蓮纖維素合酶基因NnuCESA8的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種蓮纖維素合酶基因NnuCESA8的應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明得到了蓮基因NnuCESA8轉(zhuǎn)擬南芥cesa8純合突變體的陽性轉(zhuǎn)基因植株。然后通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將蓮中的NnuCESA8基因轉(zhuǎn)入到相應(yīng)的擬南芥突變體中檢測其功能互補(bǔ)情況，推斷該基因的功能表達(dá)情況，以便后續(xù)有目的性的通過轉(zhuǎn)基因改良林木纖維素的比率，提高可利用性。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因植株、純合突變體植株與野生型植株對比，發(fā)現(xiàn)該基因能部分互補(bǔ)擬南芥cesa8純合突變體的表型，具有纖維素合酶的功能，促進(jìn)纖維素的合成，并確定該基因參與植物次生細(xì)胞壁中纖維素的合成。
【專利說明】
蓮纖維素合酶基因 NnuCESAS的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種纖維素合酶基因的應(yīng)用，特別涉及 一種蓮纖維素合酶基因NnuCESAS的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是細(xì)胞壁的主要組成成分之一，也是評價(jià)造紙?jiān)闲阅軆?yōu)劣的一個(gè)重要指 標(biāo)。植物細(xì)胞壁主要纖維素、半纖維素、木質(zhì)素蘭大成分組成，這蘭大組分是地球上最豐富 的可再生資源，而纖維素是細(xì)胞壁的第一大組分，由均一的化喃式D-葡萄糖，4糖骨鍵 連接而成，其葡萄糖殘基約2000~25000個(gè)（Pauly !,Keegstra K(2010)Plant cell wall polymers as precursors for biofuels.Current Opinion in Plant Biology,95:305- 312;Pauly M，Keegstra K(2008)Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels^llie Plant Journal,54(4):559-568)d而這種目-1,4糖骨鏈由 纖維素合酶催化合成。
[0003] Richmond和Somerville在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)了 10個(gè)纖維素合酶的編碼基因（現(xiàn)命名 為AtCESA)(Richmond T A,Somerville C R.(2000)The cellulosesynthase supei^famiIyI.Plant Physiology，124:496-498)DAtCESAl，AtCESA2，AtCESA3，AtCESA5， AtCESA6和AtCESA9與植物初生壁的生物合成有關(guān)(Arioli T，Peng L，Betzner A，et al. (1998)Molecularanalysis of cellulose biosynthesis in Arabidopsis.Science，279: 717-720;Burn J E，et al.Functional analysis of the cellulose synthase genes CESAl,CESA2,and CESA3 in arabidopsis.Plant Physiology,129(2):797-807；Pagant S，et al.(2002)K0BIT01 encodes a novel plasma membrane protein necessary for normal synthesis of cellulose during cell expansion in arabidopsis.The Plant Cell Online，14(9): 2001-2013)，次生壁纖維素合酶基因復(fù)合體由AtCESA4，AtCESA7和 AtCESAS構(gòu)成，這些基因的突變體都表現(xiàn)為:t丹塌的木質(zhì)部（irregular巧Iem，irxKTurner S 民，Somerville C 民.（1997)Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall.Plant Cell,9:689-701；Szyjanowicz P M J,Mckinnon !,Taylor N G,et al.(2004)The irregular xylem 2 mutant is an allele of korrigan that affects the secondary cell wall of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal，37(5): 730-740)。擬南芥 cesa4突變體和cesaS突變體次生細(xì)胞壁中的纖維素沉積出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷導(dǎo)致植株出現(xiàn)巧塌 的木質(zhì)部細(xì)胞（Turner S R, Somerville C R(1997)Collapsed 巧Iem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondaiT cell wall.Plant Cell，9:689-701;Taylor N G，Howells R M，Huttly A K，et aI. (2002)Interact ions among three distinct CesA proteins essential for cellulose syn化esis?100(3):1450-1455)D
[0004] 目前，CESA的功能推測主要來自于基因表達(dá)、UDP-G結(jié)合實(shí)驗(yàn)（Pear J R，Kawagoe Y,Schreckengost W E,et al.(1996)Higher plants contain homologs of the bacterial ce IA genes encoding the catalytic subunit of cellulose synthase.Proc 化tl Acad Sci U S A，93(22): 12637-12642)、突變分析（Fagard M, Desnos T,Desprez T,et al.(2000)PR0CUSTE1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of Arabidopsis.The Plant Cell,12(12):2409-2424)及基因沉默實(shí)驗(yàn) (Burton et al,2000)。
[0005] 蓮(NeIumbo nucifera)屬睡蓮科(Nymphaeaceae)蓮屬(Nelumbo)多年生水生宿根 草本植物。蓮葉柄中含有大量的纖維素，從中間折斷可拉出大量細(xì)長而有初性的蓮纖維。蓮 纖維的性能非常特殊，Pan等報(bào)道，兩段斑開的葉柄之間的纖維絲能被拉長至少十厘米而不 斷開，每根纖維絲由二十根左右的細(xì)纖維絲組成，平行并W螺旋形式的分布在蓮葉柄的導(dǎo) 管分子中（Pan Y,Han G,Mao Z(2011)The anatomy of lotus fibers found in petioles of Nelumbo nucifera.Aquatic Botany,95:167-171)。蓮纖維絲的成分中纖維素、半纖維 素、木質(zhì)素的含量分別是41.4±0.29%，25.87±0.64%，19.56±0.32%。日11￥，化110，]\&1〇 2(2011)Structur曰1 characteristics and physic曰I properties of lotus fibers obtained from Nelumbo nucifera petioles.hrbohyd Polym,85:188-195)。克隆出蓮的 纖維素合酶基因，并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究其功能表達(dá)，將有利于深入研究蓮纖維絲及纖維 素的合成機(jī)理，進(jìn)而有目的地利用蓮纖維素合酶基因去改善一些林木樹種用于增加其纖維 素含量，提高可利用性。
[0006] 蓮W及蓮纖維絲的藥學(xué)應(yīng)用、化學(xué)性能和物理結(jié)構(gòu)均被研究并報(bào)道過，也有蓮基 因水平的研究，蓮的基因組于2013年公布（Ray !,Robert V，化nling L，et al.(2013) Genome of the long-living sacred lotus(Nelumbo nucifera Gaertn.).Genome Biology, 14(5) :R41)，運(yùn)為蓮相關(guān)基因的克隆與功能研究提供了便利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種蓮纖維素合酶基因 NnuCESAS的應(yīng)用。鑒于蓮的葉柄中含有大量纖維絲且葉柄內(nèi)部、外部纖維素含量不一致的 現(xiàn)象，為從基因表達(dá)程度方面入手進(jìn)行深入研究其纖維素合成，將蓮葉柄內(nèi)、外和葉片=個(gè) 部位做轉(zhuǎn)錄組測序，進(jìn)而研究其纖維素合酶基因的表達(dá)。本發(fā)明的主要目的是將轉(zhuǎn)錄組中 發(fā)現(xiàn)的一段在葉柄部位表達(dá)量比較高的纖維素合酶基因的表達(dá)情況。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得到 的序列設(shè)計(jì)引物W蓮葉柄總CDNA為模板將此基因克隆出來并進(jìn)行測序，對測序結(jié)果行 BLAST,發(fā)現(xiàn)其與擬南芥的AtCESAS基因序列相似度最高，因此我們將之命名為NnuCESAS。然 后從A服C(Arabidopsis Biological Resource Center)訂購到擬南芥cesaS突變體（5日化_ 046685c)，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將蓮中的化UCESA8基因轉(zhuǎn)入到相應(yīng)的擬南芥突變體中檢測其 功能互補(bǔ)情況，推斷該基因的功能表達(dá)情況，W便后續(xù)有目的性的通過轉(zhuǎn)基因改良林木纖 維素的比率，提高可利用性。本發(fā)明通過構(gòu)建過表達(dá)載體及通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來研究其功能 表達(dá)，確定該基因具有纖維素合酶功能并促進(jìn)植物次生細(xì)胞壁的纖維素合成。
[0008] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 本發(fā)明提供一種蓮纖維素合酶基因化UCESA8在促進(jìn)纖維素合成中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明提供一種蓮纖維素合酶基因NnuCESAS在促進(jìn)次生細(xì)胞壁中纖維素合成中 的應(yīng)用。
[0011] 所述的蓮纖維素合酶基因化UCESA8的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0012] 所述的蓮纖維素合酶基因化UCESA8的核巧酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0013] 上述應(yīng)用的具體過程如下：
[0014] 1.基因的獲得
[0015] 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到了 15個(gè)蓮的CESA基因序列，對運(yùn)15個(gè)CESA基因進(jìn)行了RT- qPCR，發(fā)現(xiàn)其中一條序列表達(dá)量特別高并且在葉柄內(nèi)外部位表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉片，根據(jù)轉(zhuǎn) 錄組測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物W蓮葉柄總CDNA為模板將此基因克隆出來并進(jìn)行測序，對測序結(jié)果 行BLAST,發(fā)現(xiàn)本序列與擬南芥的AtCESAS序列相似度最高，因此我們猜測其與次生細(xì)胞壁 纖維素的合成密切相關(guān)，并將該基因命名為NnuCESAS,進(jìn)而捜索已公布的蓮基因組序列，發(fā) 現(xiàn)本基因序列與NNU_08388序列相同。
[0016] 所述的引物序列如下：
[0017] PfeuCESAS-F: 5^GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGATGGAGTCCGGGGTCC-3^
[001 引 化 UCESA8-R: S^ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaacaatcaatagaaatgcagc- 3'。
[0019] 2.載體的構(gòu)建
[0020] 將擴(kuò)增的NnuCESAS的CDNA構(gòu)建至過表達(dá)載體pEarlyGatelOO中組成雙元表達(dá)載 體，得到過表達(dá)重組質(zhì)粒;該載體攜帶花挪菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子，并具有除草劑 抗性，可供轉(zhuǎn)基因植物的篩選。
[0021] 3.轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0022] 將上述得到的過表達(dá)重組質(zhì)粒采用凍融法轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101中，選取陽性 菌并保存，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染擬南芥。
[0023] 4. W擬南芥cesaS雜合突變體進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因操作：
[0024] 由于擬南芥cesaS純合突變體植株矮小，果芙崎形，幾乎不結(jié)種子，故選用無表型 的cesaS雜合突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因并收取種子W備下一代陽性植株篩選，將上述得到的含有 目的基因的陽性農(nóng)桿菌W浸染法轉(zhuǎn)化45天盛花期的cesaS雜合突變體植株，果芙成熟后收 集種子，用除草劑抗性篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株，并通過基因鑒定選取基因背景為cesaS純合突 變體的陽性植株，即為轉(zhuǎn)基因植株。W擬南芥cesaS純合突變體作為陰性對照。。
[0025] 5.轉(zhuǎn)基因植株表型觀察
[0026] 擬南芥cesaS純合突變體植株矮小，蓮座葉窄短呈深綠色，果芙崎形短小，幾乎無 種子，纖維素含量較低，并具有嚴(yán)重巧塌的木質(zhì)部結(jié)構(gòu)。通過轉(zhuǎn)蓮基因NnuCESAS入擬南芥 cesaS純合突變體，對相同條件下種植的生長6到7周的轉(zhuǎn)基因植株、野生型植株及cesaS純 合突變體植株的主莖高度、蓮座葉大小及果芙狀態(tài)進(jìn)行比較觀察并記錄。轉(zhuǎn)基因植株長出 了少量比野生型短小但能正常結(jié)種子的果芙，蓮座葉長度比cesaS純合突變體增長了 56%， 并且莖桿高度也增長了 43%。
[0027] 為了觀察木質(zhì)部變化，對轉(zhuǎn)基因植株的主莖橫切片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，在光學(xué)顯 微鏡下觀察，cesaS純合突變體原本巧塌比較嚴(yán)重的木質(zhì)部細(xì)胞在蓮化UCESA8基因的轉(zhuǎn)入 后得到了部分恢復(fù)。
[0028] 用硝酸乙醇法測定擬南芥主莖的纖維素含量，測定結(jié)果證明轉(zhuǎn)基因植株的纖維素 含量比cesaS純合突變體增長了 38.6 %，但尚未恢復(fù)至野生型程度。
[0029] 結(jié)果表明：通過進(jìn)化樹分析和轉(zhuǎn)基因技術(shù)及互補(bǔ)植株表型分析確定蓮基因 化UCESA8具有部分纖維素合酶功能，能參與次生細(xì)胞壁中纖維素的合成。
[0030] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0031] (1)本發(fā)明擴(kuò)增得到蓮基因化UCESA8,得到了含有蓮基因化UCESA8的過表達(dá)載體。
[0032] (2)本發(fā)明得到了蓮基因化UCESA8轉(zhuǎn)擬南芥cesaS純合突變體的陽性轉(zhuǎn)基因植株。
[0033] (3)本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因植株、純合突變體植株與野生型植株對比，發(fā)現(xiàn)該基因能部 分互補(bǔ)擬南芥cesaS純合突變體的表型，具有纖維素合酶的功能，促進(jìn)纖維素的合成，并確 定該基因參與植物次生細(xì)胞壁中纖維素的合成。
【附圖說明】
[0034] 圖1是轉(zhuǎn)錄組測序中15個(gè)NnuCESA基因在不同部位的表達(dá)量;其中，T1，T2，T3分別 是葉片、葉柄外部和葉柄內(nèi)部。
[00巧]圖2是15個(gè)NnuCESA基因的在不同部位的RT-qPCR結(jié)果；其中，T1，T2，T3分別是葉 片、葉柄外部和葉柄內(nèi)部。
[0036] 圖3是表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。
[0037] 圖4是cesaS純合突變體、轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株表型對比圖；其中，圖A中從左 至右分別為cesaS純合突變體，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株；圖B中從下至上=排分別為cesaS 純合突變體，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的蓮座葉片；C圖從下至上=排分別為cesaS純合突 變體，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的果芙。
[0038] 圖5是cesaS純合突變體、轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株莖部橫切切片對比圖；其中，A， B，C分別為cesaS純合突變體，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的莖部橫切面甲苯胺藍(lán)染色圖，箭 頭所指的部位為木質(zhì)部細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0040] 下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件或按照制 造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。
[0041 ] 實(shí)施例1:蓮化UCESA8基因序列的獲得
[0042]先將蓮花葉柄內(nèi)、外和葉片=個(gè)部位做轉(zhuǎn)錄組測序得到各基因片段在不同部位的 表達(dá)量，找出15個(gè)CESA基因片段的表達(dá)量(結(jié)果見圖1 )，并做RT-qPCR驗(yàn)證(結(jié)果見圖2 )，各 基因在不同部位的相對表達(dá)量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果趨勢基本一致，其中一段CESA基因 序列表達(dá)量特別高并且在莖桿內(nèi)部和外部的表達(dá)量均高于葉片部位，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果 設(shè)計(jì)引物W葉柄總CDNA為模板將此基因克隆出來并進(jìn)行測序，對測序結(jié)果行BLAST,發(fā)現(xiàn)該 基因與擬南芥中參與次生細(xì)胞壁纖維素合成的基因AtCESAS相似度極高，因此我們推測該 基因應(yīng)該參與次生細(xì)胞壁中纖維素的合成，并將其命名為化UCESA8,通過序列比對發(fā)現(xiàn)，本 基因序列與蓮基因組網(wǎng)站化ttp://lo化S-化.wbgcas. cn/)中的基因NNU_08388序列相同。
[0043] 實(shí)施例2:蓮葉柄的總RNA的提取
[0044] 用RNA提取試劑盒(OMEGA)分別提取蓮葉柄的總RNA。詳細(xì)步驟參考試劑盒說明書。
[0045] 實(shí)施例3:蓮總CDNA的獲得
[0046] W蓮葉柄總RNA為模板采用OMEGA反轉(zhuǎn)錄試劑盒得蓮總cDNA，詳細(xì)步驟按照試劑盒 使用說明書操作。
[0047] 實(shí)施例4:目的片段的擴(kuò)增
[0048] W蓮基因化UCESA8的mRNA為模板設(shè)計(jì)兩端引物，并在引物兩端加上用于構(gòu)建載體 的Gateway接頭引物。上下游引物分別為：
[0049] PfeuCESAS-F: 5^GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGATGGAGTCCGGGGTCC-3^
[0050] 化 UCESA8-R: S^ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaacaatcaatagaaatgcagc- 3'。
[0051] W蓮葉柄總CDNA為模板，在退火溫度為52°C及延伸溫度為72°C的程序下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后純化并保存。
[0052] 實(shí)施例5:載體構(gòu)建連接
[0053] 采用Gateway雙元載體構(gòu)建方法，將實(shí)施例4中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物與載體質(zhì)粒 PD0NR207 (購買于ABRC，http: //abrc. OSU. edu/)進(jìn)行BP重組反應(yīng)，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化D冊a感受 態(tài)細(xì)胞(市售)并得到陽性菌，擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒測序鑒定。將測序正確的重 組質(zhì)粒與祀arlyGate100 (購買于ABRC，http://abrc. OSU. edu/)(該載體攜帶花挪菜花葉病 毒(CaMV)的35S啟動子，并具有除草劑抗性，可供轉(zhuǎn)基因植物的篩選)進(jìn)行LR重組反應(yīng)，重組 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a并得到陽性菌，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并測序，將測序正確的重組質(zhì) 粒保存?zhèn)溆?。表達(dá)載體構(gòu)建示意圖如圖3所示。測序結(jié)果如SEQ ID NO: 2所示，與基因 化UCESA8 (基因ID為NNU_08388)中序列相同。
[0054] 實(shí)施例6:轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101
[005日]1.將根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101感受態(tài)細(xì)胞（市售）冰上融 化，加入1至化U <300yg)實(shí)施例5中的重組質(zhì)粒，輕彈混勻，冰浴15min。
[0化6] 2.將上述混合物轉(zhuǎn)移至液氮中急凍5min，再37°C熱激5min，迅速轉(zhuǎn)移至冰上5min。
[0化7] 3.加入80化L無抗性的LB液體培養(yǎng)基，28 r，200巧m搖地。
[0化引 4.5000巧m，離屯、Imin，棄70化L上清，其余重懸，取20化L涂布于LB固體培養(yǎng)基(Rif +: 50yg/mL，Gen+: 15iig/mL)，28 °C 倒置培養(yǎng)2天。
[0059] 5.選取陽性菌落并小搖保菌。
[0060] 實(shí)施例7:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染擬南芥
[0061 ] 1.選用抽苔十天后的擬南芥(Arabidopsis thaliana)cesa8雜合突變體植株，保 持較高濕度，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。
[0062] 2.在LB培養(yǎng)基中分別復(fù)蘇上述帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，28°C，220巧m小遙2地。
[0063] 3 . SOOOrpm離屯、15min收集菌體。同時(shí)配制IL重懸液（5% (WzV)Sucrose，0.02~ 0.05%Silwet-77)。
[0064] 4.棄上清，殘留菌液用5%(w/v)薦糖重懸清洗，80(K)rpm，離屯、IOmin收集菌體，此 步驟可再復(fù)一次。
[0(?日]5.用重懸液重懸菌體至0D600位0.8，重懸液轉(zhuǎn)移至15cm培養(yǎng)皿中。
[0066] 6.將待轉(zhuǎn)化擬南芥的花序侵入重懸液中Imin。
[0067] 7 .將已轉(zhuǎn)化植株倒置平放，22°C，相對濕度60~70 %暗培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)為正常培 養(yǎng)，一個(gè)月后收取轉(zhuǎn)化種子。
[0068] 實(shí)施例8:篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株
[0069] 將實(shí)施例7中得到的種子播種，萌芽10天左右噴施除草劑，得到存活植株后通過 DNA鑒定確定目的基因是否轉(zhuǎn)入及植株基因型背景，做好標(biāo)記，轉(zhuǎn)基因后的cesaS純合突變 體可結(jié)少量種子，待果芙成熟后單株收種并保存。
[0070] 實(shí)施例9:擬南芥觀察表型
[0071] 選取生長6~7周的野生型、cesaS純合突變體及轉(zhuǎn)基因植株來觀察對比植株表型 變化，每種類型的植株選取十株W上并用標(biāo)尺來測量其莖桿高度、蓮座葉長度，觀察并拍照 記錄果芙大小。結(jié)果如圖4和表1所示，結(jié)果表明，cesaS純合突變體的崎形果芙較多，幾乎無 種子;轉(zhuǎn)基因植株長出了少量比野生型短小但能正常結(jié)種子的果芙，蓮座葉長度比cesaS純 合突變體增長了56%，并且莖桿高度也增長了43%。
[0072] 表1野生型植株、純合突變體和轉(zhuǎn)基因植株纖維素含量比較結(jié)果 「00791
[0074] 注：數(shù)值代表平均值+標(biāo)準(zhǔn)差(n = 4)，不同的字母代表顯著性差異（P<0.05;T檢 驗(yàn))。
[0075] 實(shí)施例10:擬南芥主莖纖維素含量比較
[0076] 纖維素提取采用硝酸乙醇法。具體步驟為：
[0077] 先將收集的擬南芥主莖粉碎，烘干后經(jīng)苯醇抽提，稱取2g經(jīng)苯醇抽提的試樣，把試 樣置于250mL潔凈干燥的錐形瓶中，加入25mL硝酸乙醇混合液，裝上回流裝置，放在沸水浴 上加熱化。在加熱過程中，應(yīng)隨時(shí)搖蕩錐形瓶，W防止試樣跳動。煮沸化后，移去冷凝管，將 錐形瓶自水浴上取下，靜置片刻。待殘?jiān)练e瓶底后，用傾瀉法濾經(jīng)已恒重的1G2玻璃濾器， 盡量不使試樣流出。用真空累將濾器中的濾液吸干，再用玻璃棒將流入濾器的殘?jiān)迫脲F 形瓶中重復(fù)施行上述步驟數(shù)次，直至纖維變白為止。最后將錐形瓶內(nèi)容物全部移入濾器，用 IOmL硝酸乙醇混合液洗涂殘?jiān)?，再用熱水洗涂，至洗涂液遇甲基澄不呈酸性反?yīng)為止。最后 用乙醇洗涂兩次，吸干洗液，將濾器移入烘箱，于105±2°C烘干至恒重。纖維素含量計(jì)算:纖 維素含量=(ml-m2)/m0(l-w)X100%，式中ml為絕干纖維素與玻璃濾器的質(zhì)量，m2為絕干 空玻璃濾器質(zhì)量，mO為風(fēng)干試樣的質(zhì)量，W為試樣的含水量。纖維素含量的結(jié)果見表1。從表1 中可知，測定結(jié)果證明轉(zhuǎn)基因植株的纖維素含量比cesaS純合突變體增長了 38.6%，但尚未 恢復(fù)至野生型程度。
[0078] 實(shí)施例11:擬南芥莖段橫切片的制作與觀察
[0079] 分別選取生長6~7周的野生型、cesaS純合突變體及轉(zhuǎn)基因植株主莖，在±壤表層 W上3cm取Icm莖段，用3% (w/v)的瓊脂糖包埋莖段，在Leica VT1000S震動切片機(jī)上切片， 厚度40WH，甲苯氨藍(lán)染色1~2min，置于載玻片上于光學(xué)顯微鏡下觀察比較并拍照。結(jié)果如 圖5所示，A，B，C分別為cesaS純合突變體，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的莖部橫切面甲苯胺藍(lán) 染色圖，箭頭所指的部位為木質(zhì)部細(xì)胞，圖A中的木質(zhì)部細(xì)胞巧塌變形比較嚴(yán)重，圖B中的木 質(zhì)部細(xì)胞已得到部分恢復(fù)，但尚有部分崎形塌陷的細(xì)胞存在，未完全恢復(fù)至野生型。
[0080]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 種蓮纖維素合酶基因 NnuCESAS在促進(jìn)纖維素合成中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的蓮纖維素合酶基因 NnuCESAS在促進(jìn) 次生細(xì)胞壁中纖維素合成中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的蓮纖維素合酶基因 NnuCESAS的 氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的蓮纖維素合酶基因 NnuCESAS的 核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。5. -種含蓮纖維素合酶基因 NnuCESA8的過表達(dá)載體。6. -種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于:含有權(quán)利要求5所述的過表達(dá)載體。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于:所述的植物為擬南芥。
【文檔編號】C12N15/84GK105925605SQ201610394181
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】吳藹民, 仝婷婷, 趙先海, 王旭川, 陳曉陽, 鄧小梅
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)