細(xì)胞衍生為長(zhǎng)梭形SC，并沿著神經(jīng)元的軸突排列，接著開始添加L-抗壞血酸(50yg/ml))和葡萄糖(4mg/ml)，撤除tRA、H)GF-AA、FGF2和HRG-Ιβ，以刺激軸突髓鞘的形成。共培養(yǎng)繼續(xù)維持3周，每2?3d換液I次。[0073]DRG神經(jīng)元與NI細(xì)胞按照上文所述的步驟共培養(yǎng)。Nl-d-SC與DRG神經(jīng)元保持接觸，逐漸呈現(xiàn)伸長(zhǎng)的雙極形態(tài)，在共培養(yǎng)14d和21d后，很多細(xì)胞開始形成DRG神經(jīng)元的髓鞘，21d時(shí)更加顯著(圖7A);共培養(yǎng)28d后，DRG神經(jīng)元軸突形成的髓鞘呈現(xiàn)竹節(jié)樣的形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖7B);ICC染色顯示髓鞘竹節(jié)樣結(jié)構(gòu)共表達(dá)成髓鞘標(biāo)志蛋白MBP和MAG(圖7C);qRT-PCR進(jìn)一步分析顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，冊(cè)？、]\^6、？0、？]\0322、？1^和&(?20在共培養(yǎng)28(1的1111?嫩表達(dá)水平明顯高于共培養(yǎng)7d時(shí)(圖7D)。[0074]實(shí)施例5.Nl-CM體外修復(fù)OGD損傷的DRG神經(jīng)元[0075]以Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NI細(xì)胞，不添加生長(zhǎng)因子，細(xì)胞密度為2X15個(gè)/ml，24h后收集培養(yǎng)基，S卩N1-CM，保存于-20°C。[0076]以無(wú)糖Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)純化的新生大鼠DRG神經(jīng)元，培養(yǎng)條件為37°C，5%CO2濃度和0.1%O2濃度，即O⑶損傷。8h后以Nl-CM換液處理，培養(yǎng)條件為37°C,5%CO2濃度和21%02濃度，培養(yǎng)24h，即OGD損傷后的Nl-CM修復(fù)處理。[0077]ICC染色檢測(cè)Nl-CM修復(fù)前后的OGD損傷DRG神經(jīng)元OTubulinIII的表達(dá)。結(jié)果顯示，與常規(guī)培養(yǎng)基處理的DRG神經(jīng)元相比，Nl-CM處理的DRG神經(jīng)元在存活和神經(jīng)突起生長(zhǎng)這兩方面均有所改善(圖8)。[0078]實(shí)施例6.坐骨神經(jīng)夾傷后移植NI細(xì)胞或Nl-d-SC進(jìn)行細(xì)胞治療[0079](I)坐骨神經(jīng)夾傷后細(xì)胞移植手術(shù)[0080]腹腔注射復(fù)合麻醉藥(10mg/kg甲苯噻嘆，95mg/kg氯胺酮，0.7mg/kg乙酰丙嘆)以麻醉大鼠；在后肢大腿中部側(cè)面做手術(shù)切口，暴露左側(cè)坐骨神經(jīng);在坐骨神經(jīng)分出脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)的部位近端，以止血鉗夾傷坐骨神經(jīng)3次，每次持續(xù)10秒，每次間隔10秒，注意不要阻斷周圍組織的血液循環(huán)；用I根不可吸收的9/0號(hào)絲線穿在水平于夾傷部位的肌肉上做好標(biāo)記；然后立即在夾傷部位的遠(yuǎn)端處沿神經(jīng)平行進(jìn)針給夾傷神經(jīng)注入IX16個(gè)NI細(xì)胞或Nl-d-SC(誘導(dǎo)NI分化48h);最后縫合好手術(shù)切口。[0081]大鼠分為注入生理鹽水(NS)組，NI細(xì)胞移植組，Nl-d-SC細(xì)胞移植組，每組10只。[0082](2)足跡實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠的功能恢復(fù)情況[0083]分別在手術(shù)前和手術(shù)后8d、12d、16d和20d進(jìn)行大鼠足跡實(shí)驗(yàn)，方法參考已有文獻(xiàn)[YuanY,ShenH,YaoJ,HuN,DingF,GuX.TheprotectiveeffectsofAchyranthesbidentatapolypeptidesinanexperimentalmodelofmousesciaticnervecrushinjury.BrainResBull.2010；81:25-32.]。簡(jiǎn)述如下文:大鼠雙足后爪掌蘸紅色印油，走過(guò)鋪有白紙宣紙的狹長(zhǎng)通道(寬15cm，高15cm，長(zhǎng)80cm)，留下紅色的足跡。查看并選取清晰的足跡，并測(cè)量正常和術(shù)側(cè)足祉寬度(normaltoespread，NTS;experimentaltoespread，ETS)，足印長(zhǎng)度(normalprintlength,NPL!experimentalprintlength,EPL),中間足足止寬度(normalintermediarytoespread，NIT;experimentalintermediarytoespread，EIT)，最后根據(jù)公式計(jì)算每只大鼠的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciaticfunct1nindex，SFI)，SFI接近O表示神經(jīng)功能正常，SFI接近-100表示神經(jīng)功能完全損壞。Bain等給出的公式如下:[0084]SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EIT-NIT)/NIT]-8.8[0085]在足跡實(shí)驗(yàn)中，SFI值代表移步活動(dòng)，用來(lái)指示夾傷坐骨神經(jīng)后大鼠后肢感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)的恢復(fù)情況。手術(shù)前SFI值為正常值0，手術(shù)后SFI值急劇下降為-100，然后隨著坐骨神經(jīng)的再生逐漸升高。比較NS處理組、Nl-d-SC處理組和NI細(xì)胞處理組的結(jié)果顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異:Nl-d-SC處理組的SFI值在手術(shù)后20d明顯高于NS處理組;NI細(xì)胞處理組的SFI值在手術(shù)后12d、16d和20d明顯高于NS處理組;此外，NI細(xì)胞處理組的SFI值在手術(shù)后20d明顯高于Nl-d-SC處理組(圖9A)。[0086](3)電生理檢測(cè)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(CMAP)[0087]在手術(shù)后3周進(jìn)行CMAP的電生理檢測(cè)。麻醉大鼠后再次暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)干近心端給予電刺激后，在同側(cè)腓腸肌腹部記錄CMAP，以對(duì)側(cè)未手術(shù)后肢的CMAP作為正常對(duì)照，以注射NS組作為陰性對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，NI細(xì)胞處理組的CMAP幅度峰值明顯高于Nl-d-SC處理組；同時(shí)，兩種細(xì)胞處理組電生理功能的恢復(fù)明顯優(yōu)于NS處理組(圖9B)。[0088](4)坐骨神經(jīng)的免疫組織化學(xué)(IHC)染色檢測(cè)[0089]手術(shù)3周后取出各組再生的坐骨神經(jīng)，對(duì)側(cè)未手術(shù)神經(jīng)作為正常對(duì)照。神經(jīng)標(biāo)本進(jìn)行后固定，制備神經(jīng)橫斷面冰凍切片，IHC檢測(cè)S100i3和NF200的表達(dá)。結(jié)果顯示，大鼠坐骨神經(jīng)夾傷后經(jīng)細(xì)胞注射處理而再生神經(jīng)纖維，陽(yáng)性表達(dá)NF200的軸突外面包裹著陽(yáng)性表達(dá)S10e的髓鞘;并且，NI細(xì)胞處理組成髓鞘的軸突直徑和髓鞘厚度均大于Nl-d-sc處理組；同時(shí)，兩種細(xì)胞處理組的再生神經(jīng)軸突直徑和髓鞘厚度均大于NS處理組(圖9C)。[0090]結(jié)論:[0091]迀移后BM-NCC是容易從骨髓組織獲取的一種細(xì)胞來(lái)源。由于BMSC的高異質(zhì)性，可分離獲取多個(gè)BM-NCC單克隆細(xì)胞亞群，其中NI細(xì)胞克隆可以最有效地衍生大量高純的SC，且不需要基因改造或進(jìn)一步純化。本研究的主要進(jìn)展是從BM-NCC可衍生均質(zhì)性高的SC后代，并根據(jù)Cadherinl9在NI細(xì)胞的高表達(dá)，NI細(xì)胞向SC的分化能力，NI細(xì)胞的成髓鞘能力，以及NI細(xì)胞對(duì)受損神經(jīng)的修復(fù)作用，證實(shí)NI細(xì)胞克隆具有SCP(或未分化的SCP樣狀態(tài))身份的推論。綜上所述，源于BM-NCC的SCP(BM-NCC克隆NI)有望將來(lái)應(yīng)用于細(xì)胞為基礎(chǔ)的促神經(jīng)再生治療。[0092]本發(fā)明中“BM-NCC"來(lái)自哺乳動(dòng)物，包括但不限為大鼠、小鼠、兔、貓、狗、猴、人。[0093]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.一種大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞NI，保藏號(hào)為CCTCCN0:C201647。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞NI，其特征在于，其具備施旺氏祖細(xì)胞的性能。3.如權(quán)利要求1所述的大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞NI的傳代培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的傳代培養(yǎng)方法如下:將保藏號(hào)為CCTCCN0:C201647的細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)至大多數(shù)細(xì)胞球增大而球中心細(xì)胞開始發(fā)暗時(shí)，用accutase酶將細(xì)胞球消化為單細(xì)胞懸液，然后細(xì)胞按SlO4個(gè)/ml的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)板，進(jìn)行成球傳代培養(yǎng)，每周半量換液2次;根據(jù)需要傳代。4.如權(quán)利要求1所述的大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞NI向施旺氏細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的方法，其特征在于，所述的定向誘導(dǎo)分化方法如下:將保藏號(hào)為CCTCCN0:C201647的細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分離為單個(gè)細(xì)胞，并接種到層黏連蛋白/多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板上，用施旺氏細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化液孵育培養(yǎng)，每2?3d換液I次；所述的施旺氏細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化液為:含5%胎牛血清、35ng/ml全反式視黃酸、5μΜforskolin、200ng/mlHRG-Ιβ、10ng/mlFGF2、10ng/mlI3DGF-AA和I%N2的DMEM/F12(v/v，1:1)培養(yǎng)液。5.如權(quán)利要求1所述的大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞NI在制備促進(jìn)神經(jīng)再生藥物中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞NI在制備促進(jìn)神經(jīng)再生藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用為將大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞NI作為促進(jìn)神經(jīng)再生的細(xì)胞來(lái)源。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞NI在制備促進(jìn)神經(jīng)再生藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用是以細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療，采用的方式為局部注射入受損組織、靜脈注射或用于制備組織工程神經(jīng)移植物行局部植入。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的大鼠骨髓源神經(jīng)嵴祖細(xì)胞NI在制備促進(jìn)神經(jīng)再生藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為細(xì)胞懸液、細(xì)胞的條件培養(yǎng)基、細(xì)胞分泌的因子、細(xì)胞分泌的囊泡或細(xì)胞分泌的囊泡提取物?！疚臋n編號(hào)】A61K35/30GK105925528SQ201610338493【公開日】2016年9月7日【申請(qǐng)日】2016年5月20日【發(fā)明人】施海燕,丁斐,強(qiáng)亮,余英奇,孫曉婷,胡靜靜,孫曉歡,何歡【申請(qǐng)人】南通大學(xué)