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      蘋果銹果類病毒分子標準樣品及其制備方法

      文檔序號:10565377閱讀:823來源:國知局
      蘋果銹果類病毒分子標準樣品及其制備方法
      【專利摘要】本發(fā)明提供一種蘋果銹果類病毒分子標準樣品及其制備方法,具體包括ASSVd的原料選取、標準樣品的制備、均勻性和穩(wěn)定性檢查、定性檢定、定值等過程。所述標準樣品的制備方法包括:由ASSVd病毒液中提取病毒RNA、RT?PCR反應(yīng)擴增并純化目的基因片段、目的片段的連接轉(zhuǎn)化;回收質(zhì)粒的步驟。本發(fā)明的蘋果銹果類病毒標準樣品穩(wěn)定性高、均勻性好,適用于對蘋果銹果類病毒進行快速檢測確證,為蘋果銹果類病毒的檢測研究、農(nóng)藥研究、應(yīng)用研究提供了標準樣品的需求,可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境中的疫情監(jiān)控及進出口貿(mào)易中該類病毒的監(jiān)測及檢測。使用本發(fā)明的標準樣品可以實現(xiàn)不同實驗室結(jié)果的比對,從而保證實驗室的質(zhì)量控制。
      【專利說明】
      蘋果誘果類病毒分子標準樣品及其制備方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      [0001] 本發(fā)明屬于檢測用病毒標準品及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域,具體設(shè)及蘋果誘果類病毒 標準樣品及其制備方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 類病毒(Viroid)是一種最小的具有侵染性的致病病原,它是由247~375核巧酸組 成的單鏈、共價閉合的環(huán)狀RNA,能引起許多經(jīng)濟作物產(chǎn)生嚴重病害。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的類病毒已 超過30種,其核酸含有246~399個核巧酸,根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)的同源性、復(fù)制特性分為2個組, 分別為馬鈴馨紡鍵塊莖類病毒組(PSTVd)和鱷梨日斑類病毒組(ASBVd)。蘋果誘果類病毒 (Apple scar skid viroid,ASSVd)歸于蘋果誘果類病毒屬(Apscaviroid),粒體由330個核 巧酸組成。蘋果誘果類病毒的侵染寄主是蘋果和梨。感病的蘋果因品種和環(huán)境條件的變化 表現(xiàn)出5種顯性病癥:誘果型、花臉型、誘果-花臉型、環(huán)斑型和綠點型,感病的梨大多數(shù)表現(xiàn) 為隱性,少數(shù)為崎形果。由于類病毒在寄主植物細胞核中復(fù)制和累積,在感病寄主的葉、莖、 皮、化木,W及果實的表皮、果肉和種子中均可檢測出類病毒。因此,感染類病毒的果樹終生 帶毒,并通過嫁接和修剪工具傳染的途徑使類病毒病蔓延。許多國家的蘋果樹和梨樹中均 發(fā)現(xiàn)ASSVd的危害,我國東北、西北、華北,W及江蘇、安徽、山西和山東等地亦有發(fā)生。目前 尚未有蘋果誘果類病毒的檢測鑒定方法的規(guī)范性操作規(guī)程。因此,規(guī)范蘋果誘果類病毒的 檢測鑒定方法一般操作規(guī)程,對于提高蘋果誘果類病毒的檢疫檢驗效率、防止蘋果誘果類 病毒的傳入、傳出,保護我國農(nóng)業(yè)的安全生產(chǎn),促進我國農(nóng)產(chǎn)品的順利出口,具有十分重要 的意義。植物類病毒由于不顯性侵染比較普遍,癥狀表現(xiàn)受環(huán)境溫度的影響較大,而且?guī)追N 鑒別植物對不同類病毒的反應(yīng)癥狀相似,故難于應(yīng)用生物測定的方法。由于類病毒不能產(chǎn) 生任何蛋白質(zhì),所W也不能使用檢測病毒的血清學(xué)方法。因此,選用RT-PCR方法對蘋果誘果 類病毒進行檢測。
      [0003] 系統(tǒng)內(nèi)送檢種苗的樣品通常眼觀來看都比較健康,而蘋果誘果類病毒通常只有在 適宜的條件下才能發(fā)病,而且現(xiàn)在用的PCR方法只能從重度感染表現(xiàn)出癥狀的植物中檢出 病毒,無法檢測潛在的病毒。隨著進出口貿(mào)易的增大,檢驗流程時限要求縮減,植物病毒疫 病多數(shù)要進行分子生物學(xué)檢測,現(xiàn)行的國家和行業(yè)標準,都需要標準陽性毒株或陽性對照 質(zhì)控物進行實驗質(zhì)控,運些陽性毒株的引進需要辦理復(fù)雜的審批手續(xù),購置費用昂貴,難度 較大,因此普通的植物疫病實驗室很難得到該病毒,對實驗室的質(zhì)量控制及研究帶來了極 大的挑戰(zhàn)。
      [0004] 為了幫助實驗室建立規(guī)范的質(zhì)量保證,植物病毒及類病毒的標準樣品研制工作一 直在開展中。目前,國內(nèi)外還沒有關(guān)于該種植物類病毒標準樣品的研究。我們將首次開發(fā)可 用于快速檢測蘋果誘果類病毒的分子標準樣品及制備技術(shù)。本標準樣品的研制成功,不僅 為檢測研究、醫(yī)藥研究、應(yīng)用研究提供了標準樣品的需求,同時為檢驗檢疫機構(gòu)技術(shù)指導(dǎo)、 服務(wù)出口企業(yè)提供技術(shù)上的支持。該發(fā)明成果將有望成為植物疫病分子診斷領(lǐng)域的突破性 產(chǎn)品及技術(shù),是植物流行病學(xué)檢測技術(shù)體系的進一步完善和發(fā)展。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定性高、均勻性好的蘋果誘果類病毒分子標準樣品 及其制備方法。
      [0006] 為了得到所述蘋果誘果類病毒分子標準樣品,根據(jù)蘋果誘果類病毒(ASSVd)基因 全序列,設(shè)計全序列及特異性引物,其堿基序列如下:
      [0007] 沈Q ID N0:1:GTAAACACCGTGCGGTTCCT [000引 沈Q ID N0:2:AAGAGCGTGAGAGAACAGGG
      [0009] 本發(fā)明的蘋果誘果類病毒分子標準樣品,采用如下方法制備:
      [0010] (1)采集感染蘋果誘果類病毒的植物組織,液氮研磨;
      [0011] (2)步驟(1)得到的植物組織中提取得到病毒RNA;
      [0012] (3)步驟(2)的病毒RNA作為PCR反應(yīng)模板,進行RT-PCR擴增反應(yīng),其中PCR反應(yīng)的正 反引物分別為沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:2;
      [OOU] (4)將步驟(3)的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至PGEM-T載體中,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感 受態(tài)細胞后,LB平板培養(yǎng),篩選得到陽性克?。?br>[0014] (5)陽性克隆中提取得到質(zhì)粒,即為蘋果誘果類病毒的標準樣品;
      [001引上述制備方法中,在步驟(4)中篩選陽性克隆的方法為RT-PCR方法,其中RT-PCR反 應(yīng)的正反引物分別為SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2
      [0016] 本發(fā)明的蘋果誘果類病毒分子標準樣品穩(wěn)定性高、均勻性好,為蘋果誘果類病毒 的檢測研究、醫(yī)藥研究、應(yīng)用研究提供了標準樣品的需求,同時為檢驗檢疫機構(gòu)技術(shù)指導(dǎo)、 服務(wù)出口企業(yè)提供技術(shù)上的支持。使用本發(fā)明的標準樣品可W實現(xiàn)不同實驗室結(jié)果的比 對,從而保證實驗室的質(zhì)量控制。
      【附圖說明】
      [0017] 圖1為實施例1中AS SVd目標基因的PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖,其中M : 化2000Marker,1~9:空白質(zhì)粒及健康對照;10: PCR擴增產(chǎn)物擴增出273bp大小的片段。
      [001引圖2為是本發(fā)明標準樣品靈敏度檢測結(jié)果圖,其中由左到右,依次是10-1,10-2,10 -3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8。
      【具體實施方式】
      [0019] 下述非限制性實施例可W使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明,但不W 任何方式限制本發(fā)明。蘋果誘果類病毒分子標準樣品及其制備方法按如下步驟進行:
      [0020] 實施例1蘋果誘果類病毒分子標準樣品的制備
      [0021] (1)提取病毒 RNA;
      [0022] 采集0.1 g感染蘋果誘果類病毒的植物組織加液氮研磨成粉末狀,將研磨物迅速移 入1.5mL離屯、管中,加入ImL Trizol Reagent,顛倒混勻,2°C~8°C,12000g,離屯、lOmin。取 上清,15°C~30°C,放置5min;加入0.2mL氯仿,用手劇烈震蕩(勿滿旋振蕩),15s。15°C~30 。(:,放置2min~3min;2°C~8°C,12000g,離屯、15min。小屯、吸取約為600化的上層水相,勿擾 動中間相和下層相。加500化異丙醇混合上清液,15°C~30°C,放置1 Omin。2°C~8°C, 12000g,離屯、IOmin。去除上清液,沉淀中加入ImL 75 %乙醇,洗涂;2 °C~8 °C,7500g,離屯、 5min。去除上清液,沉淀自然干燥后,將其溶于30化~50化無腳aSe的水中,即為待檢模板 RNA。
      [0023] (2)目標基因的擴增
      [0024] 步驟(1)的病毒RNA作為PCR反應(yīng)模板,本發(fā)明自行設(shè)計引物,進行RT-PCR擴增反 應(yīng),擴增蘋果誘果類病毒基因全序列,大小為273bp的片段,其中PCR反應(yīng)的正反引物序列如 下:
      [00巧]沈Q ID N0:1:GTAAACACCGTGCGGTTCCT [00%] SEQ ID N0:2:AAGAGCGTGAGAGAACAGGG
      [0027] 擴增溶液中加入2 XRT-PCR buffer( 10倍聚合酶鏈式Mix反應(yīng)液)12.扣L,lOpmol/ yL SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2各0.扣L,將提取的待測樣品RNA加入反應(yīng)體系中,DEPC水補 足體積至25化,PCR循環(huán)條件為:481:3〇111111,94°(:預(yù)變性5111111后,進入94°(:變性3〇3,55°(:退 火40s,72°C延伸45s,共循環(huán)35次;然后72°C再延伸IOmin.
      [0028] 將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,取2g瓊脂糖,于IOOmL電泳緩沖液中加熱,充分溶 化,加入漠化乙錠膽存液至終濃度為0.化g/mL,制膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液,使液面 剛剛沒過凝膠;將化L~化L PCR擴增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合,點樣;9V/cm恒壓電 泳,直至漠酪藍指示劑遷移至凝膠中部;紫外檢測儀下觀察電泳結(jié)果,待檢田間樣品能夠擴 增出預(yù)期條帶,擴增條帶為273bp,電泳結(jié)果見圖1。
      [0029] (3)目標基因的序列測定
      [0030] 將PCR擴增產(chǎn)物送寶生物(大連)有限公司進行測序,測序結(jié)果如SEQ ID NO.3。將 所得序列通過NCBI在線nucleotide blast分析,結(jié)果表明:該核巧酸序列與蘋果誘果類病 毒(ASSVD)的核酸序列相似性最高達99%,為蘋果誘果類病毒基因全序列。
      [0031] (4)目標基因的純化
      [0032] 將步驟(2)中PCR擴增產(chǎn)物采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑盒(貨號DV805A),并按其操作說明回收目標分子DM片段,即SEQ ID NO.3所示 的ASSVd基因全序列。
      [0033] (5)目的片段的連接轉(zhuǎn)化
      [0034] 在步驟(4)中純化得到的目的片段化L,2XRapid ligation buffer扣L,PGEM-T 載體0.扣L,T4DNA Ligase 0.扣L,用無菌水補充至10化,室溫連接Ih。將連接產(chǎn)物加入到制 備好的感受態(tài)細胞E. COl i JM109中,輕輕用移液器混勻,冰浴20min,42°C熱應(yīng)激Imin,冰浴 2min,加入800化SOC培養(yǎng)基,150g搖菌1.化,1000 g離屯、IOmin,棄去培養(yǎng)液,加入新鮮的SOC 培養(yǎng)基20化L,混勻后涂在含有Amp+的LB平板上,風(fēng)干后,37°C倒置培養(yǎng)12h-16h。
      [0035] 挑取單克隆菌在LB培養(yǎng)液中進行培養(yǎng),用PCR方法進行陽性克隆的篩選,PCR體系 及反應(yīng)條件見步驟3的(2)。將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳鑒定,結(jié)果獲得了與預(yù)期大小一致 的273bp片段。
      [0036] 應(yīng)用Omega公司質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit I(IOOtest),提取純化上述步 驟中篩選得到的陽性克隆,獲得重組質(zhì)粒PGEM-T-ASSVD,每支EP管分裝成10化L,每支重組 質(zhì)粒含量為化g,即為蘋果誘果類病毒分子標準樣品。
      [0037] 實施例2蘋果誘果類病毒分子標準樣品的均勻性實驗
      [0038] 蘋果誘果類病毒分子標準樣品的均勻性測定是將如實施例1的方法制備的ASSVd 分子標準樣品隨機分成兩個樣品組,即樣品組A和樣品組B,每個樣品組各有15個標準樣品, 每個樣品按照如下反應(yīng)條件進行PCR擴增,測定PCR產(chǎn)物濃度(ng AiL ),通過比較PCR產(chǎn)物的 濃度變化,按照統(tǒng)計學(xué)方法評價標準樣品的均勻性,
      [0039] PCR反應(yīng)體系:反應(yīng)管中加入蘋果誘果類病毒分子標準樣品1化(含IX ICT2Wg DNA),2XPCR buffer(l〇 倍聚合酶鏈式 Mix 反應(yīng)液)12.扣L,10pmolAiL 沈 Q ID N0:1 和沈 Q ID NO: 2各0. ,DEPC水補足體積至25化。
      [0040] PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性5min后,進入94°C變性30s,55°C退火30s,72°C延伸30s, 共循環(huán)35次;然后72°C再延伸lOmin。
      [0041] 結(jié)果如表1,2和3。
      [0042] 表1蘋果誘果類病毒分子標準樣品均勻性測定結(jié)果
      [0045] 表2蘋果誘果類病毒分子標準樣品均勻性評價結(jié)果
      [0043]
      [0044]
      [0046]
      [i
      [i
      [i
      [0050]從表1及其統(tǒng)計結(jié)果(表2和表3)的結(jié)果可知,兩個樣品組之間不存在顯著差異,可 W認為樣品是均勻的。
      [0051 ]實施例3蘋果誘果類病毒分子標準樣品的穩(wěn)定性實驗
      [0052] 將實施例1的方法制備的蘋果誘果類病毒分子標準樣品隨機分組,每個樣品按照 實施例2所述的PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件下進行PCR擴增,測定PCR產(chǎn)物濃度(ng/化),通 過比較PCR產(chǎn)物的濃度變化,按照統(tǒng)計學(xué)方法評價標準樣品的穩(wěn)定性。
      [0053] 采用兩種類型的穩(wěn)定性試驗:
      [0054] -種是在-20°C下的穩(wěn)定性試驗,隨機取蘋果誘果類病毒分子標準樣品24份,每個 月檢測2份,連續(xù)12個月,結(jié)果如表4。
      [0055] 另一種是在較高的溫度20°C下的穩(wěn)定性試驗,隨機取蘋果誘果類病毒分子標準樣 品12份,每周檢測3份,連續(xù)4周,測試結(jié)果如表5。
      [0056] 表4.穩(wěn)定性檢驗實驗(-20。〇
      [0化7]
      [0060]
      [0化引對表4結(jié)果的F檢驗結(jié)果為F= 1.9524,F(xiàn)葡.O日=4.2838,F(xiàn)<F虹[日.日日,日,日],即樣品間無 顯著性差異。[0059] 表5.穩(wěn)定性檢驗實驗(2(TC)結(jié)果
      [0061]
      [0062]
      [0063]
      [0064] 對表6結(jié)果方差分析結(jié)果為F= 1.4883,F(xiàn)表日.0日=4.0661,F(xiàn)<F虹[日.日日,日,日],即樣品間 無顯著性差異。
      [0065] 實施例4定值方法
      [0066] 由實施例1的方法制備的蘋果誘果類病毒分子標準樣品隨機選15個,每個樣品按 照實施例2所述,用蘋果誘果類病毒聚合酶鏈反應(yīng)方法進行定值試驗,結(jié)果完全一致,均為 蘋果誘果類病毒核酸陽性。
      [0067] 本蘋果誘果類病毒分子標準樣品經(jīng)福建檢驗檢疫局、煙臺檢驗檢疫局、甘肅檢驗 檢疫局、廣東檢驗檢疫局等協(xié)作試驗定值結(jié)果統(tǒng)計見表7。
      [006引表7.協(xié)作試驗定值結(jié)果表
      [0069]
      [0070] 應(yīng)用蘋果誘果類病毒聚合酶鏈反應(yīng)方法對本標準樣品的定值實驗結(jié)果均為蘋果 誘果類病毒核酸陽性。
      【主權(quán)項】
      1. 一種蘋果銹果類病毒的標準樣品,其特征在于,制備步驟包括: (1) 采集感染蘋果銹果類病毒的植物組織,液氮研磨; (2) 步驟(1)得到的植物組織中提取得到病毒RNA; (3) 步驟(2)的病毒RNA作為PCR反應(yīng)模板,進行RT-PCR擴增反應(yīng),其中PCR反應(yīng)的正反引 物分別為SEQ ID NO: 1 和SEQ ID NO:2; (4) 將步驟(3)的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至PGEM-T載體中,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài) 細胞后,LB平板培養(yǎng),篩選得到陽性克隆; (5) 陽性克隆中提取得到質(zhì)粒,即為蘋果銹果類病毒的標準樣品; 其中所述感受態(tài)細胞為E.coli JM109。2. -種利用權(quán)利要求1所述方法制備的蘋果銹果類病毒標準樣品。
      【文檔編號】C12Q1/70GK105925571SQ201610334625
      【公開日】2016年9月7日
      【申請日】2016年5月19日
      【發(fā)明人】張成標, 吳興海, 孫敏, 李明哲, 趙麗青, 尼秀媚, 唐靜, 鄭小龍
      【申請人】山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
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