一種包含ox40的慢病毒制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種包含OX40的慢病毒制備方法及應(yīng)用。通過所述慢病毒制備方法制備的慢病毒，可以不需要添加CD28，僅在轉(zhuǎn)染前，于培養(yǎng)基中直接添加少量的CD3作為T細(xì)胞激活第一信號，減少Car?T細(xì)胞制備的程序，降低成本及污染風(fēng)險；通過重組VSVG，刺激T細(xì)胞進(jìn)一步活化，增加病毒與細(xì)胞接觸概率以有效提高感染效率。
【專利說明】
-種包含0X40的慢病毒制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種包含0X40的慢病毒制備方法及應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢病毒化entivirus)載體是WHIV-U人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的 基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。 慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可W將外源基因有效地整合到 宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、 屯、肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效 果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)粒 可提供所有的轉(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度 的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包 裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離屯、取得上清液后，可W直接用于宿主細(xì)胞 的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效 應(yīng)分子。
[0004] 如圖1所示，慢病毒可作為CART淋己細(xì)胞治療中的外源基因的載體，將外源基因 CAR導(dǎo)入到T淋己細(xì)胞中，從而對T淋己細(xì)胞進(jìn)行基因組修飾，同時起到對T淋己細(xì)胞活化的 作用。嵌合抗原受體(CAR)基因修飾的T細(xì)胞是W能編碼單鏈抗體-共刺激分子-免疫受體酪 氨酸活化基序的嵌合分子的融合基因修飾T細(xì)胞而產(chǎn)生的一種基因修飾的T細(xì)胞，具有腫瘤 抗原識別特異性強(qiáng)、親和力高、非血K限制性并且可在體內(nèi)外大量擴(kuò)增。
[0005] 作為和本申請最接近的現(xiàn)有技術(shù)，公開號為CN201510279570.3的專利公開了一種 用于制備CART細(xì)胞的具有高效轉(zhuǎn)染能力和生物學(xué)活性的慢病毒，將CD3和CD28的相關(guān)序列 與VSVG重組后用于慢病毒的包裝，將CD3的第一信號、CD28的第二信號，分別單獨與VSVG重 組來共同活化T細(xì)胞，同時在感染T細(xì)胞前不使用任何抗體激活T細(xì)胞，運種活化方式具有一 定的風(fēng)險性和不穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種包含0X40的慢病毒制備方 法及應(yīng)用。通過所述慢病毒制備方法制備的慢病毒，可W不需要添加CD28,僅在轉(zhuǎn)染前，于 培養(yǎng)基中直接添加少量的CD3作為T細(xì)胞激活第一信號，減少化r-T細(xì)胞制備的程序，降低成 本及污染風(fēng)險;通過重組VSVG，刺激T細(xì)胞進(jìn)一步活化，增加病毒與細(xì)胞接觸概率W有效提 高感染效率。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[000引一種包含0X40的慢病毒制備方法，包括W下步驟：
[0009] A、慢病毒載體質(zhì)粒881-3-SJ19的構(gòu)建：
[0010] A1、對CD19CAR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增：W全基因合成CD19CAR基因為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到CD19CAR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0011] A2、凝膠提純CD19CAR擴(kuò)增產(chǎn)物:使用凝膠提純PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中CD19CAR的cDNA;
[0012] A3、用CD19CAR基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞：將步驟A2中得到的CD19CAR的cDNA、18-T Vector和 Solution r混合均勻，在16°C下保存16小時;然后加入化an巧a感受態(tài)細(xì)胞中，依次在冰中 保持30min，然后加熱至42 °C保持45s，再在冰中保持Imin，然后加入S0C/LB培養(yǎng)基，在37 °C 振蕩培養(yǎng)60分鐘，培養(yǎng)后離屯、，棄部分上清液后，將剩余液體涂布在含有Amp的瓊脂平板培 養(yǎng)基上培養(yǎng)；
[0013] A4、提取含有CD19CAR基因的質(zhì)粒:從瓊脂平板培養(yǎng)基上挑取881-3-SJ19質(zhì)粒；
[0014] B、VSVG質(zhì)粒的改造：
[0015] Bl、對0X40基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增：W全基因合成0X40的基因片段為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到0X40擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0016] B2、對VSVG基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增：W全基因合成VSVG的基因片段為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到VSVG擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0017] B3、獲得0X40-VSVG重組基因片段:將所述0X40擴(kuò)增產(chǎn)物和VSVG擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶 切，并回收酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，得到連接產(chǎn)物；
[0018] B4、用0X40-VSVG重組基因片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞:將步驟B3得到的連接產(chǎn)物加入TOPlO感 受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻后依次在冰中保持30min，然后加熱至42°C保持45s，再在冰中保持 Imin，然后加入S0C/LB培養(yǎng)基，在37 °C振蕩培養(yǎng)60分鐘，培養(yǎng)后離屯、，棄部分上清液后，將剩 余液體涂布在瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)；
[0019] B5、改造 VSVG質(zhì)粒的提取:用堿裂解法或質(zhì)粒抽提試劑盒提取改造的VSVG質(zhì)粒，命 名為0X40-VSVG質(zhì)粒；
[0020] C、慢病毒的制備：
[0021] CU配制邸S溶液：將IOml 1.4M的化Cl、5ml 0.5M的邸S、500化150mM的化抽P〇4和 110化L IM的NaOH混合均勻、加雙蒸水定容至50ml、調(diào)PH至6.95，過濾后保存，即為邸S溶液；
[0022] C2、配制轉(zhuǎn)染試劑：將步驟A4得到的881 -3-SJ19質(zhì)粒、NRF質(zhì)粒、步驟B5得到的 0X40-VSVG質(zhì)粒、IM CaC12和雙蒸水，混合均勻后，逐滴加入步驟Cl得到的邸S溶液，滴加完 畢后，靜置30min;即得轉(zhuǎn)染試劑；
[0023] C3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和培養(yǎng):復(fù)蘇293T細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)所述293T細(xì)胞密度達(dá)到培養(yǎng)皿 底部70 %時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基對所述293T細(xì)胞進(jìn)行換液;換液后，逐滴加 入步驟C2得到的轉(zhuǎn)染試劑，混合均勻后，將所述293T細(xì)胞放入培養(yǎng)箱，靜置2小時，靜止后滴 加胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)8小時，然后使用含IOwt %胎牛血清的DMEM換液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時；
[0024] C4、病毒收集:步驟C3完成后，收集上清液，離屯、過濾后，即得病毒原液。
[0025] 通過所述慢病毒制備方法制備的慢病毒，可W不需要添加 CD28,僅在轉(zhuǎn)染前，于培 養(yǎng)基中直接添加少量的CD3作為T細(xì)胞激活第一信號，減少化r-T細(xì)胞制備的程序，降低成本 及污染風(fēng)險;通過重組VSVG，刺激T細(xì)胞進(jìn)一步活化，增加病毒與細(xì)胞接觸概率W有效提高 感染效率。
[00%]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，凝膠提純CD19CAR擴(kuò)增產(chǎn)物的操作包括W下步驟：
[0027] I.在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，切碎膠塊。
[002引 2.稱重膠塊重量，計算膠塊體積，Wlmg =化L計算，向膠塊中加入Buffer GM(3個 凝膠體積量）。
[0029] 3.均勻混合后37°C水浴溶解，此時應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分溶解（約5-10分 鐘)。
[0030] 4.當(dāng)凝膠完全溶解后，觀察溶膠液的顏色，如果溶膠液顏色由黃色變?yōu)槌紊蚍?色，向上述膠塊溶解液中加入3M醋酸鋼溶液(P冊.2) 1化1，均勻混合至溶液恢復(fù)黃色。當(dāng)分 離小于40化P的DNA片段時，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。
[0031 ] 5.將試劑盒中的Spin Column安置于Collection l\ibe上。
[0032] 6.將上述操作步驟4的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12,00化pm離屯、I分鐘，棄濾液。
[0033] 7.將70化1的Buffer WB加入Spin Column中，室溫12,000巧m離屯、30秒鐘，棄濾液。
[0034] 8.再加入70化1 的Buffer WB，將Spin Column安置于Collection l\ibe上，室溫 12， 000巧m離屯、1分鐘。
[0(X3日]9.將Spin Column安置于新的1.5ml的離屯、管上，在Spin Colu皿膜的中央處加入 30iil滅菌蒸饋水或Elution BuffeH加熱至60°C使用時有利于提高洗脫效率。）室溫靜置1 分鐘。室溫12000巧m離屯、1分鐘洗脫DNA。
[0036] 步驟Al中，所述PCR反應(yīng)體系的總體積為50化:包括0.25化的Ex Taq酶、5化的Ex Taq緩沖液、4化的dNTP、2化的模板和4化引物，余量為滅菌水，所使用的dNTP的濃度為 2.5mM，模板的濃度為1 OOng/化，引物的濃度為1 OuM。
[0037] 也就是說，所述dNTP、模板和引物，均為添加前的濃度。
[0038] 步驟Al中，使用的PCR擴(kuò)增程序為:進(jìn)行25個循環(huán)，其中每個循環(huán)依次包括W下步 驟:在98°C溫度下預(yù)變性10s，在50°C溫度下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25個 循環(huán)之后，即完成PCR擴(kuò)增程序。
[0039] 步驟A4完成之后，還包括A5、酶切檢測：依次進(jìn)行酶切步驟和連接反應(yīng)檢測所述 881-3-SJ19質(zhì)粒的序列;使用的酶切體系為:2化的881-3-SJ19質(zhì)粒、1化的緩沖液、0.5化的 化Ol酶和6.扣L的cW出0;使用的連接體系為:2化的慢病毒載體、1化的緩沖液、0.5化的XbaI 酶和6.化L的dd出0。
[0040] 步驟Bl中，所述PCR反應(yīng)體系的總體積為50化:包括0.25化的Ex Taq酶、5化的Ex Taq緩沖液、4化的dNTP、2化的模板和4化引物，余量為滅菌水，所使用的dNTP的濃度為 2.5mM，模板的濃度為1 OOng/化，引物的濃度為1 OuM。
[0041] 步驟Bl中，使用的PCR擴(kuò)增程序為:進(jìn)行25個循環(huán)，其中每個循環(huán)依次包括W下步 驟:在98°C溫度下預(yù)變性10s，在50°C溫度下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25個 循環(huán)之后，即完成PCR擴(kuò)增程序。
[0042] 步驟B2中，所述PCR反應(yīng)體系的總體積為50化:包括0.25化的Ex Taq酶、5化的Ex Taq緩沖液、4化的dNTP、2化的模板和4化引物，余量為滅菌水，所使用的dNTP的濃度為 2.5mM，模板的濃度為1 OOng/化，引物的濃度為1 OuM。
[0043] 步驟B2中，使用的PCR擴(kuò)增程序為:進(jìn)行25個循環(huán)，其中每個循環(huán)依次包括W下步 驟:在98°C溫度下預(yù)變性10s，在50°C溫度下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25個 循環(huán)之后，即完成PCR擴(kuò)增程序。
[0044] 步驟步驟C4完成之后，還包括巧、病毒效價檢測：用病毒效價檢測試劑盒檢測病毒 效價。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，使用病毒效價檢測試劑盒檢測時，病毒效價的標(biāo)準(zhǔn)曲線如 圖2所示，病毒效價的檢測結(jié)果如表2所示：
[0046] 本發(fā)明還公開了，所述慢病毒制備方法制備得到的慢病毒在感染T細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0047] 本發(fā)明的實施例2,公開了一例慢病毒感染T細(xì)胞及效果檢測的實施例。從實施例 能夠看出，通過所述慢病毒制備方法制備的慢病毒，可W不需要添加 CD28,僅在轉(zhuǎn)染前，于 培養(yǎng)基中直接添加少量的CD3作為T細(xì)胞激活第一信號，減少化r-T細(xì)胞制備的程序，降低成 本及污染風(fēng)險;通過重組VSVG，刺激T細(xì)胞進(jìn)一步活化，增加病毒與細(xì)胞接觸概率W有效提 高感染效率。
[0048] 為進(jìn)一步明確本發(fā)明中的技術(shù)方案，做出W下說明，未進(jìn)行著重說明的，均為行業(yè) 通用術(shù)語，在此就不在寶述。
[0049] CD134(0X40)在T細(xì)胞增殖的后期及維持存活過程中發(fā)揮重要作用，通過影響其介 導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子，進(jìn)而影響CD4+T細(xì)胞的分化，而CD4+T細(xì)胞又能促進(jìn)CD8+TCL的增殖和持 續(xù)存在。同時，CD134能協(xié)同刺激T細(xì)胞的活化，促進(jìn)B細(xì)胞類別轉(zhuǎn)換和產(chǎn)生高效抗體。在眾多 的共刺激分子中，許多都可W阻止耐受的形成，而耐受一旦形成，只有CD134可W打破已建 立的外周耐受。將CD134作為刺激T細(xì)胞活化的協(xié)同信號，結(jié)合慢病毒包裝和T細(xì)胞活化方式 的改進(jìn)，重組到VSVG中，與祀向載體一同包裝成慢病毒，在早期和長期活化T細(xì)胞方面有積 極意義。攜帶0X40-VSVG的慢病毒可W與T淋己細(xì)胞表面的CD134結(jié)合，加強(qiáng)慢病毒與T淋己 細(xì)胞的接觸，有利于提高慢病毒感染效率。
[0050] 在本發(fā)明中，VSVG的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0051 ] VSVG的結(jié)構(gòu)圖如圖3所示；
[0化2] 0X40的核巧酸序列如沈Q ID NO:2所示；
[0化3] 0乂40-￥5￥6的核巧酸序列如沈9 10備:3所示；
[0054] 0乂40-￥5￥6的氨基酸序列如沈9 10^:4所示；
[0化5] 0X40-VSVG的結(jié)構(gòu)圖如圖4所示。
【附圖說明】
[0056] 圖1為現(xiàn)有技術(shù)中T細(xì)胞活化過程的示意圖；
[0057] 圖2是實施例中使用病毒效價檢測試劑盒檢測時，病毒效價的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0化引圖3是VSVG的結(jié)構(gòu)圖；
[0059] 圖4是0X40-VSVG的結(jié)構(gòu)圖；
[0060] 圖5-圖8是實施例2中感染效率的結(jié)果圖；
[0061 ]圖9是實施例2中CD69陽性表達(dá)率的結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0062] 下面結(jié)合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實施并不局限 于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0063] 在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均 可從市場購得或是本行業(yè)常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī) 方法。
[0064] 實施例1
[0065] -種包含0X40的慢病毒制備方法，包括W下步驟：
[0066] A、慢病毒載體質(zhì)粒881-3-SJ19的構(gòu)建：
[0067] A1、對CD19CAR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增：W全基因合成CD19CAR基因為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到CD19CAR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0068] 步驟Al中，所述PCR反應(yīng)體系的總體積為50化:包括0.25化的Ex Taq酶、5化的Ex Taq緩沖液、4化的dNTP、2化的模板和4化引物，余量為滅菌水，所使用的dNTP的濃度為 2.5mM，模板的濃度為1 OOng/化，引物的濃度為1 OuM;
[0069] 使用的PCR擴(kuò)增程序為:進(jìn)行25個循環(huán)，其中每個循環(huán)依次包括W下步驟:在98°C 溫度下預(yù)變性IOs，在50°C溫度下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25個循環(huán)之后， 即完成PCR擴(kuò)增程序。
[0070] A2、凝膠提純CD19CAR擴(kuò)增產(chǎn)物:使用凝膠提純PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中CD19CAR的cDNA;
[0071] A3、用CD19CAR基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞:將步驟A2中得到的CD19CAR的cDNA、18-T Vector和 Solution r混合均勻，在16°C下保存16小時;然后加入化an巧a感受態(tài)細(xì)胞中，依次在冰中 保持30min，然后加熱至42 °C保持45s，再在冰中保持Imin，然后加入S0C/LB培養(yǎng)基，在37 °C 振蕩培養(yǎng)60分鐘，培養(yǎng)后離屯、，棄部分上清液后，將剩余液體涂布在含有Amp的瓊脂平板培 養(yǎng)基上培養(yǎng)；
[0072] A4、提取含有CD19CAR基因的質(zhì)粒:從瓊脂平板培養(yǎng)基上挑取881-3-SJ19質(zhì)粒；
[0073] A5、酶切檢測:依次進(jìn)行酶切步驟和連接反應(yīng)檢測所述881-3-SJ19質(zhì)粒的序列;使 用的酶切體系為:2化的881-3-SJ19質(zhì)粒、1化的緩沖液、0.5化的趾Ol酶和6.扣L的d地2〇;使 用的連接體系為:2iiL的慢病毒載體、化L的緩沖液、0.5iiL的甜al酶和6.化L的dd出0
[0074] 其中，凝膠提純CD19CAR擴(kuò)增產(chǎn)物的操作包括W下步驟：
[0075] 1.在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，切碎膠塊。
[0076] 2.稱重膠塊重量，計算膠塊體積，Wlmg =化L計算，向膠塊中加入Buffer GM(3個 凝膠體積量）。
[0077] 3.均勻混合后37°C水浴溶解，此時應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分溶解（約5-10分 鐘)。
[0078] 4.當(dāng)凝膠完全溶解后，觀察溶膠液的顏色，如果溶膠液顏色由黃色變?yōu)槌紊蚍?色，向上述膠塊溶解液中加入3M醋酸鋼溶液(P冊.2) 1化1，均勻混合至溶液恢復(fù)黃色。當(dāng)分 離小于40化P的DNA片段時，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。
[OOW] 5.將試劑盒中的Spin Column安置于Collection l\ibe上。
[0080] 6.將上述操作步驟4的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12,00化pm離屯、I分鐘，棄濾液。 [0081 ] 7.將70化1的Buffer WB加入Spin Column中，室溫12,000巧m離屯、30秒鐘，棄濾液。
[0082] 8.再加入70化1 的BufferWB，將Spin Column安置于Collection l\ibe上，室溫 12， 000巧m離屯、1分鐘。
[0083] 9.將Spin Column安置于新的1.5ml的離屯、管上，在Spin Colu皿膜的中央處加入 30iil滅菌蒸饋水或Elution BuffeH加熱至60°C使用時有利于提高洗脫效率。）室溫靜置1 分鐘。室溫12000巧m離屯、I分鐘洗脫DM。
[0084] 其中，Buffer GM使用量見表1
[0085] 表1:Buffer GM使用量表 r00861
[0087] B、VSVG質(zhì)粒的改造：
[0088] Bl、對0X40基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增：W全基因合成0X40的基因片段為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到0X40擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0089] 步驟Bl中，所述PCR反應(yīng)體系的總體積為50化:包括0.25化的Ex Taq酶、5化的Ex Taq緩沖液、4化的dNTP、2化的模板和4化引物，余量為滅菌水，所使用的dNTP的濃度為 2.5mM，模板的濃度為1 OOng/化，引物的濃度為1 OuM。
[0090] 使用的PCR擴(kuò)增程序為:進(jìn)行25個循環(huán)，其中每個循環(huán)依次包括W下步驟:在98°C 溫度下預(yù)變性IOs，在50°C溫度下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25個循環(huán)之后， 即完成PCR擴(kuò)增程序。
[0091] B2、對VSVG基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增：W全基因合成VSVG的基因片段為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到VSVG擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0092] 所述PCR反應(yīng)體系的總體積為50化:包括0.25化的Ex Taq酶、5化的Ex Taq緩沖液、 4化的dNTP、2化的模板和化L引物，余量為滅菌水，所使用的dNTP的濃度為2.5mM，模板的濃 度為1 OOng/化，引物的濃度為1 OuM。
[0093] 使用的PCR擴(kuò)增程序為:進(jìn)行25個循環(huán)，其中每個循環(huán)依次包括W下步驟:在98°C 溫度下預(yù)變性IOs，在50°C溫度下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25個循環(huán)之后， 即完成PCR擴(kuò)增程序。
[0094] B3、獲得0X40-VSVG重組基因片段:將所述0X40擴(kuò)增產(chǎn)物和VSVG擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶 切，并回收酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，得到連接產(chǎn)物；
[00巧]B4、用0X40-VSVG重組基因片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞:將步驟B3得到的連接產(chǎn)物加入TOPlO感 受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻后依次在冰中保持30min，然后加熱至42°C保持45s，再在冰中保持 Imin，然后加入S0C/LB培養(yǎng)基，在37 °C振蕩培養(yǎng)60分鐘，培養(yǎng)后離屯、，棄部分上清液后，將剩 余液體涂布在瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)；
[0096] B5、改造 VSVG質(zhì)粒的提取:用堿裂解法或質(zhì)粒抽提試劑盒提取改造的VSVG質(zhì)粒，命 名為0X40-VSVG質(zhì)粒；
[0097] C、慢病毒的制備：
[009引 CU配制邸S溶液：將IOml 1.4M的化Cl、5ml 0.5M的邸S、500化150mM的化抽P04和 110化L IM的NaOH混合均勻、加雙蒸水定容至50ml、調(diào)PH至6.95，過濾后保存，即為邸S溶液；
[0099] C 2、配制轉(zhuǎn)染試劑：將步驟A 4得到的8 81 - 3 - S J19質(zhì)粒、NRF質(zhì)粒、步驟B 5得到的 0X40-VSVG質(zhì)粒、IM CaC12和雙蒸水，混合均勻后，逐滴加入步驟Cl得到的邸S溶液，滴加完 畢后，靜置30min;即得轉(zhuǎn)染試劑；
[0100] C3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和培養(yǎng):提前兩周復(fù)蘇293T細(xì)胞，在IOcm培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每日觀 察細(xì)胞；待細(xì)胞鋪滿2層左右，將1盤細(xì)胞消化傳代至10盤，每日觀察，至細(xì)胞密度達(dá)皿底 70 %左右時可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，用8ml不含血清的DMEM培養(yǎng)基換液;換液后，逐滴加入步驟 C2得到的轉(zhuǎn)染試劑，緩緩吹打混勻W上轉(zhuǎn)染試劑，每盤細(xì)胞取Iml該試劑，逐滴均勻地加入 到已換液的293T細(xì)胞中。將培養(yǎng)皿前后方向、左右方向各輕輕晃動數(shù)十次混勻，將細(xì)胞放入 培養(yǎng)箱，靜置2小時。每盤細(xì)胞補(bǔ)加 Iml胎牛血清，逐滴均勻地加入后，將培養(yǎng)皿前后方向、左 右方向各輕輕晃動數(shù)十次混勻，將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱。約化后，每盤細(xì)胞用IOml含10%胎牛血 清的DMEM換液，將培養(yǎng)箱的C02濃度調(diào)整為3% ;
[0101] C4、病毒收集：步驟C3完成后，收集上清（共100ml)，1200rpm離屯、5min，0.2化m (PES)濾膜過濾上清，即為病毒原液。
[0102] C5、病毒效價檢測：用病毒效價檢測試劑盒檢測病毒效價，檢測結(jié)果約為lOVml， 病毒效價的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，病毒效價的檢測結(jié)果如表2所示：
[0103] 表2:病毒效價的檢測結(jié)果表 「01041
[0106] 慢病毒感染T細(xì)胞及效果檢測
[0107] 1、機(jī)采獲取約1 X IO7個單核淋己細(xì)胞；Ficoll分離出單個核細(xì)胞，加含IL-2 (lOOOU/ml)的vivol5培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，加少量CD3抗體刺激（lOOug/ml)。感染前將細(xì)胞濃度 調(diào)整為1 X IO^ml，取體積Iml，6孔板內(nèi)培養(yǎng);按MOI = 5來計算病毒量，加入病毒濃縮液前， 加入1ml完全培養(yǎng)液懸浮，0.22um過濾。加入病毒后，輕輕混勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天后，洗去 病毒繼續(xù)培養(yǎng)。
[010引 2、感染效率檢測
[0109] 收集5 X 1〇5細(xì)胞；用buff er(PBS+2%BSA)洗S次；細(xì)胞重懸于200化的buff er，加 Iug的protein kbiotin，4°C45min;用buffer洗一次；細(xì)胞重懸于200化的buffer，加 IOuL 的SA-PE(加 g/ml)，同時加化LCD3-APC，避光，4 °C 25min;用buf f er洗一次，用buf f er懸浮至 流式檢測陽及APC巧光。VSVG重組后，感染效率由35 %提高至89 %，增加50 % W上，結(jié) 果如圖5-圖8所示。
[0110] 3、活化效率檢測
[011U 收集2 X 105細(xì)胞；用buff er(PBS+2%854)洗；次；細(xì)胞重懸于200化的buff er，加 2ug的CD69-門TC，4°C避光解育30min;用buff er洗一次，用buf fer懸浮至200化;流式檢測巧 光。活化效率約為55%，可見改造后的慢病毒可W有效激活T細(xì)胞，結(jié)果如圖9所示。
[0112]最后所應(yīng)說明的是，W上實施例僅用W說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參 照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，W上所述僅為本發(fā)明的具體實施 方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修 改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 「rn 1










【主權(quán)項】
1. 一種包含0X40的慢病毒制備方法，其特征在于，包括以下步驟： A、 慢病毒載體質(zhì)粒881-3-SJ19的構(gòu)建： Al、對⑶19CAR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增：以全基因合成⑶19CAR基因為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 到CD19CAR擴(kuò)增產(chǎn)物； A2、凝膠提純CD19CAR擴(kuò)增產(chǎn)物:使用凝膠提純PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中CD19CAR的cDNA; A3、用CD19CAR基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞：將步驟A2中得到的CD19CAR的cDNA、18-T Vector和 Solution I混合均勻，在16°C下保存16小時;然后加入Trans5a感受態(tài)細(xì)胞中，依次在冰中 保持30min，然后加熱至42 °C保持45s，再在冰中保持Imin，然后加入S0C/LB培養(yǎng)基，在37 °C 振蕩培養(yǎng)60分鐘，培養(yǎng)后離心，棄部分上清液后，將剩余液體涂布在含有Amp的瓊脂平板培 養(yǎng)基上培養(yǎng)； A4、提取含有⑶19CAR基因的質(zhì)粒:從瓊脂平板培養(yǎng)基上挑取881-3-SJ19質(zhì)粒； B、 VSVG質(zhì)粒的改造： Bl、對0X40基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增：以全基因合成0X40的基因片段為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 到0X40擴(kuò)增產(chǎn)物； B2、對VSVG基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增：以全基因合成VSVG的基因片段為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 到VSVG擴(kuò)增產(chǎn)物； B3、獲得0X40-VSVG重組基因片段:將所述0X40擴(kuò)增產(chǎn)物和VSVG擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并 回收酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，得到連接產(chǎn)物； B4、用0X40-VSVG重組基因片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞:將步驟B3得到的連接產(chǎn)物加入T0P10感受態(tài) 細(xì)胞中，混合均勻后依次在冰中保持30min，然后加熱至42 °C保持45s，再在冰中保持Imin， 然后加入S0C/LB培養(yǎng)基，在37 °C振蕩培養(yǎng)60分鐘，培養(yǎng)后離心，棄部分上清液后，將剩余液 體涂布在瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)； B5、改造 VSVG質(zhì)粒的提取:用堿裂解法或質(zhì)粒抽提試劑盒提取改造的VSVG質(zhì)粒，命名為 0X40-VSVG質(zhì)粒； C、 慢病毒的制備： C1、配制BES溶液：將IOml 1.4M的NaCl、5ml 0.5M的BES、500yL 150mM的Na 2HP〇4和 1100 yL IM的NaOH混合均勻、加雙蒸水定容至50ml、調(diào)PH至6.95，過濾后保存，即為BES溶液； C2、配制轉(zhuǎn)染試劑：將步驟A4得到的881-3-SJ19質(zhì)粒、NRF質(zhì)粒、步驟B5得到的0X40-VSVG質(zhì)粒、IM CaCl2和雙蒸水，混合均勻后，逐滴加入步驟Cl得到的BES溶液，滴加完畢后， 靜置30min;即得轉(zhuǎn)染試劑； C3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和培養(yǎng):復(fù)蘇293T細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)所述293T細(xì)胞密度達(dá)到培養(yǎng)皿底部 70 %時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基對所述293T細(xì)胞進(jìn)行換液;換液后，逐滴加入步 驟C2得到的轉(zhuǎn)染試劑，混合均勻后，將所述293T細(xì)胞放入培養(yǎng)箱，靜置2小時，靜止后滴加胎 牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)8小時，然后使用含IOwt %胎牛血清的DMEM換液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時； C4、病毒收集:步驟C3完成后，收集上清液，離心過濾后，即得病毒原液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒制備方法，其特征在于，步驟Al中，所述PCR反應(yīng)體系的 總體積為50yL:包括0 · 25yL的Ex Taq酶、5yL的Ex Taq緩沖液、4yL的dNTP、2yL的模板和4yL 引物，余量為滅菌水，所使用的dNTP的濃度為2.5mM，模板的濃度為lOOng/yL，引物的濃度為 IOuM03. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒制備方法，其特征在于，步驟Al中，使用的PCR擴(kuò)增程序 為:進(jìn)行25個循環(huán)，其中每個循環(huán)依次包括以下步驟:在98°C溫度下預(yù)變性10s，在50°C溫度 下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25個循環(huán)之后，即完成PCR擴(kuò)增程序。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒制備方法，其特征在于，步驟A4完成之后，還包括A5、酶 切檢測：依次進(jìn)行酶切步驟和連接反應(yīng)檢測所述881-3-SJ19質(zhì)粒的序列；使用的酶切體系 為：2yL的881-3-SJ19質(zhì)粒、IyL的緩沖液、0.5yL的XhoI酶和6.5yL的ddH 20;使用的連接體系 為:2yL的慢病毒載體、IyL的緩沖液、0.5yL的Xba頂每和6.5yL的ddH 20。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒制備方法，其特征在于，步驟BI中，所述PCR反應(yīng)體系的 總體積為50yL:包括0 · 25yL的Ex Taq酶、5yL的Ex Taq緩沖液、4yL的dNTP、2yL的模板和4yL 引物，余量為滅菌水，所使用的dNTP的濃度為2.5mM，模板的濃度為lOOng/yL，引物的濃度為 IOuM06. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒制備方法，其特征在于，步驟Bl中，使用的PCR擴(kuò)增程序 為:進(jìn)行25個循環(huán)，其中每個循環(huán)依次包括以下步驟:在98°C溫度下預(yù)變性10s，在50°C溫度 下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25個循環(huán)之后，即完成PCR擴(kuò)增程序。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒制備方法，其特征在于，步驟B2中，所述PCR反應(yīng)體系的 總體積為50yL:包括0 · 25yL的Ex Taq酶、5yL的Ex Taq緩沖液、4yL的dNTP、2yL的模板和4yL 引物，余量為滅菌水，所使用的dNTP的濃度為2.5mM，模板的濃度為lOOng/yL，引物的濃度為 IOuM08. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒制備方法，其特征在于，步驟B2中，使用的PCR擴(kuò)增程序 為:進(jìn)行25個循環(huán)，其中每個循環(huán)依次包括以下步驟:在98°C溫度下預(yù)變性10s，在50°C溫度 下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25個循環(huán)之后，即完成PCR擴(kuò)增程序。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒制備方法，其特征在于，步驟步驟C4完成之后，還包括 C5、病毒效價檢測：用病毒效價檢測試劑盒檢測病毒效價。10. 權(quán)利要求1-9任一所述慢病毒制備方法制備得到的慢病毒在感染T細(xì)胞中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/867GK105925543SQ201610482297
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月27日
【發(fā)明人】董堅, 楊益, 劉玉芝, 何群, 羅繼薇
【申請人】武漢思安醫(yī)療技術(shù)有限公司