一種采用慢病毒技術(shù)構(gòu)建的抗腫瘤遷移藥物篩選細(xì)胞模型a549-gfp及其應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種表達(dá)綠色熒光蛋白的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549?GFP的制備方法和應(yīng)用，該細(xì)胞系與親本細(xì)胞系相比具有類似的生長(zhǎng)曲線，在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，HGF引起的細(xì)胞遷移效應(yīng)顯著，小分子特異性抑制劑對(duì)HGF引起的細(xì)胞遷移效應(yīng)抑制效應(yīng)顯著，以上生物學(xué)活性與親本細(xì)胞系一致。本發(fā)明制備的細(xì)胞模型，是將綠色熒光蛋白（GFP）基因通過(guò)慢病毒感染的方式插入哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞系的基因組內(nèi)，獲得的穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞系，該細(xì)胞模型在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中可以通過(guò)直接熒光顯微鏡觀察的方式來(lái)顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，簡(jiǎn)化了該細(xì)胞模型應(yīng)用于高通量藥物篩選的步驟。
【專利說(shuō)明】
一種采用慢病毒技術(shù)構(gòu)建的抗腫瘤遷移藥物篩選細(xì)胞模型A549-GFP及其應(yīng)用方法
[0001 ]技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及藥物篩選領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)綠色熒光蛋白的A549細(xì)胞系。
[0002]【背景技術(shù)】腫瘤已成為目前威脅人類健康的頭號(hào)殺手，抗腫瘤藥物的研發(fā)和腫瘤的臨床治療成為科研的熱點(diǎn)，因此建立有效的抗腫瘤藥物篩選模型刻不容緩，腫瘤本身特有的迀移性和侵襲性是腫瘤逃避機(jī)體免疫應(yīng)答的重要機(jī)制，因此抑制腫瘤迀移性和侵襲性的藥物備受人們關(guān)注。
[0003]高通量藥物篩選技術(shù)是將多種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)合而形成的新的技術(shù)體系，它以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。它的正常開展需要有一個(gè)高容量的化合物庫(kù)、自動(dòng)化的操作系統(tǒng)、高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)、高效率的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)以及高特異性的藥物篩選模型。
[0004]綠色焚光蛋白(GreenFluorescent Protein，簡(jiǎn)稱GFP)的基因是從Hc1ria水母的基因組中提取獲得的，蛋白全長(zhǎng)238AA，其65-67氨基酸殘基(絲氨酸一酪氨酸一甘氨酸)可自發(fā)的形成熒光發(fā)色團(tuán)，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，可以發(fā)出綠色熒光，吸收光譜的最大峰值為395nm，發(fā)射光譜最大峰值為509nm。如今GFP已作為報(bào)告基因被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)，遺傳學(xué)，器官移植等各個(gè)領(lǐng)域。而在腫瘤相關(guān)的基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域，GFP也發(fā)揮了極大的作用。
[0005]目前在真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建領(lǐng)域，病毒載體正越來(lái)越受到重視。目前常用的病毒載體包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒中的慢病毒載體因其表達(dá)的穩(wěn)定性，包裝容量大以及能夠?qū)崿F(xiàn)多基因共感染等優(yōu)勢(shì)被廣泛使用于科研中。慢病毒感染能夠?qū)⒛康幕蛘先爰?xì)胞的基因組，所以不用再培養(yǎng)基中加入篩選壓力就能穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，降低了成本。
[0006]目前使用的慢病毒包裝體系是由HIV病毒的基因組改造而成的。使用最廣泛的為第三代慢病毒，是一種三質(zhì)粒系統(tǒng)，能用于感染非分裂期的細(xì)胞。通過(guò)改造去除了不相關(guān)基因序列，并使用異源的部分基因代替同源基因(如:envelope-coding質(zhì)粒)來(lái)增加其安全性，同時(shí)對(duì)啟動(dòng)子等序列進(jìn)行修飾改造提高了病毒滴度和轉(zhuǎn)染效率。最后通過(guò)改造得到了自身失活型慢病毒載體(self-1nactivat1n，SIN)有著較高的滴度，轉(zhuǎn)染效率和安全性。而病毒獲得后除了能用于細(xì)胞的感染外，也能用于基因治療。
[0007]肺癌發(fā)生于支氣管粘膜上皮，亦稱支氣管癌。近年來(lái)肺癌的發(fā)病率明顯增高，在男性癌瘤病人中，肺癌已居首位，在女性發(fā)病率也迅速增高，占女性常見惡性腫瘤的第2位或第3位。A549細(xì)胞是研究人肺癌的常用細(xì)胞系。本發(fā)明使用慢病毒系統(tǒng)包裝綠色熒光蛋白(GFP)基因，通過(guò)慢病毒感染A549細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的A549細(xì)胞株。這一細(xì)胞株的建立大大簡(jiǎn)化了體外藥物篩選的檢測(cè)手段，同時(shí)可以應(yīng)用于藥物對(duì)動(dòng)物腫瘤模型的療效方面的研究，實(shí)現(xiàn)腫瘤大小和分布的實(shí)時(shí)監(jiān)控和數(shù)據(jù)收集。
[0008]
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能高通量篩選抗細(xì)胞迀移藥物的細(xì)胞模型。
[0009]解決本發(fā)明技術(shù)問題的技術(shù)方案為:一種篩選抗細(xì)胞迀移藥物的細(xì)胞模型，是通過(guò)慢病毒將綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入到A549細(xì)胞系的基因組內(nèi)，獲得的穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的A549細(xì)胞株。
[0010]其中，上述細(xì)胞模型中的GFP基因能夠穩(wěn)定表達(dá)；
其中，上述細(xì)胞模型中的GFP序列為SEQ ID NO:1。
[0011]本發(fā)明還提供了一種制備上述篩選抗細(xì)胞迀移藥物細(xì)胞模型的方法，該方法包括以下步驟:
將GFP基因克隆至prrl質(zhì)粒內(nèi)，構(gòu)建成prrl-CMV-GFP重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)期的293T細(xì)胞，收獲純化病毒，病毒感染對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋法和熒光篩選，獲得本發(fā)明所述的細(xì)胞模型。
[0012]本發(fā)明還提供了一種抗細(xì)胞迀移藥物的篩選方法，該方法包括以下步驟:
a.取上述的用于篩選抗細(xì)胞迀移藥物的A549細(xì)胞模型接種于transwell小室的上室，篩選組的上室加入含待篩選物的維持培養(yǎng)基，下室加入含HGF的維持培養(yǎng)基；陽(yáng)性對(duì)照組上室為維持培養(yǎng)基，下室加入含HGF的維持培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組上室和下室均為維持培養(yǎng)基；
b.培養(yǎng)各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)各組迀移細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)細(xì)胞迀移數(shù)的多少確定待篩選物是否為需要的潛在藥物，
進(jìn)一步的，上述的抗細(xì)胞迀移藥物篩選方法的細(xì)胞迀移數(shù)為從上室迀移至下室的細(xì)胞數(shù)量。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，在仔細(xì)分析不同感染技術(shù)的基礎(chǔ)上，選擇慢病毒包裝系統(tǒng)來(lái)制備穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的A549細(xì)胞株。本發(fā)明細(xì)胞模型中含有整合到基因組上的GFP基因的編碼序列，且該序列能夠穩(wěn)定表達(dá)。該細(xì)胞模型通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)直接進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，簡(jiǎn)化了細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)的步驟和流程，為實(shí)現(xiàn)抗細(xì)胞迀移藥物高通量篩選奠定基礎(chǔ)。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，建立了制備上述篩選抗細(xì)胞迀移藥物的細(xì)胞模型的方法。該方法具體可通過(guò)以下步驟實(shí)施:
將A549細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；
將裝載有GFP基因的慢病毒在polybrene的介導(dǎo)下感染A549細(xì)胞；
經(jīng)有限稀釋法和熒光顯微鏡篩選得到本細(xì)胞模型。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，建立起了以本發(fā)明細(xì)胞模型為基礎(chǔ)的抗細(xì)胞迀移藥物篩選方法，步驟如下:
a.取上述的用于篩選的細(xì)胞模型接種于transwell小室內(nèi)，細(xì)胞接種數(shù)目為5X 14/孔。分組為篩選組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。其中篩選組的上室加入含待篩選物的維持培養(yǎng)基，下室加入含HGF的維持培養(yǎng)基；陽(yáng)性對(duì)照組上室為維持培養(yǎng)基，下室加入含HGF的維持培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組上室和下室均為維持培養(yǎng)基；
b.細(xì)胞孵育24h，細(xì)胞固定后，無(wú)菌棉簽擦掉上室細(xì)胞，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)小室下表面4個(gè)固定視野區(qū)域的迀移細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)迀移細(xì)胞數(shù)量確定待篩選物是否為需要的潛在藥物；
其中，上述方法步驟3中加入的邪?的用量為12.5]^/1111-200呢/1111，優(yōu)選為100呢/1111。
[0016]本發(fā)明中涉及的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)及常規(guī)分子生物學(xué)的試驗(yàn)操作，都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參考現(xiàn)有的相關(guān)試驗(yàn)指南或儀器、試劑的使用說(shuō)明能夠完成的。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明細(xì)胞模型通過(guò)熒光顯微鏡可以直接觀察迀移細(xì)胞數(shù)，能夠高通量、高靈敏的準(zhǔn)確篩選抗細(xì)胞迀移藥物;本發(fā)明細(xì)胞模型的制備方法簡(jiǎn)單可控，成本低廉;本發(fā)明抗細(xì)胞迀移藥物篩選方法步驟簡(jiǎn)單，成本低廉，準(zhǔn)確性高，可實(shí)現(xiàn)高通量的篩選，具有很好的穩(wěn)定性和可靠性。為抗細(xì)胞迀移藥物的篩選提供了新的思路，具有很好的市場(chǎng)前景。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1:prrl-CMV-GFP重組質(zhì)粒的酶切電泳圖。
[0019]圖2:A549-GFP細(xì)胞系穩(wěn)定性分析。其中第I代和第30代分別指第I代和第30代A549-GFP細(xì)胞系，明場(chǎng)是指明場(chǎng)下細(xì)胞照片，熒光場(chǎng)是指熒光場(chǎng)下細(xì)胞照片。
[0020]圖3:A549-GFP細(xì)胞系與野生型A549細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線比較。其中橫坐標(biāo)為細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間(培養(yǎng)時(shí)間)，縱坐標(biāo)為450nm單波長(zhǎng)條件下測(cè)定的光度吸收值(波長(zhǎng)450nm)。
[0021 ] 圖4:A549-GFP細(xì)胞系與野生型A549細(xì)胞系在HGF作用下細(xì)胞迀移結(jié)果分辨率；
A為明場(chǎng)條件下HGF作用下A549-GFP細(xì)胞系迀移照片；
B為熒光場(chǎng)條件下HGF作用下A549-GFP細(xì)胞系迀移照片，A與B為同一區(qū)域不同光場(chǎng)下照片;
C為熒光場(chǎng)條件下無(wú)HGF作用下A549-GFP細(xì)胞系迀移照片；
D為明場(chǎng)下野生型A549細(xì)胞系在HGF作用下細(xì)胞迀移照片(經(jīng)結(jié)晶紫染色)；
B與A比較，細(xì)胞分辨率明顯升高，B與D比較，細(xì)胞分辨率沒有顯著差異，證明A549-GFP細(xì)胞系在無(wú)需染色的情況下即可達(dá)到野生型A549細(xì)胞系經(jīng)結(jié)晶紫染色后的細(xì)胞分辨率。
[0022]圖5:A549-GFP細(xì)胞系與野生型A549細(xì)胞系在HGF作用下細(xì)胞迀移效應(yīng)比較。其中橫坐標(biāo)為不同細(xì)胞系名稱，縱坐標(biāo)為細(xì)胞迀移率(迀移率XA549-GFP細(xì)胞系與野生型A549細(xì)胞系比較，在HGF作用下細(xì)胞迀移效應(yīng)更加顯著，證明A549-GFP細(xì)胞系具有良好的生物學(xué)活性，對(duì)照為不含HGF對(duì)照組。
[0023]圖6:A549-GFP細(xì)胞系在不同濃度HGF作用下的細(xì)胞迀移效應(yīng)及細(xì)胞活性；
A為A549-GFP細(xì)胞系在不同濃度HGF作用下的細(xì)胞迀移數(shù)量，其中橫坐標(biāo)為HGF濃度(HGF: ng/ml)，縱坐標(biāo)為迀移細(xì)胞數(shù)量(細(xì)胞數(shù)量)；
B為A549-GFP細(xì)胞系在不同濃度HGF作用下細(xì)胞活性，其中橫坐標(biāo)為HGF濃度(HGF: ng/ml)，縱坐標(biāo)為450nm單波長(zhǎng)條件下測(cè)定的光度吸收值(波長(zhǎng)450nm)o
[0024]圖7:A549-GFP細(xì)胞系在不同濃度PF04217903作用下的細(xì)胞迀移效應(yīng)及細(xì)胞活性；A為A549-GFP細(xì)胞系在不同濃度PF04217903作用下的細(xì)胞迀移數(shù)量，其中橫坐標(biāo)為
PF04217903濃度(PF04217903: μΜ)，縱坐標(biāo)為迀移細(xì)胞數(shù)量(細(xì)胞數(shù)量)，對(duì)照為不含HGF，不含PF04217903對(duì)照組，其他各組均含有100ng/ml的HGF;
B為A549-GFP細(xì)胞系在不同濃度PF04217903作用下的細(xì)胞活性，其中橫坐標(biāo)為PF04217903濃度(PRM217903: μΜ)，縱坐標(biāo)為450nm單波長(zhǎng)條件下測(cè)定的光度吸收值(波長(zhǎng)450nm)。
[0025]圖8:不同濃度DMSO對(duì)細(xì)胞迀移效應(yīng)和細(xì)胞活性的影響； A為不同濃度DMSO對(duì)細(xì)胞迀移數(shù)量的影響，其中橫坐標(biāo)為不同濃度(體積比)DMS0(DMS0:濃度)，縱坐標(biāo)為迀移細(xì)胞數(shù)量(細(xì)胞數(shù)量)，對(duì)照為含HGF( 100ng/ml)，不含DMSO對(duì)照組；
B為不同濃度DMSO對(duì)細(xì)胞活性的影響，其中橫坐標(biāo)為不同濃度DMS0(DMS0:濃度)，縱坐標(biāo)為450nm單波長(zhǎng)條件下測(cè)定的光度吸收值(波長(zhǎng)450nm)o
【具體實(shí)施方式】
[0026]藥品與試劑:各種限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司，膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自MN公司；轉(zhuǎn)染試劑M40為實(shí)驗(yàn)室自主制備;DMEM培養(yǎng)基，抗生素，胰酶，D-PBS購(gòu)自hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；HGF，PF04217903購(gòu)自RD公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo公司；其他試劑均為進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br>[0027]儀器:倒置熒光顯微鏡Ti，尼康公司。
本發(fā)明的高效表達(dá)細(xì)胞模型可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白，因此可以在熒光顯微鏡下直接觀察。
[0028]實(shí)施案例一綠色熒光蛋白(GFP)基因載體的選擇
綠色焚光蛋白(Green Fluorescent Pro te in，簡(jiǎn)稱GFP)的基因是從d egworeaHc1ria水母的基因組中提取獲得的，蛋白全長(zhǎng)238AA，其65-67氨基酸殘基(絲氨酸一酪氨酸一甘氨酸)可自發(fā)的形成熒光發(fā)色團(tuán)，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，可以發(fā)出綠色熒光，吸收光譜的最大峰值為395nm，發(fā)射光譜最大峰值為509nm。如今GFP已作為報(bào)告基因被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)，遺傳學(xué)，器官移植等各個(gè)領(lǐng)域。而在腫瘤相關(guān)的基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域，GFP也發(fā)揮了極大的作用。
[0029]本發(fā)明中使用慢病毒表達(dá)載體prrl-CMV作為GFP的表達(dá)載體，制備方法使用現(xiàn)有的公認(rèn)技術(shù)，其中GFP的CDNA序列為SEQ ID N0.1所示。
[0030]實(shí)施案例二裝載GFP基因的慢病毒的包裝和純化
在真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和基因治療領(lǐng)域，病毒載體正越來(lái)越受到重視。目前常用的病毒載體包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒中的慢病毒載體因其表達(dá)的穩(wěn)定性，包裝容量大以及能夠?qū)崿F(xiàn)多基因共感染等優(yōu)勢(shì)被廣泛使用于科研中。慢病毒感染能夠?qū)⒛康幕蛘先爰?xì)胞的基因組，所以不用再培養(yǎng)基中加入篩選壓力就能穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，降低了成本。因此本發(fā)明使用慢病毒包裝、感染的方法獲得最終的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
[0031]目前使用的慢病毒包裝體系是由HIV病毒的基因組改造而成的。使用最廣泛的為第三代慢病毒，是一種三質(zhì)粒系統(tǒng)，能用于感染非分裂期的細(xì)胞。通過(guò)改造去除了不相關(guān)基因序列，并使用異源的部分基因代替同源基因(如:envelope-coding質(zhì)粒)來(lái)增加其安全性，同時(shí)對(duì)啟動(dòng)子等序列進(jìn)行修飾改造提高了病毒滴度和轉(zhuǎn)染效率。最后通過(guò)改造得到了自身失活型慢病毒載體(self-1nactivat1n，SIN)有著較高的滴度，轉(zhuǎn)染效率和安全性。而病毒獲得后除了能用于細(xì)胞的感染外，也能用于基因治療。
[0032]本發(fā)明中以人腎上皮細(xì)胞(293T)為受體細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝，
使用prrl-CMV-GFP為重組包裝質(zhì)粒。
[0033]使用的包裝質(zhì)粒為pMD2.G，pMD-PRRE 和 pRSV-REV。
[0034]試驗(yàn)過(guò)程如下:
(I)細(xì)胞培養(yǎng)
用含抗生素和10%血清的完全DMEM培養(yǎng)基接種細(xì)胞于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞濃度為6 X15/孔。待細(xì)胞完全貼壁后，用轉(zhuǎn)染試劑M40進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0035](2)轉(zhuǎn)染過(guò)程
DNA和轉(zhuǎn)染試劑混合物的配制 A溶液:
prrl-CMV-GFP1.7μg
包裝質(zhì)?；旌衔?.8yg
無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)充至ΙΟΟμΙ，震蕩混勻；
B溶液:
轉(zhuǎn)染試劑16μ1
無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)充至ΙΟΟμΙ，輕柔混勻；
將A液與B液輕柔混勻，室溫靜置1min，將混合液加入到細(xì)胞中。37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日換為含血清含抗生素的DMEM培養(yǎng)基。
[0036](3)慢病毒的收集和純化
收集轉(zhuǎn)染后第4天和第5天的細(xì)胞上清，將第四天和第五天收集的病毒液4000g，室溫離心1min;離心后的病毒液經(jīng)0.45μηι濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)入超濾管內(nèi)(ufc910024，MILLIP0RE)，常溫，4000g，離心15min ；收集病毒濃縮液，分裝，凍存于_80度。
[0037]實(shí)施案例三本發(fā)明細(xì)胞模型的建立
在本實(shí)驗(yàn)中使用人肝癌細(xì)胞(A549 )為受體細(xì)胞。
[0038]使用的慢病毒為裝載GFP基因的慢病毒。
[0039]試驗(yàn)過(guò)程如下:
(I)細(xì)胞培養(yǎng)
用含抗生素和10%血清的完全DMEM培養(yǎng)基接種細(xì)胞于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞濃度為6 X15/孔。待細(xì)胞完全貼壁后，用轉(zhuǎn)染試劑M40進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0040](2)感染過(guò)程
慢病毒用完全DMEM培養(yǎng)基(含6yg/ml polybrene)稀釋至合適倍數(shù)后，加入到棄去上清的A549細(xì)胞表面;慢病毒感染24h后，換用含抗生素和10%血清的完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。[0041 ] (3)細(xì)胞克隆化
取飼養(yǎng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)小鼠脫白致死，75%酒精浸泡lOmin，無(wú)菌解剖，剪開腹部皮膚，不要損傷腹膜，用注射器吸取6_8ml完全培養(yǎng)基，用鑷子夾起腹膜，進(jìn)針，注意不要戳到內(nèi)臟和脂肪，進(jìn)針方位可以在腹部中間，避開腹部下方的脂肪；
反復(fù)吹打腹腔數(shù)次，期間用酒精棉球輕揉小鼠腹部，待吸出培養(yǎng)基變黃時(shí)將培養(yǎng)基吸出，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)備用。(一只成年小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞可以滿足6-8塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的鋪板需要)；
取感染后A549細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)，每20ml培養(yǎng)基(含相應(yīng)濃度的飼養(yǎng)細(xì)胞)加入150個(gè)細(xì)胞，分96孔板，200μ1/孔；
細(xì)胞培養(yǎng)I天后觀察是否有污染，培養(yǎng)3-5天后計(jì)數(shù)細(xì)胞亞克隆數(shù)目，并做記錄。細(xì)胞培養(yǎng)10天，選擇單克隆細(xì)胞孔在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，選擇發(fā)綠色熒光的細(xì)胞克隆進(jìn)行消化和擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0042]實(shí)施案例四陽(yáng)性克隆細(xì)胞的篩選和細(xì)胞迀移體系建立
由于外源基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞的染色體上，根據(jù)整合位點(diǎn)的隨機(jī)性，可能存在宿主細(xì)胞狀態(tài)差、對(duì)信號(hào)分子反應(yīng)弱和目的基因表達(dá)穩(wěn)定性差等問題。因此將所有挑出的陽(yáng)性克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)曲線對(duì)比試驗(yàn)和GFP表達(dá)穩(wěn)定性分析。
[0043]試驗(yàn)例一GFP表達(dá)穩(wěn)定性分析
在本實(shí)驗(yàn)中共篩選得到了 4個(gè)陽(yáng)性克隆。對(duì)這4個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)試驗(yàn)方案:細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，棄去細(xì)胞上清，用D-PBS洗滌一遍，加入適量胰酶進(jìn)行消化，倒置顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞變?yōu)閳A形時(shí)使用有血清有抗生素的完全DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹下細(xì)胞，100rpm離心10分鐘，留1/4的細(xì)胞在原培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)重復(fù)上述操作。
[0044]每傳代5次，熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞的比例和細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，拍照記錄。結(jié)果如圖2所示:A549-GFP細(xì)胞系在第30代時(shí)其熒光率仍然保持100%，證明A549-GFP細(xì)胞系具有良好的穩(wěn)定性。
[0045]試驗(yàn)例二本發(fā)明細(xì)胞模型與野生型細(xì)胞生長(zhǎng)曲線比較
從上部試驗(yàn)篩選獲得的4株細(xì)胞中選擇細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最好的I株，對(duì)這株細(xì)胞與野生型A549細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定規(guī)模時(shí)進(jìn)行生長(zhǎng)曲線分析。生長(zhǎng)曲線分析試驗(yàn)方案:細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞消化和計(jì)數(shù)，按照1.5 X 13/孔的細(xì)胞密度鋪板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，使用有血清有抗生素的完全DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每孔200μ1，分別在24h，48h，72h，96h，120h和144h進(jìn)行細(xì)胞活力分析，具體步驟為:棄去細(xì)胞上清，加入含10% CCK-8試劑的無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)基100yl，37°C，5% CO2
培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h后，取出細(xì)胞，在酶標(biāo)儀0D450條件下進(jìn)行讀數(shù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示:A549-GFP細(xì)胞系與野生型A549細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線基本一致，證明A549-GFP細(xì)胞系具有良好的生長(zhǎng)活性。
[0046]試驗(yàn)例一和試驗(yàn)例二證明我們篩選獲得的細(xì)胞模型GFP穩(wěn)定性好，生長(zhǎng)曲線與野生型一致，是良好的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。
[0047]試驗(yàn)例三本發(fā)明細(xì)胞模型與野生型細(xì)胞在HGF作用下細(xì)胞迀移效應(yīng)比較
試驗(yàn)例三從生物學(xué)活性角度分析本發(fā)明細(xì)胞模型是否具有由HGF引起的細(xì)胞迀移效應(yīng)，以及這種效應(yīng)與野生型A549細(xì)胞的比較。HGF是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其能夠促進(jìn)野生型A549細(xì)胞的細(xì)胞迀移效應(yīng)。
[0048]細(xì)胞迀移效率計(jì)算公式為:
細(xì)胞迀移效率=給藥孔的迀移細(xì)胞數(shù)+不含藥孔的迀移細(xì)胞數(shù)其中不含藥孔的細(xì)胞迀移效率定為1.0。
[0049]試驗(yàn)方案:
1)細(xì)胞分孔:細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞消化和計(jì)數(shù)，將細(xì)胞用低血清(1%FBS)DMEM培養(yǎng)基稀釋至目標(biāo)濃度，加入小室內(nèi)，0.5ml/well，5 X 104cell/well，貼壁培養(yǎng)；
2)加藥:加入含100ng/ml濃度的HGF至小室下層，HGF使用低血清(1%FBS)DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，0.75ml/well; 3)培養(yǎng):37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h;
5)洗滌:取出小室，棄去培養(yǎng)基，PBS0.5mlol time,RT；
6)固定:小室內(nèi)加入甲醛，0.5ml，10min，RT;
7)擦拭:取出小室，用棉簽擦掉小室上層細(xì)胞，并用PBS淋洗一次；
8)染色:結(jié)晶紫染色液置于24孔板0.5ml，將小室置于其中，>30min，RT(步驟8_9為野生型A549細(xì)胞操作步驟，本發(fā)明細(xì)胞模型無(wú)需染色，直接在熒光顯微鏡下觀察)
9)洗滌:大量自來(lái)水置于500ml燒杯中，漂洗小室；
10)成像計(jì)數(shù):顯微鏡下成像，計(jì)數(shù)。
[0050]結(jié)果分析
結(jié)果如圖4和圖5所示:
圖4為A549-GFP細(xì)胞系與野生型A549細(xì)胞系在HGF作用下細(xì)胞迀移結(jié)果，
其中圖A為明場(chǎng)條件下HGF作用下A549-GFP細(xì)胞系迀移照片；
圖B為熒光場(chǎng)條件下HGF作用下A549-GFP細(xì)胞系迀移照片，圖A與圖B為同一區(qū)域不同光場(chǎng)下照片；
圖C為熒光場(chǎng)條件下無(wú)HGF作用下A549-GFP細(xì)胞系迀移照片；
圖D為明場(chǎng)下野生型A549細(xì)胞系在HGF作用下細(xì)胞迀移照片(經(jīng)結(jié)晶紫染色)；
其中圖B與圖A比較，細(xì)胞分辨率明顯升高，圖B與圖D比較，細(xì)胞分辨率沒有顯著差異，證明A549-GFP細(xì)胞系在無(wú)需染色的情況下即可達(dá)到野生型A549細(xì)胞系經(jīng)結(jié)晶紫染色后的細(xì)胞分辨率。
[0051 ] 圖5為A549-GFP細(xì)胞系與野生型A549細(xì)胞系在HGF作用下細(xì)胞迀移效應(yīng)比較。A549-GFP細(xì)胞系與野生型A549細(xì)胞系比較，在HGF作用下細(xì)胞迀移效應(yīng)更加顯著，證明A549-GFP細(xì)胞系具有良好的生物學(xué)活性。
[0052]試驗(yàn)例一和試驗(yàn)例二證明我們篩選獲得的細(xì)胞模型GFP穩(wěn)定性好，生長(zhǎng)曲線與野生型細(xì)胞一致，是良好的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。試驗(yàn)例三從生物學(xué)活性角度分析本發(fā)明細(xì)胞模型具有與野生型A549細(xì)胞一致的對(duì)HGF敏感的細(xì)胞迀移效應(yīng)。
[0053]試驗(yàn)例四A549-GFP細(xì)胞系在不同濃度HGF作用下的細(xì)胞迀移效應(yīng)及細(xì)胞活性分析
試驗(yàn)例四通過(guò)加入不同濃度的HGF，分析不同濃度HGF引起的細(xì)胞迀移效應(yīng)以及細(xì)胞活性分析。
[0054]細(xì)胞迀移效應(yīng)試驗(yàn)方案:分別在小室下部加入不同濃度的HGF。
[0055]細(xì)胞活性分析試驗(yàn)方案:細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞消化和計(jì)數(shù)，按照5X13/孔的細(xì)胞密度鋪板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，使用含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每孔200μ1，次日加入含不同濃度HGF的1% FBS的DMEM，加藥后72h時(shí)進(jìn)行細(xì)胞活力分析，具體步驟為:棄去細(xì)胞上清，加入含10% CCK-8試劑的無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)基100μ?，37 °C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h后，取出細(xì)胞，在酶標(biāo)儀0D450條件下進(jìn)行讀數(shù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示:
其中圖A:其中橫坐標(biāo)為HGF濃度(HGF: ng/ml )，縱坐標(biāo)為迀移細(xì)胞數(shù)量(ce 11number) AGF濃度在100ng/ml時(shí)A549-GFP細(xì)胞系的細(xì)胞迀移效應(yīng)最顯著，因此選擇此濃度建立抗細(xì)胞迀移藥物篩選方法； 圖B:其中橫坐標(biāo)為HGF濃度(HGF: ng/ml)，縱坐標(biāo)為450nm單波長(zhǎng)條件下測(cè)定的光度吸收值(0D450XA549-GFP細(xì)胞系在不同濃度HGF作用下的細(xì)胞活性無(wú)變化，證明HGF對(duì)A549-GFP細(xì)胞系增殖活性沒有影響。
[0056]試驗(yàn)例一和試驗(yàn)例二證明我們篩選獲得的細(xì)胞模型GFP穩(wěn)定性好，生長(zhǎng)曲線與野生型細(xì)胞一致，是良好的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。試驗(yàn)例三從生物學(xué)活性角度分析本發(fā)明細(xì)胞模型具有與野生型A549細(xì)胞一致的對(duì)HGF敏感的細(xì)胞迀移效應(yīng)。
[0057]試驗(yàn)例五A549-GFP細(xì)胞系在不同濃度PF04217903作用下的細(xì)胞迀移效應(yīng)及細(xì)胞活性分析
試驗(yàn)例五通過(guò)加入HGF抑制劑PF04217903，分析PF04217903對(duì)HGF引起細(xì)胞迀移效應(yīng)的抑制效應(yīng)。？^)4217903是一種選擇性的4了?競(jìng)爭(zhēng)性(3-]^丨抑制劑，1050為4.8 nM。
[0058]細(xì)胞迀移效應(yīng)試驗(yàn)方案:分別在小室上部加入不同濃度的PF04217903，小室下部加入 100 ng/ml 的HGF13Control為不含HGF，不含PF04217903對(duì)照組。
[0059]細(xì)胞活性分析試驗(yàn)方案:參照試驗(yàn)例四步驟，分別加入不同濃度的PF04217903和100 ng/ml 的HGF。control為不含HGF，不含PF04217903對(duì)照組。
[0060]結(jié)果如圖7所示:
其中圖A:其中橫坐標(biāo)為PF04217903濃度(PF04217903: μΜ)，縱坐標(biāo)為迀移細(xì)胞數(shù)量(cell number) ,control為不含HGF，不含PF04217903對(duì)照組。其他各組均含有100ng/ml的HGF。HGF濃度在100ng/ml時(shí)，不同濃度PF04217903對(duì)HGF弓丨起的A549-GFP細(xì)胞系的細(xì)胞迀移效應(yīng)完全抑制；
圖B:其中橫坐標(biāo)為PF04217903濃度(PF04217903: μΜ)，縱坐標(biāo)為450nm單波長(zhǎng)條件下測(cè)定的光度吸收值(0D450XA549-GFP細(xì)胞系在不同濃度PF04217903和100 ng/ml的HGF共同作用下的細(xì)胞活性無(wú)變化，證明PH)4217903對(duì)A549-GFP細(xì)胞系增殖活性沒有影響。
[0061 ]試驗(yàn)例六不同濃度DMSO對(duì)藥物篩選方法的影響
抗細(xì)胞迀移藥物可能溶于DMS0。因此有必要檢測(cè)不同濃度DMSO對(duì)藥物篩選方法的影響。
[0062]細(xì)胞迀移效應(yīng)試驗(yàn)方案:分別在小室上部加入不同濃度的DMS0，小室下部加入100ng/ml的HGF。control為不含HGF，不含DMSO對(duì)照組。
[0063]細(xì)胞活性分析試驗(yàn)方案:參照試驗(yàn)例四步驟，分別加入不同濃度的DMSO和100 ng/ml的HGF。control為不含HGF，不含DMSO對(duì)照組。
[0064]試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示:
其中圖A顯示不同濃度的DMSO對(duì)HGF引起的細(xì)胞迀移效率沒有顯著影響，圖B顯示不同濃度的DMSO對(duì)細(xì)胞增殖沒有顯著影響。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種篩選抗腫瘤迀移藥物的細(xì)胞模型，其特征在于:所述細(xì)胞模型是克隆了 GFP基因的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞;所述哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞可選但不限于HepG2、MCF-7、U-87-MG、MDA-MB-231、EA、A549 中的一種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于篩選抗腫瘤迀移藥物的細(xì)胞模型，其特征在于:所述GFP基因能夠穩(wěn)定表達(dá)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于篩選抗腫瘤迀移藥物的細(xì)胞模型，其特征在于:所述GFP基因序列為SEQ ID NO:104.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于篩選抗腫瘤迀移藥物的細(xì)胞模型，其特征在于:所述細(xì)胞模型由慢病毒系統(tǒng)制備完成，包括以下步驟:將GFP基因克隆至prrl質(zhì)粒內(nèi)，構(gòu)建成prrl-CMV-GFP重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)期的293T細(xì)胞，收獲純化病毒，病毒感染對(duì)數(shù)期細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋法和熒光篩選，獲得本發(fā)明所述的細(xì)胞模型。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于篩選抗腫瘤迀移藥物的細(xì)胞模型，其特征在于與親本細(xì)胞系相比具有類似的生長(zhǎng)曲線。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于篩選抗腫瘤迀移藥物的細(xì)胞模型，其特征在于在細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)中，HGF引起的細(xì)胞迀移效應(yīng)顯著，特異性小分子抑制劑對(duì)HGF引起的細(xì)胞迀移效應(yīng)抑制效應(yīng)顯著，以上生物學(xué)活性與親本細(xì)胞系一致。7.—種細(xì)胞迀移篩選模型的方法，其特征在于包括以下步驟: a.取上述的用于篩選的細(xì)胞模型接種于transwell小室內(nèi)，其中篩選組的上室加入含待篩選物的維持培養(yǎng)基，下室加入含促細(xì)胞迀移藥物的維持培養(yǎng)基； b.細(xì)胞孵育4-24h，細(xì)胞固定后，無(wú)菌棉簽擦掉上室細(xì)胞，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)小室下表面4個(gè)固定視野區(qū)域的迀移細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)迀移細(xì)胞數(shù)量確定待篩選物是否為需要的潛在藥物。
【文檔編號(hào)】C12N15/867GK105925533SQ201610254095
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月23日
【發(fā)明人】蔣明, 尹衍新, 蔣韻, 毛玉婷
【申請(qǐng)人】同濟(jì)大學(xué)蘇州研究院